使用数字叶面学和单位面积的叶质量用化石叶重建陆地古气候和古生态学

摘要

提出的协议显示了对化石叶上连续叶片面貌特征的数字测量和分析，以使用数字叶面貌和单位面积的叶质量重建方法重建古气候和古生态学。

摘要

气候和环境强烈影响植物叶子的大小、形状和齿状（面貌）。这些关系，特别是在木本非单子叶被子叶植物中，已被用于开发基于叶子的古气候和古生态学代理，这些代理已被应用于重建地球过去 ~ 1.2 亿年的古老陆地生态系统。此外，鉴于这些关系已在活植物中得到记录，它们对于理解植物进化的各个方面以及植物如何响应气候和环境变化非常重要。为了对现代植物和化石植物进行这些类型的分析，必须使用可重复的方法准确测量叶子的面貌。该协议描述了一种基于计算机的方法，用于测量和分析现代叶和化石叶中的各种叶子面貌变量。该方法允许测量叶片面貌特征，特别是与叶锯齿、叶面积、叶解剖和线性相关的变量，这些变量用于重建古气候的数字叶面貌代理，以及叶柄宽度和叶面积，用于重建单位面积的叶质量，古生态代理。因为这种数字叶性状测量方法可以应用于化石和活植物，所以它不仅限于与重建古气候和古生态学相关的应用。它还可用于探索叶片性状，这可能对理解叶片形态的功能、叶片发育、叶片性状的系统发育关系和植物进化提供信息。

引言

叶子是促进植物与其周围环境之间能量（如光、热）和物质（如二氧化碳、水蒸气）交换的基本生产单位 ^1,2。为了执行这些功能，叶子必须在静止和多风的空气中机械地支撑自身的重量以抵抗重力 ^3,4。由于这些内在的联系，叶子的大小、形状和齿状（面貌学）的几个方面反映了它们的功能和生物力学的细节，并提供了对它们的环境和生态学的见解。以前的工作已经量化了现代世界叶子地貌、气候和生态之间的关系，以建立可应用于化石叶组合的代理 ^5,6。这些替代指标为重建古气候和古生态学提供了重要机会，并有助于更好地理解地球历史上各种系统之间的复杂相互作用。本文详细介绍了使用两个代理所需的方法：1） 阐明古生态学的单位区域叶质量重建方法，以及 2） 重建古气候的数字叶面学。

单位面积的叶干质量 （M_A） 是新植物学和古植物学中经常测量的植物性状。M_A 的主要价值，特别是对于化石重建，是叶经济学谱的一部分，是高度相关的叶性状的协调轴，包括叶子光合速率、叶长和叶营养成分质量⁷。从化石中重建 M_A 的能力为了解这些原本无法接近的代谢和化学过程提供了一个窗口，并最终可以揭示有关植物生态策略和生态系统功能的有用信息。

Royer 等^{人5 开发了}一种方法，根据叶片的面积和叶柄的宽度来估计木本非单子叶（双子叶植物）被子植物化石叶的 M_A。理论上，叶柄充当悬臂，将叶子的重量保持在最佳位置 ^3,4。因此，叶柄的横截面积是光束强度的最重要组成部分，因此，它应该与叶子的质量密切相关。通过将叶柄的形状简化为圆柱形管，叶柄的横截面积可以用叶柄宽度的平方来表示，从而可以从二维化石中估计叶子的质量（有关详细信息，请参见 Royer 等人 ⁵）。叶面积可以直接测量。总之，叶柄宽度的平方除以叶面积（即叶柄公制;表 1）为化石 M_A 提供了一个很好的代理，并允许古植物学家步入现代基于性状的生态学。M_A 重建方法也已扩展到阔叶和叶柄裸子植物 ^5,8、草本被子植物⁸ 和蕨类植物⁹，它们产生的关系与观察到的木本双子叶植物被子植物的关系不同，并且彼此不同。用于在站点水平重建 M_A 的方差和平均值的扩展木本双子叶植物数据集和新的回归方程允许推断叶子经济策略的多样性以及哪些策略最普遍，在化石植物区系中的木本双子叶植物被子植物中最普遍¹⁰。

一个多世纪以来，人们已经注意到了相貌叶性状与其气候之间的关系^11,12。具体来说，木本双子叶植物被子植物叶子的面貌与温度和湿度密切相关¹³。这种关系构成了陆地古气候的许多单变量^{14、15、16、17} 和多变量^{6、18、19、20、21、22} 叶地貌代理的基础。单变量和多变量叶片地貌古气候方法已广泛应用于地球历史的最后 ~1.2 亿年（白垩纪到现代）各大洲以被子植物为主的化石植物区系²³。

叶片地貌古气候代理中使用的两个基本观察结果是 1） 叶大小与年平均降水量 （MAP） 之间的关系，以及 2） 叶齿（即叶缘的向外投影）与年平均温度 （MAT） 之间的关系。具体来说，一个地方所有木本双子叶植物物种的平均叶子大小与 MAP 呈正相关，除了齿的大小和齿数外，一个地方的木本双子叶植物物种的比例与 MAT^{6、12、13、14、15、16、24} 呈负相关。

这些叶子地貌-气候关系之间的功能联系得到了理论和观察的有力支持^1,2,25。例如，尽管较大的叶子提供更大的光合表面积，但它们需要更大的支撑，通过蒸腾作用损失更多的水，并且由于边界层更厚而保留了更多的显热 ^1,26,27。因此，较大的叶子在更潮湿、更热的环境中更常见，因为通过增加蒸腾作用流失的水可以有效地冷却叶子并且问题较小。相比之下，在干燥炎热的气候中，较小的叶子通过增加显热损失来减少水分流失并避免过热^28,29。哪些因素或因素组合对解释功能联系最有贡献的细节对于其他叶片性状来说仍然是个谜。例如，已经提出了几个假说来解释叶齿-MAT 关系，包括叶冷却、高效的芽包装、加强对薄叶的支持和供应、通过水腈的内脏以及提高早期生产力 30,31,32,33。

大多数叶片地貌古气候代理依赖于叶片性状的分类划分，而不是连续变量的定量测量，这导致了几个潜在的缺点。分类方法排除了通过与气候密切相关的连续测量捕获的更详细的信息（例如，齿数、叶片线性度）所捕获的更详细信息，这可能会降低古气候估计的准确性 ^6,20,34。此外，在一些叶子性状评分方法中，被分类评分的性状可能是模棱两可的，从而导致可重复性问题，并且一些性状的实证有限，无法支持它们与气候 ^{6,15,16,35,36} 的功能联系。

为了解决这些缺点，Huff 等人²⁰ 提出了一种称为数字叶面学 （DiLP） 的方法，以数字测量连续叶性状。与以前的方法相比，DiLP 的一个关键优势是它依赖于以下性状：1） 可以在用户之间进行可靠测量，2） 本质上是连续的，3） 在功能上与气候相关，以及 4） 在生长季节之间显示表型可塑性 ^6,37。这导致了比以前的叶子地貌古气候方法更准确的 MAT 和 MAP^{估计 6}。此外，该方法通过提供解释受损和不完整的叶子的步骤来适应化石记录的不完美性质。DiLP 方法已成功应用于来自多个大陆的一系列化石植物区系，跨越了大范围的地质时间^{6、38、39、40、41、42}。

以下协议是早期工作 ^5,6,20,34 中描述的协议的扩展。它将解释使用 DiLP 和 M_A 重建方法从木本双子叶叶植物被子植物化石叶中重建古气候和古生态学的必要程序（有关通过使用本协议测量和计算的变量的解释，请参见表 1）。此外，该协议提供了记录和计算叶性状的步骤，这些性状不包括在 DiLP 或 M_A 分析中，但易于实施并提供有用的叶面貌特征（表 1）。该协议遵循以下格式：1） 对化石叶进行成像;2） 叶子数字制备，分为五种可能的制备场景;3） 叶子数字测量，分为相同的五种可能的准备场景;4） DiLP 和 M_A 分析，使用 R 包 dilp¹⁰。

M_A 重建协议嵌入在 DiLP 协议中，因为两者都便于准备和相互测量。如果用户只对 M_A 分析感兴趣，他们应该遵循 DiLP 准备场景 2 中描述的准备步骤，无论叶缘是否是齿状的，以及仅描述叶柄宽度、叶柄面积和叶面积测量的测量步骤。然后，用户可以在执行 M_A 重建的 dilp R 包中运行相应的函数。

研究方案

1. 化石叶成像

1. 将叶子化石放在相机下方，并确保它尽可能平躺，例如，使用沙箱或腻子将化石楔入化石下方。
   注意：当在一个块上拍摄多个标本时，最好将它们分别作为特写镜头拍摄，以确保化石的细节清晰锐利。将化石放在纯色深色哑光背景上也很有用，例如黑色毛毡或天鹅绒。
2. 将比例尺水平放置在与叶子相同的垂直平面上，将其放置在靠近化石的位置，但不覆盖化石的任何部分。如果化石周围几乎没有或没有基质，则应将刻度放在相框内并聚焦。
3. 使用相机三脚架或复制架，将相机直接放置在化石叶上方，镜头与岩石表面平行。为确保清晰地捕捉到叶子的细节，请将相机放置在尽可能靠近化石的位置，同时保持在镜头/相机的焦距内，并确保整个化石都在照片的框架内。
   注意：如果可能，最好使用高分辨率数码相机和具有手动对焦和足够景深的宏镜头，以清晰地聚焦在将要处理的叶子上。
4. 使用间接光，根据需要对化石进行照明，以清楚地看到标本的整个轮廓。通常需要重新调整每个化石的照明。
5. 拍摄化石叶并适当地标记图像文件。

2. 数字化准备

注意： 图 1 提供了这些协议中使用的叶架构术语的图示。使用决策树（图 2）和提供的示例（图 3）来确定哪种准备方案适用于要测量的化石叶，然后继续该适当的部分。有关准备步骤中的其他注意事项，请参阅 表 2 。如果叶子属于情况 1 或 5，则无法为定量叶面貌测量准备叶子。

1. 情景 2：整个有缘叶，其面积或一半面积被保留或可以重建。
   1. 在图像处理软件（例如 Adobe Photoshop 或 GIMP）中打开文件。如有必要，裁剪图像，这有助于减小最终文件大小，但可确保仍包含比例尺。
   2. 通过单击 图像>画布 （Photoshop） 将工作区域的宽度加倍;图像 > 画布大小 （GIMP）。建议在当前画布的右侧或左侧添加新画布。
   3. 如果叶缘需要一些重建，请决定是否可以从半叶或整叶更可靠地测量叶面积和形状（图 3）。
   4. 将叶子从岩石基质中复制出来。使用套索工具描摹整片或半片叶子，包括叶柄（如果有）（见 表 2）。复制并粘贴所选内容，并将其放置在画布的开放区域中。请考虑粘贴此选择的两个副本，一个是未经编辑的副本，如果需要重新开始准备过程，可以返回该副本。
   5. 使用适当颜色的线条修复页边空白处的任何损坏部分（如果在白色背景上，则通常为黑色）。绘制一条跨越受损边距的线条，以便可靠地重建边距，例如，使用画笔或线条工具。确保线足够粗以便看到（~1-2 pt 重量），并且它连接了受损区域的边缘。
   6. 使用套索工具从叶子上去除叶柄（如果有）。
      1. 从视觉上看，沿着基部沿着叶缘，直到它与叶柄接触的点，叶柄通常颜色较深，不包含明显的叶脉。在那里放置一个套索点。对叶子的另一半做同样的事情，把第二个点放在那儿。
         注意：如果叶基对称，则线将 ~ 垂直于叶柄;如果它是不对称的，则线条将呈一定角度。
      2. 圈出整个叶柄以完成选区。剪切和粘贴，或使用移动工具，将叶柄放在叶片旁边，但不要触摸它。
         注意：对于花序或裂片叶基，这意味着基部延伸到叶柄与叶片相连的位置下方，叶柄有可能位于叶柄与叶片相连处下方的叶基上。注意将叶柄切掉它实际附着的地方，密切描摹叶柄边缘，并修复由此产生的受损边缘。众所周知，这在大多数化石中可能很难看到。
   7. 如有必要，裁剪图像的最终区域以减小文件大小。参见图 3 ，了解已完成的准备好的映像应如何显示的示例。
2. 情况 3：一片齿状叶子，其面积或一半面积无法重建，但有≥两个连续的齿，并且保留了 ≥25% 的叶子
   注意：牙齿测量是该类别叶子上唯一可以测量的性状，因此叶子只为这些测量而准备。
   1. 在图像处理软件（例如 Adobe Photoshop 或 GIMP）中打开文件。如有必要，裁剪图像，这有助于减小最终文件大小，但确保仍包含比例尺。
   2. 通过单击 “图像>画布 ”（Photoshop） 将工作区域的宽度增加四倍 （Photoshop）; 图像 > 画布大小 （GIMP）。建议在当前画布的右侧或左侧添加新画布。
   3. 将叶子从岩石基质中复制出来。使用套索工具追踪保存的叶子的范围，包括叶柄（如果有）。不必担心精确地追踪边缘的损坏部分，因为它们将被删除。复制并粘贴所选内容，并将其放置在画布的开放区域中。请考虑粘贴此选择的两个副本，一个是未编辑的版本，如果需要重新开始准备过程，可以返回到该副本。
   4. 如果存在，请使用套索工具从叶子上去除叶柄。
      1. 从视觉上看，沿着基部沿着叶缘，直到它与叶柄接触的点，叶柄通常颜色较深，不包含明显的叶脉。在那里放置一个套索点。对叶子的另一半做同样的事情，把第二个点放在那儿。
         注意：如果叶基对称，则线将 ~ 垂直于叶柄，如果不对称，则线将呈一定角度。
      2. 圈出整个叶柄以完成选区。剪切和粘贴，或使用移动工具，将叶柄放在叶片旁边，但不要触摸它。
         注意：对于花序或裂片叶基，这意味着基部延伸到叶柄与叶片相连的位置下方，叶柄有可能位于叶柄与叶片相连处下方的叶基上。注意将叶柄切掉它实际附着的地方，密切描摹叶柄边缘，并修复由此产生的受损边缘。这在大多数化石中可能很难看到。
   5. 使用套索工具去除与边缘受损部分相邻的区域。
      1. 从沿边缘边界受损部分的点开始选择，并从该点到垂直于该主要静脉的大静脉画一条直线（图 4）。从最靠近损伤的保留乳牙窦开始选择。这确保了在后续测量中，齿面不被包括在内周长内，并且副齿不会像测量乳牙一样被测量。如果牙齿间隔很远，这可能不合适，因为太多保留的边缘最终可能会被去除（图 4）。
      2. 沿着大脉进行选择，直到与受损边缘的另一个边界齐平，并画一条垂直于主要静脉到边缘的直线（图 4）。
         注意：对于羽状叶（图 1A），有和没有农叶脉（参见 Ellis 等人 ⁴³），主要脉是初级脉（即中脉）。对于掌状叶脉（图 1B、D），主脉是最近的主脉（例如， 图 4B）。对于羽状裂片（图 1C），如果损伤位于羽状叶上，则主要静脉是供血叶的静脉（通常是次级静脉）。
      3. 完成选择并删除叶的此部分。对叶子的所有受损部分重复此操作。
   6. 复制并粘贴这个准备好的叶子，并将其放置在画布的开放区域中。
   7. 使用套索工具拔除牙齿。
      1. 从叶尖开始，叶顶端之一，或叶片的最顶端齿，然后沿着该叶、叶或碎片在每个乳牙窦处进行选择（图5;有关如何区分主牙和副牙以及如何区分牙齿和裂片的提示，请参见 补充图 1、补充图 2 ）。剪牙时一定要遵循适当的规则（表 2;补充图 3）。
         注意：乳牙通常会在基部和根尖处变小。
      2. 选择最基牙的根尖窦后，应用扩展规则（表2;补充图 4）将序列的最后一颗齿切掉。
      3. 通过将叶片旁边的牙齿剪下来并粘贴来去除牙齿，并在不接触的情况下去除牙齿。如果制剂有额外的叶裂或碎片需要拔除牙齿，请重复上述步骤，直到所有牙齿都拔除。
   8. 如果创建了原始剪切叶的附加版本，请删除该附加版本。如有必要，裁剪图像的最终区域以减小文件大小。参见图 3 ，了解已完成的准备好的映像应如何显示的示例。
3. 情况 4：其面积或叶面积被保留或可以重建的齿状叶
   1. 在图像处理软件（例如 Adobe Photoshop 或 GIMP）中打开文件。如有必要，裁剪图像，这有助于减小最终文件大小，但确保仍包含比例尺。
   2. 通过单击 “图像>画布 ”（Photoshop） 将工作区域的宽度增加四倍 （Photoshop）; 图像 > 画布大小 （GIMP）。建议在当前画布的右侧或左侧添加新画布。
   3. 决定如何准备叶子。需要在整片叶子或半叶子上进行叶面积/形状测量，决定哪个选项会导致更准确的测量。应沿着保留的边缘的所有切片进行牙齿测量。在某些情况下，叶面积/形状测量可能发生在叶子的不同子集上，而不是测量齿变量的子集上。
      注意：在提供的示例（图 6）中，决定半叶比整叶更可靠地重建。右下角的保留边缘（>1 颗保留牙齿）包括在牙齿测量中。场景 4 的以下协议大致遵循提供的示例（图 6），但在不同的准备上下文中，细节可能略有不同。
   4. 将叶子从岩石基质中复制出来，确保包括所有保留的边距。
      1. 使用套索工具描摹叶子的边缘，包括叶柄（如果有）。不要追踪边缘的受损部分，这些部分不会包含在面积/形状测量中，因为它们将被删除（例如， 图 6 中叶子的右半部分）。
      2. 复制并粘贴所选内容，并将其放置在画布的开放区域中。请考虑粘贴此选择的两个副本，一个是未编辑的副本，如果需要重新开始准备过程，可以返回到该副本。
   5. 如果存在，请使用套索工具从叶子上去除叶柄。
      1. 从视觉上看，沿着基部沿着叶缘，直到它与叶柄接触的点，叶柄通常颜色较深，不包含明显的叶脉。在那里放置一个套索点。对叶子的另一半做同样的事情，把第二个点放在那儿。
         注意：如果叶基对称，则线将 ~ 垂直于叶柄;如果它是不对称的，则线条将呈一定角度。圈出整个叶柄以完成选区。
      2. 剪切和粘贴，或使用移动工具，将叶柄放在叶子旁边，但不要触摸它。
         注意：对于花序或裂片叶基，这意味着基部延伸到叶柄与叶片相连的位置下方，叶柄有可能位于叶柄与叶片相连处下方的叶基上。注意将叶柄切掉它附着的地方，密切描摹叶柄边缘，并修复由此产生的受损边缘（补充图 5）。这在大多数化石中可能很难看到。
   6. 复制并粘贴去除叶柄的孤立叶子，以创建第二个副本以准备牙齿测量，并将其放置在画布的开放区域。
   7. 准备一个版本的叶子，用于叶子面积和形状测量。
      1. 如果准备半叶，请使用套索工具修剪掉多余的叶材料，这样就只剩下完整的半叶。如果准备完整的叶子，请不要去除任何叶子材料。
      2. 如有必要，使用线条或画笔工具（通常是白色背景的黑线），使用适当颜色的线条修复沿边距的任何损坏区域。确保线足够粗以便看到（~1-2 pt 重量），并且它连接了受损区域的边缘。
   8. 准备用于牙齿测量的叶子版本。
      1. 使用套索工具去除与边缘受损部分相邻的区域。
         1. 从沿边缘的受损伤部分的点开始选择，并从该点到垂直于该主要静脉的大静脉画一条直线（图 4）。从最靠近损伤的保留乳牙窦开始选择。这确保了在后续测量中，齿面不被包括在内周长内，并且副齿不会像测量乳牙一样被测量。如果牙齿间隔很远，这可能不合适，因为太多保留的边缘最终可能会被去除（图 4）。
         2. 沿着大静脉进行选择，直到与受损边缘的另一个边界齐平，然后画一条垂直于主要静脉到边缘的直线（图 4）。
            注：对于羽状叶（图 1A），有和没有农叶脉（定义和示例见 Ellis 等人 ⁴³ ），主要脉是主脉（即中脉）。对于掌状叶脉（图 1B、D），主脉是最近的主脉（例如， 图 4B）。对于羽状裂片（图 1C），如果损伤位于羽状叶上，则主要静脉是供血叶的静脉（通常是次级静脉）。
         3. 删除叶子的损坏部分。对叶子的所有受损部分执行相同的操作。
   9. 复制并粘贴为牙齿测量准备的版本，去除损坏的部分，然后放置在画布的开放区域。
   10. 使用套索工具拔除牙齿。
       1. 从叶尖、叶顶端之一或叶片的最顶端齿开始，然后沿着叶、叶或碎片在每个乳牙窦处进行选择（图 5;有关如何区分主齿和副齿以及如何区分齿和裂片的提示，请参见 补充图 2 ）。剪牙时一定要遵循适当的规则（表 2;补充图 2）。
          注意：乳牙通常会在基部和根尖处变小。
       2. 选择最基牙的根尖窦后，应用扩展规则（表2;补充图 4）将序列的最后一颗齿切掉。
       3. 通过将叶片旁边的牙齿剪下来并粘贴来去除牙齿，并在不接触的情况下去除牙齿。如果制剂有额外的叶裂或碎片需要拔除牙齿，请重复上述步骤，直到所有牙齿都拔除。
   11. 如果创建了原始剪切叶的附加版本，请删除该附加版本。如有必要，裁剪图像的最终区域以减小文件大小。参见图 3 ，了解已完成的准备好的映像应如何显示的示例。

3. 数字测量

注意：数据输入模板电子表格作为 补充文件 1 提供。有关测量步骤中的其他注意事项，请参阅 表 3 。在场景 1 和 5 中，唯一需要的步骤是在数据输入电子表格中记录叶边距状态（步骤 3.5）。

1. 打开 ImageJ 软件⁴⁴。设置将自动进行哪些测量（在安装程序后执行此操作一次）。
2. 单击 Analyze > Set Measurements，然后仅选择 Area、Perimeter 和 Feret 的直径。确保小数位设置为 3。
3. 通过单击 “文件”>“打开 ”或简单地将图像拖放到已打开的 ImageJ 工具栏中，打开准备好的化石叶图像。
4. 设置每个新叶图像的比例。
   注意：这是一个关键步骤，必须对每个新的叶图像进行此操作，以确保准确测量。
   1. 点击 直线 工具。放大比例尺并在比例尺上绘制尽可能长的直线。
   2. 单击 Analyze > Set Scale （设置比例）。在已知距离中，输入以厘米为单位测量的长度（与现代校准数据集中使用的单位一致）。没有必要更改长度的单位。单击 OK。
5. 在数据输入电子表格中将叶标记为带齿 （0） 或整个 （1）。
6. 如果存在叶柄，则测量叶柄宽度。应该对仍在岩石基质中的叶子的原始副本进行测量，因为它提供了更好的背景。
   注意：如果叶柄不存在，在某些情况下，可以测量其基部位置的中脉宽度，而不是叶柄。然而，只有在保留了中脉的整个宽度（即，叶脉顶部没有压缩的叶片或化石保留了叶子的背面）并且来自同一物种或形态型的其他标本表明基脉宽度相当于叶柄宽度的情况下，才应该这样做。
   1. 在叶柄与叶片相交的地方画一条垂直于叶柄的直线，或者如果插入点不对称，则在最基部的插入点画一条垂直于叶柄的线。仔细划定这条线很重要。因此，建议放大叶子的这个区域，以便更容易精确地画线。
      注意：在某些特殊情况下，需要修改此步骤，包括在插入的最基部点存在损伤、毛状体、花蜜、刺或其他无法准确测量叶柄宽度的特征。在这些情况下，在可以可靠地进行测量的特征下方的第一个点测量叶柄宽度。
   2. 单击 Analyze > Measure，或使用快捷键测量绘制的线条的长度。在图像上绘制相同的线条，以通过单击 Edit > Draw 或使用快捷方式创建准确测量位置的记录。如有必要，使用主工具栏上的工具 （颜色选取器） 更改线条的颜色。
   3. 绘制线条后，保存图像，最好在修改后的文件名下保存。
   4. 在数据输入电子表格中，在 petiole width 下记录此行的长度。
7. 通过将图像设为黑色和白色来准备叶子以进行其他测量。为此，请单击 图像 > 类型 > 8 位。
8. 通过单击图像>调整阈值>阈值或使用快捷方式对图像进行阈值设置。标题为 Threshold 的框将打开，并将图像的一部分更改为红色。如果叶子是浅色的，而背景是深色的，请单击 Dark Background。
9. 使用滑块调整阈值，直到叶子的内部为红色且与背景不同。这是一个关键步骤，很容易产生不精确的数据。通过放大边距的某些部分，确保红色区域与叶子完全对应（即，叶子的所有周边都是红色的，仅此而已）。叶子内部的红色间隙是可以接受的，不会影响测量。
   注意：如果叶子的轮廓没有明确定义，请首先尝试在放大时调整阈值，以确认叶子的轮廓是红色的。如果化石和背景之间的对比度不佳，无法应用可靠的阈值，请使用画笔工具在对比度太差的区域向叶子周边添加纯色轮廓。或者，将叶子返回到图像处理软件（例如，Adobe Photoshop 或 GIMP）并调整孤立叶子图层的对比度或背景的颜色以更好地区分它们。
10. 测量在场景 2（步骤 2.1）和 4（步骤 2.4）中准备的叶子的叶面积和形状。
    注意：使用 图 2 和 图 6B 作为指南，了解在准备好的图像的哪些组件上测量哪些变量。如果在方案 3（步骤 2.2）中准备了叶子，请跳过此步骤并继续执行步骤 3.11。
    1. 测量为叶面积和形状测量准备的叶子，其中应仅去除其叶柄（如果存在叶柄）。选择 Wand 工具。单击叶子的内部。整个叶子的轮廓应为黄色 - 确认轮廓正确。
    2. 通过单击 Analyze > Measure 或使用快捷方式进行测量。
    3. 如果测量的面积准备为整片叶子，则在数据输入电子表格中记录 area、perimeter、Feret 和 minimum Feret。如果测量的面积准备为半叶，则仅记录 Feret 并继续下一步。
    4. 如果测量的面积是半片叶子，则测量叶子的人工中间周长，这是将叶子切成两半所产生的人工周长的长度（图 6B）。如果测量的面积是整片叶子，请跳过此步骤和步骤 3.10.5。
       注意：测量人工中间周长允许从半叶计算叶片周长（参见下面的步骤 3.10.5）。叶片周长不用于 DiLP 和 M_A 分析中包含的变量，但用于对面相学表征有用的其他变量（例如，形状因子、紧凑度; 表 1）。
       1. 右键单击 Line 工具，选择分割线工具。跟踪人工中间周长的整个长度。
       2. 单击 Analyze > Measure 或使用快捷键测量长度。此测量值将用于公式中，以计算下面的叶片周长（步骤 3.10.5）。
    5. 如果测量的面积是半叶，请在数据输入电子表格中输入测量值时修改测量值，方法是将面积乘以 2，将最小 Feret 乘以 2，然后计算叶片周长，方法是先从半叶周长中减去人工中间周长，然后使用以下公式乘以 2：
       刀片周长 = （周长 - 人工中间周长） x 2
    6. 如果存在切开的叶柄，请测量其面积。如果不存在，则场景 2 的测量完成，但继续执行场景 4 的步骤 3.11。
       1. 用魔杖工具单击切出的叶柄。叶柄应以黄色勾勒。通过单击 Analyze > Measure 或使用快捷方式进行测量。数据输入电子表格中叶柄区域下的记录区域。
    7. 对于场景 2（步骤 2.1），测量现已完成;对于方案 4（步骤 2.3），请继续执行下一步。
11. 测量场景 3（步骤 2.2）和 4（步骤 2.3）中准备的叶子的齿变量。
    1. 测量原始刀片。使用魔杖工具，选择原始刀片的内部（即，为牙齿测量准备的叶子，仍然有齿; 图 6B）。它应该用黄色轮廓。通过单击 Analyze > Measure 或使用快捷方式进行测量。
       注意：根据叶子的制备方式，可能需要测量几个分离的部分，将它们的区域相加在一起（例如， 图 6B）。或者，您可以通过在按住 Shift 键的同时使用魔棒工具选择第二个部分，一次选择多个部分。
    2. 在数据输入电子表格中记录原始刀片区域和原始刀片周长下的面积和周长。
    3. 测量内部原始刀片。选择内部生刀片的内部（即，为牙齿测量准备的叶子，已经去除了牙齿; 图 6B）。它应该用黄色轮廓。通过单击 Analyze > Measure 或使用快捷方式进行测量。
       注意：根据叶子的制备方式，可能需要测量几个分离的部分，将它们的区域相加在一起（例如， 图 6B）。或者，您可以通过在按住 Shift 键的同时使用魔棒工具选择第二个部分，一次选择多个部分。
    4. 在数据输入电子表格中，在内部原始刀片区域和内部原始刀片周长下记录区域和周长。
    5. 测量切割周长。删除阈值以清楚地看到叶子，单击阈值框中的 “重置 ”或单击 “编辑”>“撤消”，后者通常也会删除黑白 8 位转换。选择分段线工具，并在毛坯刀片上描摹切割周长的全长。
    6. 通过单击 Analyze > Measure 或使用快捷方式进行测量。如果有多个部分，请重复上述步骤以测量每个部分的切割周长。在数据输入电子表格的 length of cut perimeter 下记录长度或长度总和。
       注意：切割周长是通过去除损坏来准备叶子来引入的。在大多数情况下，这与人工中间边界不同（图 6B）。
    7. 计算主牙和副牙（如果有）。
       注意：有关如何区分乳牙和副牙的提示，请参见 补充图 2 。
       1. 如果尚未删除阈值，请立即将其删除。要删除阈值，请单击阈值框中的 “重置 ”或单击 “编辑”>“撤消”，后者通常也会删除黑白 8 位转换。
       2. 计算乳牙的数量（有关如何区分乳牙和副牙的提示，请参见 补充图 2 ）。选择 Multi-Point Tool。可能需要先右键单击 Point Tool ，以选择 Multi-Point Tool。单击每颗乳牙对其进行编号。
       3. 要删除错误选择的点，请按 Alt 键 （Windows OS） 或 Command/cmd 或 Option 键 （Mac OS），同时单击该点。在数据输入电子表格的 # of primary teeth 下记录最终数字。
       4. 通过单击 “编辑>选择”>“全不选 ”或使用键盘快捷键来清除多点工具计数和批注。
       5. 计算牙齿的总数（即，叶子上存在的所有主牙和副牙）。选择 Multi-Point Tool。可能需要先右键单击 Point Tool ，以选择 Multi-Point Tool。单击每个齿（包括主齿和副齿）对其进行编号。
          注意：计算牙齿总数，而不是子牙的数量，可以确保没有牙齿被重复计算。将牙齿总数减去主牙的数量，以确定辅助牙齿的数量（参见步骤 3.11.7.6）。
       6. 要删除错误选择的点，请按 Alt 键 （Windows OS） 或 Command/cmd 或 Option 键 （Mac OS），同时单击该点。从总齿数中减去主齿数，即可确定子齿数。将此记录在数据输入电子表格的 # of subsidiary teeth 下。
          注意：一些用户更喜欢在准备叶子图像时进行牙齿计数，而不是在测量时进行计数。

4. 在 R 软件中运行分析

注意：以下步骤需要 R 包 dilp¹¹。数据输入电子表格将读入 R 并由包使用。请参阅数据输入电子表格（补充文件 2）中的 Additional Instructions 选项卡。R 脚本可以同时容纳多个站点或单个站点的分析。

1. 使用首选环境打开 R（建议使用 R Studio）。有关 R 的介绍，请参阅 https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.pdf 等。
2. 在 R 会话中安装 dilp 包。 有关如何安装软件包并运行其关联功能的更多信息，请参阅以下 Web 站点：https://cran.r-project.org/package=dilp
3. 读取包含化石木本双子叶植物被子植物叶性状数据（即，数据输入电子表格中记录的数据）的.csv文件。
4. 运行函数 dilp（） 对具有相关误差的平均年温度 （MAT） 和平均年降水量 （MAP） 重建。MAT 和 MAP 的结果来自多元线性回归模型 （MLR;即 DiLP）和两个单线性回归模型（SLR;即叶面积和边缘分析）。运行函数 lma（） 在形态型和位点级别进行单位面积叶质量_（MA） 重建。
5. 运行 dilp（） 后， 建议检查潜在的数据收集问题，并通过查看返回的 dilp（） 结果中的异常值和错误对象来确认数据质量。或者，使用函数 dilp_processing（）， 后跟 dilp_outliers（） 和 dilp_errors（）。通过参考准备好的标本并可能重新测量它来解决任何标记的问题。建议编辑原始数据文件，然后重新读回 R。
6. 使用函数 dilp_cca（） 确定化石地点是否属于校准数据集的叶面貌多元空间。

结果

先前发布的不列颠哥伦比亚省中南部始新世早期 McAbee 化石遗址的叶片面貌测量数据集用于提供使用数字叶片面貌 （DiLP） 和单位面积叶质量_（MA） 重建方法的代表性结果示例（Lowe 等人³⁸;数据在补充文件 2 中提供).该遗址为在新生代（早始新世气候最佳时期）最温暖时期的高地和火山景观中重建古气候和古生态学提供了机会 38,45,46,47。化石组合是从湖相序列中的两个独立层位中取样的，命名为 H1（28 厘米厚）和 H2（27 厘米厚），使用普查技术在狭窄的地层范围内汇集，从而收集或计数所有能够被分配形态型的标本^38,48。

McAbee 叶面相数据通过了 dilp_errors（） 标记的错误检查，并仔细检查了 dilp_outliers（） 标记的 7 个异常值，以确保这些值代表数据的真实变化，而不是方法错误。随后通过 dilp（） 函数运行数据以生成古气候，并通过 lma（） 函数进行单位面积叶质量重建。

M_A 重建及其 95% 预测区间的下限和上限在表 4 中报告了物种和地点水平，使用 Royer 等人 ⁵ 和 Butrim 等人 ¹⁰ 中提出的方程。重建值在现代陆地物种的典型 M_A 范围内 （30-330 g/m²）⁴⁹。使用 Royer 等人 ⁵ 中讨论的阈值，大多数物种都有重建的 M_A，它与 <1 年 （≤87 g/m²） 的叶片寿命一致，一些 ~1 年 （88-128 g/m²），而没有一个是典型的 >1 年 （≥129 g/m²）。站点 M_A 平均值的重建和 McAbee 的方差反映了站点^10,50 叶片经济策略的普遍性和多样性。H1 和 H2 之间的位点均值和方差之间没有显著差异，因此，没有证据表明叶经济策略的组成和多样性在两个时间点之间有所不同。此外，使用 Royer 等人 ⁵ 和 Butrim 等人 ¹⁰ 的方程进行的位点平均重建非常相似。

表 5 显示了使用 Peppe 等人 6 中提出的多元线性回归 （DiLP） 和单线性回归（叶缘和叶面积分析）方程重建平均年温度 （MAT） 和平均年降水量 （MAP）。如果化石叶组合的叶子地貌发生在校准数据集的地貌空间内，则可以最可靠地推断出古气候估计。这是通过函数 dilp_cca（） 执行的规范对应分析 （CCA） 分析步骤来评估的。McAbee H1 和 H 2 都属于校准数据集中观察到的叶面貌范围（图 7A）。如果站点的重建值超出校准空间，则应谨慎解释古气候重建（例如，通过与独立证据线的比较;进一步讨论见 Peppe 等人 ⁶）。H1 和 H2 的重建 MAT 和 MAP 与温带季节性生物群落一致（图 7B、C），这与独立证据线非常吻合，包括基于 McAbee⁴⁵ 化石花卉和昆虫群落的最近现存亲属的推断。

图 1：本文中的叶子面貌和结构术语。 （A） 羽状脉、无裂片和全边缘的叶子，（B） 有掌状脉、无裂片和齿状的叶子，（C） 羽状脉、裂片和全边缘的叶子，（D） 有掌状脉、裂片和齿状的叶子。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：该方法的流程图。 一个流程图，展示了不同的叶子保存条件和叶子类型如何决定哪些一般类型的叶子性状可以可靠地测量（黄框）。这决定了方案中将遵循哪些准备方案，以及将在数据输入电子表格中输入哪些列数据（要点）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：不同的准备场景。 不同的准备场景，展示了为测量阶段准备的已完成数字准备图像的示例。（A） 情景 1，面积或半面积无法重建的整个边缘叶，（B） 情景 5，面积或半面积无法重建且没有 ≥2 个连续齿和/或保留 ≥25% 的叶子，（C） 情景 2，面积或半面积保留或可以重建的整个边缘叶， （D） 情景 3，其面积或一半面积无法重建但具有 ≥2 个连续齿和 ≥25% 的叶子保留的齿状叶，（E） 情景 4，其面积或一半面积被保留或可以重建的齿状叶。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：损伤去除图示。 说明如何剪掉受损的 margin 以及与该受损 margin 相邻的叶区域。红色虚线表示如何使用套索工具进行选区。请注意，损伤范围是故意从乳牙的鼻窦开始的（参见 补充图 2 以帮助区分乳牙和辅助牙）。（A） 羽状叶脉，其选择延伸到中脉。（B） 掌状脉状叶子，其选择延伸到最近的初级叶脉。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：说明如何切割牙齿的示例。 （A） 红色虚线展示了如何使用套索工具进行选区。请注意，在这种情况下，牙齿是复合的，因此仅在主鼻窦之间进行选择（参见 补充图 2 以帮助区分主牙和子牙），（B） 如何选择牙齿的放大视角，红点代表选择过程中点击鼠标的位置，（C） 拔牙时叶子的副本。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6：准备场景 4 的插图。 在场景 4 中准备的示例叶的准备决策和测量步骤的图示。（A） 一个准备场景，其中决定半叶提供最可靠的叶形和面积测量，并且包括内侧两半保留的边缘用于牙齿测量。（B） 一个示例，展示了在准备好的叶子的各种成分上测量了哪些变量。粗体文本突出显示了 DiLP 和 M_A 分析所需的测量值，而非粗体文本（叶片周长、最小 Feret 和人工中间周长）突出显示了不需要但对其他地貌特征有用的测量值（例如，形状因子和紧凑度; 表 1）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7：代表性结果。 Lowe 等人在始新世早期 McAbee 化石床采样的两个化石层（H1 和 H2）的结果³⁸。（A） 典型对应分析，显示校准数据集中多变量叶面貌的表示。校准数据来自 Peppe 等人 ⁶。两个 McAbee 层位的叶面貌是重叠的，并发生在校准空间内。（B 和 C） 温度和降水估计值及其相关的不确定性（模型的标准误差），使用 Peppe 等人 ⁶ 中提出的两个 McAbee 层位叠加在 Whittaker 生物群落图上的方程。（B） 使用数字叶面学 （DiLP） 多元线性回归模型 （MLR） 重建的估计值，（C） 使用叶面积分析 （LAA） 和叶缘分析 （LMA） 单线性回归 （SLR） 方程重建的两个 McAbee 层位叠加在 Whittaker 生物群落图上。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：叶子面貌变量。 使用此协议在预测模型中测量和/或计算和应用的变量，以重建单位面积的叶片干质量_（MA）、平均年温度 （MAT） 和平均年降水量 （MAP）。MAT 和 MAP 使用 Peppe 等人 6 中提出的方程重建^{，使用数字} 叶面学 （DiLP） 的多变量方法和叶缘分析 （LMA） 和叶面积分析 （LAA） 的单变量方法。列为“其他”的变量不_{用于 MA、}DiLP、LMA 和 LAA 分析，但仍使用该协议进行测量和计算，因为它们易于实施并提供有用的叶片面貌特征。 请点击此处下载此表格。

表 2： 准备步骤的其他注意事项和说明。 请点击此处下载此表格。

表 3： 测量步骤的其他注意事项和说明。 请点击此处下载此表格。

表 4： Lowe 等人对 McAbee 化石床单位面积的叶干质量_（MA） 和相关 95% 预测区间的相关上下限的重建³⁸。对形态型平均值⁵、位点平均值^5、10 和位点方差¹⁰ 进行重建。 请点击此处下载此表格。

表 5：使用数字叶面学 （DiLP） 的多元线性回归 （MLR） 和 Peppe 等人提出的叶缘分析 （LMA） 和叶面积分析 （LAA） 的单一线性回归 （SLR） 重建始新世早期 McAbee 化石床的年平均温度 （MAT） 和平均年降水量 （MAP^{） 6。}请点击此处下载此表格。

补充图 1：来自哈佛森林的 Quercus rubra 叶子说明了叶与齿的规则。 线段 p 和 d 在文本中定义。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处下载此文件。

补充图 2：来自哈佛森林的 黄桦 叶说明了区分副牙和乳牙的规则。 分离的叶段被放大了 2 倍。蓝线连接切口程度最大的鼻窦（即原发窦），与这些鼻窦相关的牙齿被认为是原发性（蓝色箭头）。红点标记可以作为附属部分区分的牙齿，因为它们的根尖窦被切开的程度较小。用红色箭头表示的牙齿与乳牙相比具有相似的切口度，但与乳牙相比，可以通过相对较细的主静脉来识别为附属牙齿。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处下载此文件。

补充图 3：牙齿选择、羽状叶规则和叶优先规则的插图。 （A） 来自 Huyck Preserve 的 金缕梅 叶的牙齿选择。变暗的区域对应于包含在总牙齿选择中的叶组织，因为辅助牙齿与乳牙不同。（B） 来自 IES 的 Quercus alba 叶说明了叶优先规则。变暗的区域被测量为叶，未变暗的区域被测量为齿，但所有投影都通过叶优先级规则被视为叶。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处下载此文件。

补充图 4：来自阿勒格尼国家森林的 Acer saccharum 叶子说明了伸展和单齿规则。 虚线描绘牙齿选择。实线描绘了相关牙齿的对称轴。黑色区域是用于压平叶子以进行摄影的重量。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处下载此文件。

补充图 5：说明了切出位于花序基部顶部的叶柄的理想方法。请点击此处下载此文件。

补充文件 1：所有测量的数字叶面相变量的数据输入模板。 不应修改此文件，因为它将用作 R 包的输入文件。 请点击此处下载此文件。

补充文件 2：来自 Lowe 等人的 McAbee 化石床的示例数据³⁸。 这些数据用于生成 图 7 和讨论代表性结果。 请点击此处下载此文件。

补充文件 3：化石数字叶面学的规则文件。请点击此处下载此文件。

讨论

本文介绍了如何在木本双子叶植物被子植物化石叶子上测量叶子面貌的连续性状，并随后应用于从现代校准数据开发的代理，以重建古气候和古生态学。这需要注意使方法步骤与代理校准数据集 ^5,6,10 中表示的方法步骤保持一致。这种考虑在化石叶收集期间应用该方案之前开始，特别是关于样本量。建议将化石叶组合汇集到尽可能窄的地层范围内，以获得适当数量的可测量标本和形态类型，以最大限度地减少时间平均。还建议将古气候重建限制在至少有 350 个可识别标本和至少 15-20 个木本双子叶植物被子植物形态型的地点 19,51,52。此外，在选择叶子进行分析时，建议尽可能多地测量每种形态型的叶子，并且至少选择代表形态类型内叶子面貌变化的标本。

在实施制备和测量部分时必须进一步小心，以保持与校准数据集的一致性。在准备阶段执行的步骤最有可能产生主观性，并且用户之间的结果各不相同。然而，如果故意遵循协议并经常引用附加考虑表（表 2、表 3）和规则文件（补充文件 3），则该方法会导致叶面貌的客观和可重复的测量。对于该方法的新手，建议与具有更多经验的人确认叶子已正确准备。在测量 M_A 重建的叶柄宽度时需要特别小心。由于这些值是平方的，因此测量值的不准确性会变得夸大。保存不完全和损坏会改变叶柄的尺寸，应小心避免。

这些方法存在一些值得注意的限制。最重要的是，dilp R 包中包含的代理重建仅适用于木本双子叶植物被子植物，因此可能排除了作为古代群落重要组成部分的其他植物群。然而，已经为叶柄和阔叶裸子植物 ^5,8、草本被子植物⁸ 和蕨类植物⁹ 发布了物种水平 M_A 的基于叶柄的替代物，用户可以根据需要单独合并。在木本双子叶植物被子植物以外的群落中排除突出的植物群落可能对重建站点水平的 M_A 平均值和方差影响最大，因为它们将提供整个群落内经济策略的不完整视角。系统发育历史影响叶齿的出现²³，引入了一种可能性，即分析具有新分类学组成的化石群落可能会给结果估计带来不确定性，尽管这种潜在影响的实现尚未得到测试和证明。

化石叶子也需要得到充分保存，以纳入边缘状态之外叶子面貌的定量测量。对于 DiLP 来说，对于全边缘叶子尤其如此，因为只有在保留或重建整片叶子或半叶子的情况下，它们才能提供超出边缘状态的信息。同样，只有在以下情况下，叶子才能被纳入 M_A 重建中：（1） 叶柄在插入叶叶片时都被保留，或者在特定情况下，如果叶子的基部和中脉的最基部被保留（见步骤 3.6 中的注释），并且 （2） 如果叶子的大小可以估计， 通过全叶测量或半叶重建。这意味着一些形态型可能被完全排除在位点水平的 M_A 分析之外。最后，时间是该协议的一个限制，因为古气候重建的单变量替代方案需要相对较少的时间来产生。

尽管存在这些限制，但与其他方法相比，使用 DiLP 和 M_A 重建方法仍然具有几个优势。M_A 重建是化石记录中重建叶子经济策略的唯一方法之一，使用二维叶柄宽度和叶面积测量允许使用常见的印记/压缩叶化石进行重建。对于 DiLP 来说，结合与气候功能相关的多个连续测量可以提高测量的可重复性和由此产生的气候重建的准确性 ^6,13。该协议旨在通过允许使用叶子碎片进行叶子齿度测量来适应化石记录的不完整性质。尽管叶面积的连续测量提供了有关叶子大小的更多信息，但 DiLP MAP 估计可以通过使用叶大小类别来补充，以增加样本量^16,53 或通过结合叶面积的叶脉缩放估计 42,54,55.与大多数涉及的方法一样，随着用户变得更有经验和信心，尤其是在准备步骤中，该协议的时间效率将提高。迄今为止，已按照此协议对 >150 现代^6、10、56 和至少 22 个化石组合进行了现场级 DiLP 测量，这一事实证明了其可行性 6,38,39,40,41,42 .最后，叶面貌的综合测量具有超出此处讨论的应用范围，可能有助于描述植物生态学、生理学、进化和发育的其他方面，适用于现代⁵⁶ 和古生物学⁴⁰。

总之，本文中详述的实现允许用户使用稳健且可重复的方法重建古气候和古生态学。这些方法提供了一个重要的机会，可以展示气候和生态系统对环境扰动的响应的过去例子，并进一步了解地球自然系统的复杂相互作用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copy stand or tripod			For fossil photography
Digital camera			For fossil photography, high resolution camera preferred
Image editing software			For digital preperation. Examples include Adobe Photoshop and GIMP, the latter of which is free (https://www.gimp.org/)
ImageJ software	IJ1.46pr		For making digital measurments, free software (https://imagej.net/ij/index.html)
Microsoft Excel	Microsoft		Or similar software for data entry
R software	The R foundation		For running provided R script (https://www.r-project.org/). R studio offers a user friendly R enviornment (https://posit.co/download/rstudio-desktop/). Both are free.
dilp R Package			Can be installed following instructions here: https://github.com/mjbutrim/dilp