Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados Representativos
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O protocolo apresentado mostra medição digital e análise de características fisionômicas foliares contínuas em folhas fósseis para reconstruir paleoclima e paleoecologia usando os métodos de fisionomia foliar digital e reconstrução de massa foliar por área.

Resumo

O clima e o ambiente influenciam fortemente o tamanho, a forma e a dentição (fisionomia) das folhas das plantas. Essas relações, particularmente em angiospermas lenhosas não monocotiledôneas, têm sido usadas para desenvolver proxies baseados em folhas para paleoclima e paleoecologia que foram aplicados para reconstruir ecossistemas terrestres antigos nos últimos ~ 120 milhões de anos da história da Terra. Além disso, dado que essas relações foram documentadas em plantas vivas, elas são importantes para entender os aspectos da evolução das plantas e como as plantas respondem às mudanças climáticas e ambientais. Para realizar esses tipos de análises em plantas modernas e fósseis, a fisionomia foliar deve ser medida com precisão usando uma metodologia reprodutível. Este protocolo descreve um método baseado em computador para medir e analisar uma variedade de variáveis fisionômicas foliares em folhas modernas e fósseis. Este método permite a medição de características fisionômicas foliares, em particular variáveis relacionadas a serrilhas foliares, área foliar, dissecção foliar e linearidade que são utilizadas no proxy fisionômico foliar digital para reconstrução do paleoclima, bem como largura do pecíolo e área foliar, que são utilizadas para reconstrução da massa foliar por área, um proxy paleoecológico. Como esse método digital de medição de características foliares pode ser aplicado a plantas fósseis e vivas, ele não se limita a aplicações relacionadas à reconstrução do paleoclima e da paleoecologia. Também pode ser usado para explorar características foliares que podem ser informativas para entender a função da morfologia foliar, desenvolvimento foliar, relações filogenéticas de características foliares e evolução das plantas.

Introdução

As folhas são unidades de produção fundamentais que facilitam a troca de energia (por exemplo, luz, calor) e matéria (por exemplo, dióxido de carbono, vapor d'água) entre a planta e o ambiente circundante 1,2. Para desempenhar essas funções, as folhas devem suportar mecanicamente seu próprio peso contra a gravidade no ar parado e ventoso 3,4. Devido a essas ligações intrínsecas, vários aspectos do tamanho, forma e dentição das folhas (fisionomia) refletem os detalhes de sua função e biomecânica e fornecem informações sobre seu ambiente e ecologia. Trabalhos anteriores quantificaram as relações entre fisionomia, clima e ecologia das folhas em todo o mundo moderno para estabelecer proxies que podem ser aplicados a assembléias de folhas fósseis 5,6. Esses proxies fornecem oportunidades importantes para reconstruir o paleoclima e a paleoecologia e contribuem para uma maior compreensão da complexa interação entre vários sistemas do planeta ao longo de sua história. Este artigo detalha os métodos necessários para o uso de duas proxies: 1) o método de reconstrução da massa foliar por área para elucidar a paleoecologia e 2) fisionomia foliar digital para reconstruir o paleoclima.

A massa seca foliar por área (MA) é uma característica da planta frequentemente medida tanto na neo quanto na paleobotânica. O valor primário de MA, especialmente para reconstruções fósseis, é que ele faz parte do espectro da economia foliar, um eixo coordenado de características foliares bem correlacionadas que inclui taxa fotossintética foliar, longevidade foliar e conteúdo de nutrientes foliares em massa7. A capacidade de reconstruir MA partir de fósseis fornece uma janela para esses processos metabólicos e químicos inacessíveis e, em última análise, pode revelar informações úteis sobre a estratégia ecológica das plantas e a função do ecossistema.

Royer et al.5 desenvolveram um método para estimar a MA de folhas fósseis de angiospermas lenhosas não monocotiledôneas (dicotiledôneas) com base na área da lâmina foliar e na largura do pecíolo. Teoricamente, o pecíolo da folha atua como um balanço, mantendo o peso da folha na posição ideal 3,4. A área da seção transversal do pecíolo, que constitui o componente mais significativo da resistência do feixe, deve, portanto, estar fortemente correlacionada com a massa da folha. Ao simplificar a forma do pecíolo em um tubo cilíndrico, a área da seção transversal do pecíolo pode ser representada com a largura do pecíolo ao quadrado, permitindo que a massa foliar seja estimada a partir de um fóssil bidimensional (para mais detalhes, consulte Royer et al.5). A área foliar pode ser medida diretamente. Juntos, a largura do pecíolo ao quadrado dividida pela área da folha (ou seja, a métrica do pecíolo; Tabela 1) fornece um bom proxy para o MA fóssil e permite que os paleobotânicos entrem na ecologia moderna baseada em características. Os métodosde reconstrução M A também foram expandidos para gimnospermas de folha larga e pecioladas 5,8, angiospermas herbáceas8 e samambaias9, que produziram relações que diferem das relações observadas para angiospermas dicotiledôneas lenhosas e entre si. Um conjunto de dados expandido de dicotiledôneas lenhosas e novas equações de regressão para reconstruir a variância e a média de MA no nível do local permitem a inferência da diversidade de estratégias econômicas foliares e quais estratégias são mais prevalentes, entre as angiospermas dicotiledôneas lenhosas em floras fósseis10.

A relação entre as características fisionômicas das folhas e seu clima é observada há mais de um século11,12. Especificamente, a fisionomia das folhas de angiospermas dicotiledôneas lenhosas está fortemente correlacionada com a temperatura e a umidade13. Essa relação formou a base para numerosos proxies fisionômicos de folhas univariadas 14,15,16,17 e multivariadas 6,18,19,20,21,22 para paleoclima terrestre. Os métodos paleoclimáticos fisionômicos de folhas univariadas e multivariadas têm sido amplamente aplicados a floras fósseis dominadas por angiospermas em todos os continentes, abrangendo os últimos ~ 120 milhões de anos da história da Terra (do Cretáceo ao moderno) 23 .

Duas observações fundamentais utilizadas em proxies paleoclimáticos fisionômicos foliares são 1) a relação entre o tamanho da folha e a precipitação média anual (MAP) e 2) a relação entre os dentes foliares (ou seja, projeções externas da margem foliar) e a temperatura média anual (MAT). Especificamente, o tamanho médio da folha de todas as espécies de angiospermas de dicotiledôneas lenhosas em uma localidade está positivamente correlacionado com a MAP, e a proporção de espécies de angiospermas de dicotiledôneas lenhosas em uma localidade com folhas dentadas, além do tamanho e número de dentes, correlaciona-se negativamente com o MAT 6,12,13,14,15,16,24.

Uma ligação funcional entre essas relações fisionomia-clima foliar é fortemente apoiada tanto pela teoria quanto pela observação 1,2,25. Por exemplo, embora folhas maiores forneçam maior área de superfície fotossintética, elas requerem maior suporte, perdem mais água por transpiração e retêm calor mais sensível devido a uma camada limite mais espessa 1,26,27. Assim, folhas maiores são mais comuns em ambientes mais úmidos e quentes porque a perda de água pelo aumento da transpiração resfria efetivamente as folhas e é menos problemática. Em contraste, folhas menores em climas quentes mais secos reduzem a perda de água e evitam o superaquecimento, aumentando a perda de calor sensível28,29. Detalhes de quais fatores, ou combinação de fatores, contribuem mais fortemente para explicar as ligações funcionais permanecem enigmáticos para outras características foliares. Por exemplo, várias hipóteses foram propostas para explicar a relação dentes foliares-MAT, incluindo resfriamento foliar, empacotamento eficiente de botões, suporte aprimorado e fornecimento de folhas finas, gutação por meio de hidódios e maior produtividade no início da temporada 30,31,32,33.

A maioria dos proxies paleoclimáticos fisionômicos foliares depende da divisão categórica das características foliares, em vez de medições quantitativas de variáveis contínuas, levando a várias deficiências potenciais. A abordagem categórica exclui a incorporação de informações mais detalhadas capturadas por medições contínuas que estão fortemente correlacionadas com o clima (por exemplo, número de dentes, linearidade foliar), o que pode reduzir a precisão das estimativas paleoclimáticas 6,20,34. Além disso, em alguns dos métodos de pontuação de características foliares, as características que estão sendo pontuadas categoricamente podem ser ambíguas, levando a problemas de reprodutibilidade, e algumas características têm evidências empíricas limitadas para apoiar sua ligação funcional com o clima 6,15,16,35,36.

Para resolver essas deficiências, Huff et al.20 propuseram medir digitalmente as características contínuas da folha em um método conhecido como fisionomia digital da folha (DiLP). Uma das principais vantagens do DiLP em relação aos métodos anteriores é sua dependência de características que 1) podem ser medidas de forma confiável entre os usuários, 2) são de natureza contínua, 3) estão funcionalmente ligadas ao clima e 4) exibem plasticidade fenotípica entre as estações de crescimento 6,37. Isso levou a estimativas mais precisas de MAT e MAP do que os métodos paleoclimáticos fisionômicos foliares anteriores6. Além disso, o método acomoda a natureza imperfeita do registro fóssil, fornecendo etapas para contabilizar folhas danificadas e incompletas. O método DiLP foi aplicado com sucesso a uma variedade de floras fósseis de vários continentes, abrangendo uma grande variedade de tempo geológico 6,38,39,40,41,42.

O protocolo a seguir é uma expansão do descrito em trabalhos anteriores 5,6,20,34. Ele explicará os procedimentos necessários para reconstruir o paleoclima e a paleoecologia a partir de folhas fósseis de angiospermas dicotiledôneas lenhosas usando os métodosde reconstrução DiLP e MA (consulte a Tabela 1 para obter uma explicação das variáveis medidas e calculadas por meio do uso deste protocolo). Além disso, este protocolo fornece etapas para registrar e calcular características foliares não incluídas na análise DiLP ou MA, mas que são fáceis de implementar e fornecem caracterizações úteis da fisionomia foliar (Tabela 1). O protocolo segue o seguinte formato: 1) Imagem de folhas fósseis; 2) preparo digital foliar, organizado em cinco cenários possíveis de preparo; 3) medição digital da folha, organizada nos mesmos cinco cenários de preparo possíveis; e 4) análises de DiLP e MA, usando o pacote R dilp10.

O protocolo para reconstruções de MA está embutido no protocolo DiLP porque ambos são convenientes para preparar e medir um ao lado do outro. Se um usuário estiver interessado apenasem análises de MA, ele deve seguir as etapas de preparação descritas no cenário de preparação 2 do DiLP, independentemente de a margem da folha ser dentada ou não, e as etapas de medição que descrevem apenas as medidas da largura do pecíolo, da área do pecíolo e da área foliar. Um usuário pode então executar as funções apropriadas no pacote dilp R que executaas reconstruções de MA.

Protocolo

1. Imagem de folhas fósseis

  1. Posicione o fóssil de folha sob a câmera e certifique-se de que ele esteja o mais plano possível usando, por exemplo, uma caixa de areia ou massa para encaixar sob o fóssil.
    NOTA: Ao fotografar vários espécimes em um único bloco, é melhor fotografá-los em close-ups separadamente para garantir que os detalhes do fóssil sejam claros e nítidos. Também é útil colocar o fóssil em um fundo fosco escuro sólido, como feltro preto ou veludo.
  2. Coloque uma barra de escala horizontalmente e no mesmo plano vertical da folha, colocando-a perto do fóssil, mas não cobrindo nenhuma parte dele. Se houver pouca ou nenhuma matriz ao redor do fóssil, a escala deve ser colocada dentro do porta-retratos e estar em foco.
  3. Usando um tripé de câmera ou suporte de cópia, posicione a câmera diretamente acima da folha do fóssil com a lente paralela à superfície da rocha. Para garantir que os detalhes da folha sejam capturados com nitidez, posicione a câmera o mais próximo possível do fóssil, mantendo-se dentro da distância focal da lente/câmera e garantindo que todo o fóssil esteja dentro do quadro da fotografia.
    NOTA: Se possível, é melhor usar uma câmera digital de alta resolução e uma lente macro com foco manual e profundidade de campo suficiente para focar nitidamente na folha que será processada.
  4. Usando luz indireta, acenda o fóssil conforme necessário para ver claramente todo o contorno do espécime. Muitas vezes é necessário reajustar a iluminação para cada fóssil.
  5. Fotografe a folha fóssil e rotule o arquivo de imagem adequadamente.

2. Preparação digital

NOTA: Uma ilustração da terminologia de arquitetura leaf usada nesses protocolos é fornecida na Figura 1. Use a árvore de decisão (Figura 2) e os exemplos fornecidos (Figura 3) para determinar qual cenário de preparação é aplicável à folha fóssil a ser medida e prossiga para a seção apropriada. Consulte a Tabela 2 para considerações adicionais nas etapas de preparação. Se a folha se enquadrar no cenário 1 ou 5, a folha não poderá ser preparada para medições quantitativas da fisionomia foliar.

  1. Cenário 2: Folha inteira com margens cuja área, ou metade da área, é preservada ou pode ser reconstruída.
    1. Abra o arquivo no software de processamento de imagem (por exemplo, Adobe Photoshop ou GIMP). Corte a imagem, se necessário, o que ajuda a reduzir o tamanho final do arquivo, mas garante que a barra de escala ainda esteja incluída.
    2. Dobre a largura da área de trabalho clicando em Imagem > Tela (Photoshop); Tamanho da imagem > tela (GIMP). Sugere-se adicionar uma nova tela à direita ou à esquerda da tela atual.
    3. Se a margem da folha exigir alguma reconstrução, decida se a área e a forma da folha podem ser medidas de forma mais confiável a partir de uma meia folha ou de uma folha inteira (Figura 3).
    4. Copie a folha da matriz rochosa. Trace a folha inteira ou meia, incluindo o pecíolo, se presente, usando uma ferramenta de laço (ver Tabela 2). Copie e cole a seleção e coloque-a em uma área aberta da tela. Considere colar duas cópias dessa seleção, sendo uma delas não editada para retornar, se necessário, para reiniciar o processo de preparação.
    5. Repare todas as partes danificadas da margem usando uma linha de cor apropriada (normalmente preta se estiver em um fundo branco). Desenhe uma linha que abranja a margem danificada para que a margem seja reconstruída de forma confiável, usando, por exemplo, a ferramenta pincel ou linha. Certifique-se de que a linha seja grossa o suficiente para ser vista (~ 1-2 pt de peso) e que conecte a margem na área danificada.
    6. Remova o pecíolo da folha, se houver, usando a ferramenta laço.
      1. Visualmente, siga a margem da folha ao longo da base até o ponto em que ela entra em contato com o pecíolo, que geralmente é de cor mais escura e não contém veias distintas. Coloque uma ponta de laço lá. Faça o mesmo na outra metade da folha e coloque o segundo ponto lá.
        NOTA: Se a base da folha for simétrica, a linha será ~perpendicular ao pecíolo; se for assimétrica, a linha estará em ângulo.
      2. Circunde todo o pecíolo para terminar a seleção. Recorte e cole, ou use a ferramenta de movimentação, para colocar o pecíolo próximo à lâmina da folha, mas sem tocá-la.
        NOTA: Para uma base de folha cordada ou lobada, o que significa que a base se estende abaixo de onde o pecíolo se liga à lâmina foliar, o pecíolo tem o potencial de repousar sobre a base da folha abaixo de onde o pecíolo se liga à lâmina foliar. Tome cuidado para cortar o pecíolo onde ele realmente se prende, trace a margem do pecíolo de perto e repare a margem danificada resultante. Reconhece-se que isso pode ser difícil de ver na maioria dos fósseis.
    7. Corte a área final da imagem, se necessário, para reduzir o tamanho do arquivo. Consulte a Figura 3 para obter um exemplo de como a imagem preparada concluída deve aparecer.
  2. Cenário 3: uma folha dentada cuja área, ou meia área, não pode ser reconstruída, mas tem ≥ dois dentes consecutivos e ≥25% da folha preservada
    NOTA: As medidas dos dentes são as únicas características que podem ser medidas em folhas desta categoria, portanto, as folhas são preparadas apenas para essas medidas.
    1. Abra o arquivo em um software de processamento de imagem (por exemplo, Adobe Photoshop ou GIMP). Corte a imagem, se necessário, o que ajuda a reduzir o tamanho final do arquivo, mas garante que a barra de escala ainda esteja incluída.
    2. Tripe para quadruplicar a largura da área de trabalho clicando em Imagem > Tela (Photoshop); Imagem > Tamanho da tela (GIMP). Sugere-se adicionar uma nova tela à direita ou à esquerda da tela atual.
    3. Copie a folha da matriz rochosa. Trace a extensão da folha preservada, incluindo o pecíolo, se presente, usando uma ferramenta de laço. Não se preocupe em rastrear partes danificadas da margem precisamente porque elas serão removidas. Copie e cole a seleção e coloque-a em uma área aberta da tela. Você pode colar duas cópias dessa seleção, sendo uma delas uma versão não editada para retornar, se necessário, para reiniciar o processo de preparação.
    4. Se presente, remova o pecíolo da folha usando a ferramenta de laço.
      1. Visualmente, siga a margem da folha ao longo da base até o ponto em que ela entra em contato com o pecíolo, que geralmente é de cor mais escura e não contém veias distintas. Coloque uma ponta de laço lá. Faça o mesmo na outra metade da folha e coloque o segundo ponto lá.
        NOTA: Se a base da folha for simétrica, a linha será ~perpendicular ao pecíolo, se for assimétrica, a linha estará em ângulo.
      2. Circunde todo o pecíolo para terminar a seleção. Recorte e cole, ou use a ferramenta de movimentação, para colocar o pecíolo próximo à lâmina da folha, mas sem tocá-la.
        NOTA: Para uma base de folha cordada ou lobada, o que significa que a base se estende abaixo de onde o pecíolo se liga à lâmina foliar, o pecíolo tem o potencial de repousar sobre a base da folha abaixo de onde o pecíolo se liga à lâmina foliar. Tome cuidado para cortar o pecíolo onde ele realmente se prende, trace a margem do pecíolo de perto e repare a margem danificada resultante. Isso pode ser difícil de ver na maioria dos fósseis.
    5. Remova a área adjacente às partes danificadas da margem usando uma ferramenta de laço.
      1. Comece a seleção em um ponto ao longo da margem que delimita a porção danificada e desenhe uma linha reta desse ponto até a veia principal que é perpendicular a essa veia principal (Figura 4). Inicie a seleção no seio dentário decíduo preservado mais próximo do dano. Isso garante que o flanco de um dente não seja incluído como um perímetro interno nas medições subsequentes, e os dentes subsidiários não sejam medidos como se fossem dentes decíduos. Isso pode não ser apropriado se os dentes estiverem distantes, pois muita margem preservada pode acabar sendo removida (Figura 4).
      2. Prossiga a seleção ao longo da veia principal até o nível com a outra delimitação da margem danificada e desenhe uma linha reta perpendicular à veia maior até a margem (Figura 4).
        NOTA: Para folhas pinadas (Figura 1A), com e sem veias agrofíficas (ver Ellis et al.43), a nervura principal é a nervura primária (ou seja, nervura média). Para folhas com veias palmadas (Figura 1B, D), a nervura principal é a nervura primária mais próxima (por exemplo, Figura 4B). Para folhas com lóbulos pinados ( Figura 1C ), se o dano estiver localizado em um lóbulo pinado, a veia principal é a veia (normalmente uma veia secundária) que alimenta o lóbulo.
      3. Complete a seleção e exclua esta parte da folha. Repita para todas as partes danificadas da folha.
    6. Copie e cole esta folha preparada e coloque-a em uma área aberta da tela.
    7. Remova os dentes usando uma ferramenta de laço.
      1. Comece no ápice da folha, um dos ápices do lobo ou o dente mais apical de um fragmento de folha e faça uma seleção em cada seio dentário decíduo ao longo dessa folha, lóbulo ou fragmento (Figura 5; consulte a Figura Suplementar 1, a Figura Suplementar 2 para obter dicas sobre como distinguir dentes decíduos e subsidiários e como distinguir dentes de lóbulos). Certifique-se de seguir as regras apropriadas ao cortar os dentes (Tabela 2; Figura 3 suplementar).
        NOTA: Os dentes decíduos geralmente se tornam menores em direção à base e ao ápice.
      2. Após selecionar o seio apical do dente mais basal, aplicar a régua de extensão (Tabela 2; Figura suplementar 4) para cortar o último dente da sequência.
      3. Remova os dentes cortando e colando os dentes ao lado da lâmina da folha com os dentes removidos sem tocá-la. Se a preparação tiver lóbulos ou fragmentos de folhas adicionais que exijam a remoção dos dentes, repita as etapas acima até que todos os dentes sejam removidos.
    8. Se uma versão extra da folha recortada original foi criada, exclua a versão extra. Corte a área final da imagem, se necessário, para reduzir o tamanho do arquivo. Consulte a Figura 3 para obter um exemplo de como a imagem preparada concluída deve aparecer.
  3. Cenário 4: uma folha dentada cuja área, ou área foliar, é preservada ou pode ser reconstruída
    1. Abra o arquivo no software de processamento de imagem (por exemplo, Adobe Photoshop ou GIMP). Corte a imagem, se necessário, o que ajuda a reduzir o tamanho final do arquivo, mas garante que a barra de escala ainda esteja incluída.
    2. Tripe para quadruplicar a largura da área de trabalho clicando em Imagem > Tela (Photoshop); Imagem > Tamanho da tela (GIMP). Sugere-se adicionar uma nova tela à direita ou à esquerda da tela atual.
    3. Decida como a folha será preparada. As medições da área/forma da folha precisam ser feitas em uma folha inteira ou meia folha, decida qual opção resultará em medições mais precisas. As medidas dos dentes devem ser feitas ao longo de todas as seções da margem preservada. Em alguns casos, as medições de área/forma da folha podem ocorrer em um subconjunto diferente da folha do que o subconjunto onde as variáveis do dente são medidas.
      NOTA: No exemplo fornecido (Figura 6), foi decidido que uma meia folha seria reconstruída de forma mais confiável do que uma folha inteira. A margem preservada no canto inferior direito (>1 dente preservado) foi incluída para as medidas dentárias. O protocolo a seguir para o Cenário 4 segue aproximadamente o exemplo fornecido (Figura 6), mas os detalhes podem variar ligeiramente em diferentes contextos de preparação.
    4. Copie a folha da matriz rochosa, certificando-se de incluir toda a margem preservada.
      1. Trace a margem da folha, incluindo o pecíolo, se presente, usando uma ferramenta de laço. Não rastreie partes danificadas da margem que não serão incluídas nas medidas de área/forma precisamente porque serão removidas (por exemplo, metade direita da folha na Figura 6).
      2. Copie e cole a seleção e coloque-a em uma área aberta da tela. Considere colar duas cópias dessa seleção, sendo uma delas uma não editada para retornar, se necessário, para reiniciar o processo de preparação.
    5. Se houver, remova o pecíolo da folha usando a ferramenta laço.
      1. Visualmente, siga a margem da folha ao longo da base até o ponto em que ela entra em contato com o pecíolo, que geralmente é de cor mais escura e não contém veias distintas. Coloque uma ponta de laço lá. Faça o mesmo na outra metade da folha e coloque o segundo ponto lá.
        NOTA: Se a base da folha for simétrica, a linha será ~perpendicular ao pecíolo; se for assimétrica, a linha estará em ângulo. Circunde todo o pecíolo para terminar a seleção.
      2. Recorte e cole, ou use a ferramenta de movimentação, para colocar o pecíolo próximo à folha, mas sem tocá-la.
        NOTA: Para uma base de folha cordada ou lobada, o que significa que a base se estende abaixo de onde o pecíolo se liga à lâmina foliar, o pecíolo tem o potencial de repousar sobre a base da folha abaixo de onde o pecíolo se liga à lâmina foliar. Tome cuidado para cortar o pecíolo onde ele se fixa, trace a margem do pecíolo de perto e repare a margem danificada resultante (Figura Suplementar 5). Isso pode ser difícil de ver na maioria dos fósseis.
    6. Copie e cole a folha isolada com o pecíolo removido para criar uma segunda cópia para preparar as medidas dos dentes e coloque-a em uma área aberta da tela.
    7. Prepare uma versão da folha para medições de área e forma da folha.
      1. Se estiver preparando meia folha, corte o excesso de material da folha usando a ferramenta laço para que reste apenas meia folha completa. Se estiver preparando uma folha completa, não remova nenhum material foliar.
      2. Se necessário, repare todas as áreas danificadas ao longo da margem usando uma linha de cor apropriada usando uma ferramenta de linha ou pincel (normalmente uma linha preta para um fundo branco). Certifique-se de que a linha seja grossa o suficiente para ser vista (~ 1-2 pt de peso) e que conecte a margem na área danificada.
    8. Prepare uma versão da folha para medições de dentes.
      1. Remova a área adjacente às partes danificadas da margem usando uma ferramenta de laço.
        1. Comece a seleção em um ponto ao longo da margem que delimita a porção danificada e desenhe uma linha reta desse ponto até a veia principal que é perpendicular a essa veia principal (Figura 4). Inicie a seleção no seio dentário decíduo preservado mais próximo do dano. Isso garante que o flanco de um dente não seja incluído como um perímetro interno nas medições subsequentes, e os dentes subsidiários não sejam medidos como se fossem dentes decíduos. Isso pode não ser apropriado se os dentes estiverem distantes, pois muita margem preservada pode acabar sendo removida (Figura 4).
        2. Prossiga a seleção ao longo da veia maior até o nível com a outra delimitação da margem danificada e desenhe uma linha reta perpendicular à veia maior até a margem (Figura 4).
          NOTA: Para folhas pinadas (Figura 1A), com e sem veios agrofísticos (ver Ellis et al.43 para definição e exemplos), a nervura principal é a nervura primária (ou seja, nervura média). Para folhas com veias palmadas (Figura 1B, D), a nervura principal é a nervura primária mais próxima (por exemplo, Figura 4B). Para folhas com lóbulos pinados ( Figura 1C ), se o dano estiver localizado em um lóbulo pinado, a veia principal é a veia (normalmente uma veia secundária) que alimenta o lóbulo.
        3. Exclua a parte danificada da folha. Faça o mesmo para todas as partes danificadas da folha.
    9. Copie e cole a versão preparada para as medidas dos dentes, com as partes danificadas removidas, e coloque em uma área aberta da tela.
    10. Remova os dentes usando uma ferramenta de laço.
      1. Comece no ápice da folha, um dos ápices do lóbulo ou o dente mais apical de um fragmento de folha e faça uma seleção em cada seio dentário decíduo ao longo da folha, lóbulo ou fragmento (Figura 5; consulte a Figura Suplementar 2 para obter dicas sobre como distinguir dentes decíduos e subsidiários e como distinguir dentes de lóbulos). Certifique-se de seguir as regras apropriadas ao cortar os dentes (Tabela 2; Figura suplementar 2).
        NOTA: Os dentes decíduos geralmente se tornam menores em direção à base e ao ápice.
      2. Após selecionar o seio apical do dente mais basal, aplicar a régua de extensão (Tabela 2; Figura suplementar 4) para cortar o último dente da sequência.
      3. Remova os dentes cortando e colando os dentes ao lado da lâmina da folha com os dentes removidos sem tocá-la. Se a preparação tiver lóbulos ou fragmentos de folhas adicionais que exijam a remoção dos dentes, repita as etapas acima até que todos os dentes sejam removidos.
    11. Se uma versão extra da folha recortada original foi criada, exclua a versão extra. Corte a área final da imagem, se necessário, para reduzir o tamanho do arquivo. Consulte a Figura 3 para obter um exemplo de como a imagem preparada concluída deve aparecer.

3. Medição digital

NOTA: Uma planilha de modelo de entrada de dados é fornecida como Arquivo Suplementar 1. Consulte a Tabela 3 para considerações adicionais nas etapas de medição. Nos cenários 1 e 5, a única etapa necessária é registrar o estado da margem folha na planilha de entrada de dados (etapa 3.5).

  1. Abra o software ImageJ44. Defina quais medições serão feitas automaticamente (faça isso uma vez após a instalação do programa).
  2. Clique em Analisar > Definir Medidas e selecione apenas Área, Perímetro e Diâmetro de Feret. Certifique-se de que as casas decimais estejam definidas como 3.
  3. Abra a imagem da folha fóssil preparada clicando em Arquivo > Abrir ou simplesmente arrastando e soltando a imagem na barra de ferramentas ImageJ já aberta.
  4. Defina a escala para cada nova imagem folha.
    NOTA: Esta é uma etapa crítica e deve ser feita para cada nova imagem de folha para garantir medições precisas.
    1. Clique na ferramenta Linha reta. Aumente o zoom na barra de escala e desenhe a linha reta mais longa possível na barra de escala.
    2. Clique em Analisar > Definir escala. Em distância conhecida, insira o comprimento medido em cm (para ser consistente com a unidade usada no conjunto de dados de calibração moderno). Não é necessário alterar a unidade de comprimento. Clique em OK.
  5. Marque a folha como dentada (0) ou inteira (1) na planilha de entrada de dados.
  6. Meça a largura do pecíolo se o pecíolo estiver presente. As medições devem ser feitas na cópia original da folha ainda na matriz da rocha, pois fornece um contexto muito melhor.
    NOTA: Se o pecíolo não estiver presente, em alguns casos, a largura da veia média em sua posição basal pode ser medida em vez do pecíolo. No entanto, isso só deve ser feito se toda a largura da nervura média for preservada (ou seja, não houver lâmina comprimida no topo da nervura ou o fóssil preservar o lado abaxial da folha) e outros espécimes da mesma espécie ou morfotipo mostrarem que a largura da veia basal é equivalente à largura do pecíolo.
    1. Desenhe uma linha reta perpendicular ao pecíolo, onde o pecíolo encontra a lâmina foliar, ou se o ponto de inserção for assimétrico, desenhe uma linha perpendicular ao pecíolo no ponto mais basal de inserção. É importante traçar essa linha com cuidado. Assim, é recomendável ampliar esta área da folha para facilitar o desenho preciso da linha.
      NOTA: Existem circunstâncias especiais em que esta etapa precisa ser modificada, incluindo se, no ponto mais basal de inserção, houver danos, tricomas, nectários, espinhos ou outras características que impeçam medições precisas da largura do pecíolo. Nesses casos, meça a largura do pecíolo no primeiro ponto abaixo do recurso onde a medição pode ser feita de forma confiável.
    2. Clique em Analisar > Medir ou use um atalho para medir o comprimento da linha desenhada. Desenhe a mesma linha na imagem para criar um registro de exatamente onde a medição foi feita clicando em Editar > Desenhar ou usando um atalho. Altere a cor da linha usando uma ferramenta na barra de ferramentas principal (seletor de cores), se necessário.
    3. Depois que a linha for desenhada, salve a imagem, de preferência com um nome de arquivo modificado.
    4. Registre o comprimento desta linha sob a largura do pecíolo na planilha de entrada de dados.
  7. Prepare a folha para medições adicionais, tornando a imagem em preto e branco. Para fazer isso, clique em Imagem > Tipo > 8 bits.
  8. Limite a imagem clicando em Imagem > Ajustar > Limite ou use o atalho. Uma caixa intitulada Limite será aberta e mudará parte da imagem para vermelho. Se a folha for clara e o fundo for escuro, clique em Fundo Escuro.
  9. Ajuste o limite usando a barra deslizante até que o interior da folha fique vermelho e distinto do fundo. Esta é uma etapa crítica e um lugar fácil para produzir dados imprecisos. Certifique-se de que a área vermelha corresponda exatamente à folha (ou seja, todo o perímetro da folha é vermelho e nada mais), ampliando algumas seções da margem. Lacunas vermelhas no interior da folha são aceitáveis e não afetam as medições.
    NOTA: Se o contorno da folha não estiver bem definido, primeiro tente ajustar o limite enquanto aumenta o zoom para confirmar que o contorno da folha está vermelho. Se o contraste ruim entre o fóssil e o fundo impedir que um limite confiável seja aplicado, use a ferramenta pincel para adicionar um contorno sólido ao perímetro da folha em áreas onde o contraste é muito ruim. Como alternativa, retorne a folha ao software de processamento de imagem (por exemplo, Adobe Photoshop ou GIMP) e ajuste o contraste das camadas de folha isoladas ou a cor do fundo para diferenciá-las melhor.
  10. Meça a área foliar e a forma das folhas preparadas nos cenários 2 (etapa 2.1) e 4 (etapa 2.4).
    NOTA: Use a Figura 2 e a Figura 6B como um guia para quais variáveis são medidas em quais componentes da imagem preparada. Se as folhas foram preparadas no cenário 3 (etapa 2.2), ignore esta etapa e prossiga para a etapa 3.11.
    1. Meça a folha preparada para as medições da área e forma da folha, que deve ter apenas o pecíolo removido (se houver pecíolo). Selecione a ferramenta Varinha . Clique no interior da folha. A folha inteira deve ser contornada em amarelo - confirme se o contorno está correto.
    2. Faça medições clicando em Analisar > Medir ou usando o atalho.
    3. Se a área medida for preparada como uma folha inteira, registre a área, o perímetro, o Feret e o mínimo de Feret na planilha de entrada de dados. Se a área medida for preparada como meia folha, registre apenas Feret e prossiga para a próxima etapa.
    4. Se a área medida for meia folha, meça o perímetro médio artificial da folha, que é o comprimento do perímetro artificial que resulta do corte da folha ao meio (Figura 6B). Se a área medida for a folha inteira, pule esta etapa e a etapa 3.10.5.
      NOTA: A medição do perímetro médio artificial permite que o perímetro da lâmina seja calculado a partir de meias folhas (consulte a etapa 3.10.5 abaixo). O perímetro da lâmina não é usado em variáveis incluídasnas análises DiLP e MA, mas é usado para outras variáveis úteis para a caracterização da fisionomia (por exemplo, fator de forma, compacidade; Tabela 1).
      1. Selecione a ferramenta de linha segmentada clicando com o botão direito do mouse na ferramenta Linha . Trace todo o comprimento do perímetro médio artificial.
      2. Clique em Analisar > Medir ou use o atalho para medir o comprimento. Esta medida será usada na fórmula para calcular o perímetro da lâmina abaixo (etapa 3.10.5).
    5. Se a área medida for meia folha, modifique as medidas à medida que as insere na planilha de entrada de dados multiplicando a área por 2, multiplicando o Feret mínimo por 2 e calculando o perímetro da lâmina subtraindo primeiro o perímetro médio artificial do perímetro de meia folha e depois multiplicando por 2 usando a seguinte fórmula:
      Perímetro da lâmina = (perímetro - perímetro médio artificial) x 2
    6. Se um pecíolo recortado estiver presente, meça sua área. Se não estiver presente, a medição está concluída para o cenário 2, mas prossiga para a etapa 3.11 para o cenário 4.
      1. Clique no pecíolo recortado com a ferramenta varinha. O pecíolo deve ser delineado em amarelo. Faça medições clicando em Analisar > Medir ou usando o atalho. Registre a área sob a área do pecíolo na planilha de entrada de dados.
    7. Para o cenário 2 (etapa 2.1), a medição está concluída; Para o Cenário 4 (etapa 2.3), prossiga para a próxima etapa.
  11. Meça as variáveis dentárias para folhas preparadas nos cenários 3 (etapa 2.2) e 4 (etapa 2.3).
    1. Meça a lâmina crua. Com a ferramenta de varinha, selecione o interior da lâmina bruta (ou seja, folha preparada para medições de dentes que ainda tem seus dentes; Figura 6B). Deve ser contornado em amarelo. Faça medições clicando em Analisar > Medir ou usando o atalho.
      NOTA: Dependendo de como a folha foi preparada, pode ser necessário medir várias seções disjuntas, somando suas áreas (por exemplo, Figura 6B). Como alternativa, você pode selecionar várias seções por vez, selecionando uma segunda seção com a ferramenta varinha enquanto mantém pressionada a tecla Shift .
    2. Registre a área e o perímetro sob a área bruta da lâmina e o perímetro bruto da lâmina na planilha de entrada de dados.
    3. Meça a lâmina bruta interna. Selecione o interior da lâmina bruta interna (ou seja, folha preparada para medições de dentes que tem os dentes removidos; Figura 6B). Deve ser contornado em amarelo. Faça medições clicando em Analisar > Medir ou usando o atalho.
      NOTA: Dependendo de como a folha foi preparada, pode ser necessário medir várias seções disjuntas, somando suas áreas (por exemplo, Figura 6B). Como alternativa, você pode selecionar várias seções por vez, selecionando uma segunda seção com a ferramenta varinha enquanto mantém pressionada a tecla Shift .
    4. Registre a área e o perímetro sob a área interna da lâmina bruta e o perímetro interno da lâmina bruta na planilha de entrada de dados.
    5. Meça o comprimento do perímetro de corte. Remova o limite para ver a folha claramente, clique em Redefinir na caixa de limite ou clique em Editar > Desfazer - o último geralmente também removerá a conversão de 8 bits em preto e branco. Selecione a ferramenta de linha segmentada e trace todo o comprimento do perímetro de corte na lâmina bruta.
    6. Meça clicando em Analisar > Medir ou usando o atalho. Se houver várias partes, repita as etapas anteriores para medir o comprimento do perímetro de corte de cada parte. Registre o comprimento, ou a soma dos comprimentos, sob o comprimento do perímetro de corte na planilha de entrada de dados.
      NOTA: O perímetro de corte é introduzido através da preparação da folha, removendo os danos. Na maioria dos casos, isso é diferente do perímetro médio artificial (Figura 6B).
    7. Conte os dentes decíduos e subsidiários, se presentes.
      NOTA: Consulte a Figura Suplementar 2 para obter dicas sobre como distinguir entre dentes decíduos e subsidiários.
      1. Se o limite ainda não tiver sido removido, remova-o agora. Para remover o limite, clique em Redefinir na caixa de limite ou clique em Editar > Desfazer — o último geralmente também removerá a conversão em preto e branco de 8 bits.
      2. Conte o número de dentes decíduos (consulte a Figura Suplementar 2 para obter dicas sobre como distinguir dentes decíduos e subsidiários). Selecione a ferramenta Multiponto. Pode ser necessário clicar com o botão direito do mouse na ferramenta Ponto primeiro, para selecionar a Ferramenta Multiponto. Clique em cada dente decíduo para numerá-lo.
      3. Para remover um ponto selecionado por engano, pressione a tecla Alt (Windows OS) ou Command/cmd ou option (Mac OS) e, ao mesmo tempo, clique no ponto. Registre o número final em # de dentes decíduos na planilha de entrada de dados.
      4. Limpe as contagens e anotações de ferramentas de vários pontos clicando em Editar > Seleção > Selecionar Nenhum ou use o atalho de teclado.
      5. Conte o número total de dentes (ou seja, todos os dentes decíduos e subsidiários presentes na folha). Selecione a ferramenta Multiponto. Pode ser necessário clicar com o botão direito do mouse na ferramenta Ponto primeiro, para selecionar a ferramenta Multiponto. Clique em cada dente, incluindo o primário e o subsidiário, para numerá-lo.
        NOTA: Contar o número total de dentes, em vez do número de dentes subsidiários, garante que nenhum dente seja contado duas vezes. O número total de dentes é subtraído pelo número de dentes decíduos para determinar o número de dentes subsidiários (consulte a etapa 3.11.7.6).
      6. Para remover um ponto selecionado por engano, pressione a tecla Alt (Windows OS) ou Command/cmd ou option (Mac OS) e, ao mesmo tempo, clique no ponto. Subtraia o número de dentes decíduos do número total de dentes para determinar o número de dentes subsidiários. Registre isso em # de dentes subsidiários na planilha de entrada de dados.
        NOTA: Alguns usuários preferem fazer contagens de dentes ao preparar imagens de folhas em vez de medir.

4. Execução de análises em software R

NOTA: As etapas a seguir requerem o pacote R dilp11. A planilha de entrada de dados é lida em R e usada pelo pacote. Consulte a guia Instruções adicionais na planilha de entrada de dados (Arquivo suplementar 2). O script R pode acomodar a análise de vários locais simultaneamente ou de um único local.

  1. Abra o R usando seu ambiente preferido (o R Studio é recomendado). Para uma introdução ao R, consulte, por exemplo, https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.pdf.
  2. Instale o pacote dilp em sua sessão R. Consulte o seguinte website para obter mais informações sobre como instalar o pacote e executar suas funções associadas: https://cran.r-project.org/package=dilp
  3. Leia no arquivo .csv contendo os dados de características foliares das angiospermas de dicotiledôneas lenhosas fósseis (ou seja, dados registrados na planilha de entrada de dados).
  4. Execute a função dilp() para reconstruções de temperatura média anual (MAT) e precipitação média anual (MAP) com erro associado. Os resultados para MAT e MAP são relatados a partir de um modelo de regressão linear múltipla (MLR; ou seja, DiLP) e dois modelos de regressão linear simples (SLR; ou seja, análise de área foliar e margem). Execute a função lma() para reconstruções de massa foliar por área (MA) nos níveis de morfotipo e local.
  5. Depois de executar dilp(), é recomendável verificar possíveis problemas de coleta de dados e confirmar a qualidade dos dados observando os outliers e objetos de erro nos resultados dilp() retornados. Como alternativa, use a função dilp_processing() seguida por dilp_outliers() e dilp_errors(). Resolva quaisquer problemas sinalizados referenciando a amostra preparada e potencialmente medindo-a novamente. Recomenda-se que o arquivo de dados original seja editado e, em seguida, relido novamente em R.
  6. Determine se o sítio fóssil se enquadra no espaço multivariado fisionômico da folha do conjunto de dados de calibração usando a função dilp_cca().

Resultados Representativos

Um conjunto de dados publicado anteriormente de medições de fisionomia foliar do sítio fóssil de McAbee do início do Eoceno no centro-sul da Colúmbia Britânica foi usado para fornecer um exemplo de resultados representativos usando os métodos de reconstrução de fisionomia foliar digital (DiLP) e massa foliar por área (MA) (Lowe et al.38; dados fornecidos no Arquivo Suplementar 2). O local oferece uma oportunidade para reconstruir o paleoclima e a paleoecologia durante o intervalo mais quente do Cenozóico (o Ótimo Climático do Eoceno Inferior) em uma paisagem montanhosa e vulcânica 38,45,46,47. As assembléias fósseis foram amostradas de dois horizontes separados em uma sequência lacustre, denominada H1 (28 cm de espessura) e H2 (27 cm de espessura), agrupadas em uma faixa estreita de estratigrafia usando uma técnica de censo, em que todos os espécimes capazes de receber um morfotipo foram coletados ou contados38,48.

Os dados fisionômicos da folha de McAbee passaram nas verificações de erro sinalizadas por dilp_errors() e sete outliers sinalizados por dilp_outliers() foram verificados duas vezes para garantir que os valores representem uma variação real nos dados e não um erro metodológico. Os dados foram posteriormente executados através da função dilp() para produzir paleoclima e da função lma() para reconstruções de massa foliar por área.

As reconstruções MA e os limites inferior e superior de seus intervalos de previsão de 95% são relatados na Tabela 4 tanto no nível da espécie quanto do local, usando equações apresentadas em Royer et al.5 e Butrim et al.10. Os valores reconstruídos estão dentro da faixa de MA típica para espécies terrestres modernas (30-330 g / m2) 49 . Usando os limiares discutidos em Royer et al.5, a maioria das espécies temum MA reconstruído que se alinha com a expectativa de vida foliar de <1 ano (≤87 g / m2), alguns ~ 1 ano (88-128 g / m2), enquanto nenhum é típico de > 1 ano (≥129 g / m2). As reconstruções do local M,A média e variância em McAbee refletem a prevalência e diversidade de estratégias econômicas foliares em um local10,50. Não há diferenças proeminentes entre a média do local e a variância entre H1 e H2 e, portanto, não há evidências de que a composição e a diversidade das estratégias econômicas foliares variaram entre os dois pontos no tempo. Além disso, as reconstruções sítio-médias feitas usando as equações de Royer et al.5 e Butrim et al.10 foram muito semelhantes.

As reconstruções da temperatura média anual (SAM) e da precipitação média anual (PAM) por meio das equações de regressão linear múltipla (DiLP) e regressão linear simples (análise da margem foliar e da área foliar) apresentadas em Peppe et al.6 são apresentadas na Tabela 5. As estimativas paleoclimáticas são inferidas de forma mais confiável se a fisionomia foliar das assembléias foliares fósseis ocorrer dentro do espaço fisionômico do conjunto de dados de calibração. Isso é avaliado por meio da etapa de análise de correspondência canônica (CCA) realizada pela função dilp_cca(). Tanto o McAbee H1 quanto o H2 se enquadram na faixa de fisionomia foliar observada no conjunto de dados de calibração (Figura 7A). Se os locais tiverem valores reconstruídos que caíram fora do espaço de calibração, as reconstruções paleoclimáticas devem ser interpretadas com cautela (por exemplo, por meio da comparação com linhas independentes de evidência; ver Peppe et al.6 para uma discussão mais aprofundada). MAT e MAP reconstruídos para H1 e H2 são consistentes com um bioma sazonal temperado (Figura 7B, C), o que concorda bem com linhas independentes de evidência, incluindo inferências baseadas em parentes vivos mais próximos das comunidades florais e de insetos fósseis em McAbee45.

figure-representative results-4750
Figura 1: Fisionomia da folha e terminologia arquitetônica ao longo deste artigo. (A) Uma folha com veios pinados, sem lóbulos e com margens inteiras, (B) uma folha com veios palmados, sem lóbulos e dentados, (C) uma folha com veios pinados, lobados e com margens inteiras, (D) uma folha com veios palmados, lobados e dentados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-representative results-5495
Figura 2: Fluxograma do método. Um fluxograma demonstrando como diferentes condições de preservação de folhas e tipos de folhas determinam que tipo geral de características foliares podem ser medidas de forma confiável (caixa amarela). Isso determina qual cenário de preparação será seguido no protocolo e em quais colunas os dados serão inseridos na planilha de entrada de dados (bullet points). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-representative results-6241
Figura 3: Diferentes cenários de preparação. Diferentes cenários de preparação demonstrando exemplos de imagens preparadas digitalmente completas prontas para a fase de medição. (A) Cenário 1, folha inteira com margens cuja área, ou meia área, não pode ser reconstruída, (B) Cenário 5, folha dentada cuja área, ou meia área, não pode ser reconstruída e não tem ≥2 dentes consecutivos e/ou ≥25% da folha preservada, (C) Cenário 2, folha inteira com margens cuja área, ou metade da área, é preservada ou pode ser reconstruída, (D) Cenário 3, uma folha dentada cuja área, ou meia área, não pode ser reconstruída, mas tem ≥2 dentes consecutivos e ≥25% da folha preservada, (E) Cenário 4, uma folha dentada cuja área, ou meia área, é preservada ou pode ser reconstruída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-representative results-7442
Figura 4: Ilustração da remoção de danos. Ilustrando como cortar a margem danificada e a área foliar adjacente a essa margem danificada. As linhas vermelhas tracejadas demonstram como as seleções são feitas com a ferramenta laço. Observe que os limites do dano foram iniciados intencionalmente nos seios dos dentes decíduos (consulte a Figura Suplementar 2 para ajudar a diferenciar os dentes decíduos dos subsidiários). (A) Uma folha com veios pinados onde a seleção é estendida até a nervura média. (B) Uma folha com veios palmados onde a seleção é estendida para a nervura primária mais próxima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-representative results-8441
Figura 5: Ilustrando um exemplo de como cortar dentes. (A) As linhas vermelhas tracejadas demonstram como as seleções são feitas com a ferramenta laço. Observe que, neste caso, os dentes são compostos, portanto, as seleções foram feitas apenas entre os seios decíduos (consulte a Figura Suplementar 2 para ajudar a diferenciar os dentes decíduos dos subsidiários), (B) uma perspectiva ampliada de como a seleção dos dentes foi feita, com pontos vermelhos representando onde o mouse foi clicado durante a seleção, (C) a cópia da folha quando os dentes são removidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-representative results-9424
Figura 6: Ilustração do cenário de preparação 4. Ilustração das decisões de preparação e etapas de medição para uma folha de exemplo preparada no cenário 4. (A) Um cenário de preparação em que foi decidido que uma meia folha fornecia a forma e as medidas de área da folha mais confiáveis, e margens preservadas em ambas as metades mediais foram incluídas para as medições dos dentes. (B) Um exemplo demonstrando quais variáveis são medidas em vários componentes da folha preparada. O texto em negrito destaca as medições necessáriaspara as análises DiLP e MA, enquanto o texto em negrito (perímetro da lâmina, Feret mínimo e perímetro médio artificial) destaca as medições que não são necessárias, mas úteis para caracterizações fisionômicas adicionais (por exemplo, fator de forma e compacidade; Tabela 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-representative results-10656
Figura 7: Resultados representativos. Resultados de dois horizontes fósseis (H1 e H2) amostrados nos leitos fósseis de McAbee do início do Eoceno de Lowe et al.38. (A) Análise de correspondência canônica mostrando a representação da fisionomia foliar multivariada no conjunto de dados de calibração. Os dados de calibração são de Peppe et al.6. A fisionomia foliar dos dois horizontes de McAbee é sobreposta e ocorre dentro do espaço de calibração. (B e C) Estimativas de temperatura e precipitação, e suas incertezas associadas (erros padrão dos modelos), usando equações apresentadas em Peppe et al.6 dos dois horizontes de McAbee sobrepostos em um diagrama do Bioma Whittaker. (B) Estimativas reconstruídas usando os modelos de regressões lineares múltiplas (MLR) da Fisionomia Digital da Folha (DiLP), (C) Estimativas reconstruídas usando as equações de regressão linear simples (SLR) de análise de área foliar (LAA) e análise de margem foliar (LMA) dos dois horizontes de McAbee sobrepostos em um diagrama do Bioma Whittaker. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Variáveis fisionômicas foliares. Variáveis que são medidas e/ou calculadas e aplicadas em modelos preditivos usando este protocolo para reconstruir a massa seca foliar por área (MA), temperatura média anual (MAT) e precipitação média anual (MAP). MAT e MAP são reconstruídos com equações apresentadas em Peppe et al.6 usando uma abordagem multivariada para Fisionomia Digital da Folha (DiLP) e abordagens univariadas para análise da margem foliar (LMA) e análise da área foliar (LAA). As variáveis listadas como Outras não são usadas nas análises MA, DiLP, LMA e LAA, mas ainda são medidas e calculadas usando este protocolo porque são fáceis de implementar e fornecem caracterizações úteis da fisionomia foliar. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Considerações e explicações adicionais para as etapas de preparação. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Considerações e explicações adicionais para medir etapas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Reconstruções da massa seca foliar por área (M, A) e limites superior e inferior associados dos intervalos de predição de 95% para leitos fósseis de McAbee de Lowe et al.38. As reconstruções são feitas para a média do morfotipo5, média do local 5,10 e variância do local10. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Reconstruções da precipitação média anual temperada (MAT) e média anual (MAP) para os Horizontes 1 (H1) e 2 (H2) nos leitos fósseis de McAbee do início do Eoceno usando as regressões lineares múltiplas (MLR) da Fisionomia Digital da Folha (DiLP) e as regressões lineares simples (SLR) da análise da margem foliar (LMA) e análise da área foliar (LAA) apresentadas em Peppe et al.6. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar 1: Folha de Quercus rubra da Harvard Forest ilustrando a regra do lobo vs. dente. Os segmentos de linha p e d são definidos no texto. Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Folha de Betula lutea da Floresta de Harvard ilustrando as regras para diferenciar dentes subsidiários de dentes decíduos. O segmento foliar isolado foi ampliado 2X. A linha azul conecta os seios com maior grau de incisão (ou seja, seios primários), e os dentes associados a esses seios são considerados primários (setas azuis). Os pontos vermelhos marcam os dentes que podem ser diferenciados como subsidiários porque seus seios apicais são incisados em menor grau. Os dentes denotados pelas setas vermelhas têm um grau de incisão semelhante em comparação com os dentes decíduos, mas podem ser identificados como subsidiários por uma veia principal calibrada relativamente mais fina em comparação com os dentes decíduos. Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Ilustração da seleção dentária, a regra do lobo pinado e a regra de prioridade do lobo. (A) Seleção de dentes para uma folha de Hamamelis virginiana da Huyck Preserve. As áreas escurecidas correspondem ao tecido foliar que é incluído na seleção total dos dentes porque os dentes subsidiários são diferenciados dos dentes decíduos. (B) A folha de Quercus alba do IES ilustra a regra da prioridade do lóbulo. As áreas escurecidas são medidas como lóbulos e as não escuras são medidas como dentes, mas todas as projeções são consideradas lóbulos por meio da regra de prioridade do lóbulo. Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Folha de Acer saccharum da Floresta Nacional de Allegheny ilustrando as regras de extensão e dentes solitários. As linhas tracejadas representam as seleções de dentes. A linha sólida representa o eixo de simetria do dente associado. A área preta é um peso usado para achatar as folhas para fotografia. Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 5: Ilustrando a maneira ideal de cortar um pecíolo posicionado no topo de uma base cordada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Modelo de entrada de dados para todas as variáveis de fisionomia da folha digital medidas. Esse arquivo não deve ser modificado, pois será usado como o arquivo de entrada para o pacote R. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Dados de exemplo de leitos fósseis de McAbee de Lowe et al.38. Esses dados foram utilizados para gerar a Figura 7 e para a discussão dos resultados representativos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Documento de regras para fisionomia foliar digital fóssil. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este artigo apresenta como características contínuas da fisionomia foliar podem ser medidas em folhas fósseis de angiospermas dicotiledôneas lenhosas e posteriormente aplicadas a proxies desenvolvidos a partir de dados modernos de calibração para reconstruir o paleoclima e a paleoecologia. Isso requer que se tome cuidado para alinhar as etapas metodológicas com aquelas representadas nos conjuntos de dados de calibração proxy 5,6,10. Essa consideração começa antes da aplicação deste protocolo durante a coleta de folhas fósseis, particularmente no que diz respeito ao tamanho da amostra. Recomenda-se agrupar assembléias de folhas fósseis em uma faixa de estratigrafia tão estreita quanto possível para obter um número adequado de espécimes e morfotipos mensuráveis para minimizar a média do tempo. Limitar a reconstrução paleoclimática a locais com pelo menos 350 espécimes identificáveis e pelo menos 15-20 morfotipos de angiospermas dicotiledôneas lenhosas também é recomendado 19,51,52. Além disso, ao escolher folhas para análises, recomenda-se medir o maior número possível de folhas por morfotipo e, no mínimo, escolher espécimes que representem a variabilidade da fisionomia foliar dentro de um morfotipo.

Deve-se tomar cuidado adicional ao implementar as seções de preparação e medição para permanecer consistente com o conjunto de dados de calibração. As etapas realizadas durante as etapas de preparação têm maior potencial de subjetividade e resultados variados entre os usuários. No entanto, se o protocolo for seguido deliberadamente e as tabelas de considerações adicionais (Tabela 2, Tabela 3) e o documento de regras (Arquivo Suplementar 3) forem referenciados com frequência, esse método resultará em medições objetivas e reprodutíveis da fisionomia foliar. Para usuários novos no método, sugere-se confirmar se as folhas foram preparadas corretamente com alguém com mais experiência. Cuidados especiais devem ser tomados ao medir a largura do pecíolopara reconstruções MA. Como esses valores são elevados ao quadrado, a imprecisão nas medições se tornará exagerada. A preservação e os danos incompletos podem alterar as dimensões do pecíolo e devem ser evitados com cuidado.

Existem algumas limitações para esses métodos que valem a pena observar. Mais importante ainda, as reconstruções proxy incluídas no pacote dilp R são apenas para angiospermas dicotiledôneas lenhosas e, portanto, podem excluir outros grupos de plantas que eram componentes proeminentes de comunidades antigas. No entanto, proxies adicionais baseados em pecíolos foliares para MA em nível de espécie foram publicados para gimnospermas pecioladas e de folha larga 5,8, angiospermas herbáceas8 e samambaias9, que um usuário pode incorporar separadamente, se desejar. A exclusão de grupos de plantas proeminentes em comunidades além das angiospermas dicotiledôneas lenhosas é provavelmente mais impactante para as reconstruções da média e variância de MA no nível do local, pois fornecerão uma perspectiva incompleta das estratégias econômicas em toda a comunidade. A história filogenética influencia a ocorrência de dentes foliares23, introduzindo o potencial de que a análise de comunidades fósseis com nova composição taxonômica pode conferir incerteza nas estimativas resultantes, embora a realização dessa influência potencial ainda não tenha sido testada e demonstrada.

As folhas fósseis também precisam ser adequadamente preservadas para incorporar medidas quantitativas da fisionomia foliar além do estado de margem. Para DiLP, isso é especialmente verdadeiro para folhas com margens inteiras, pois elas só podem contribuir com informações além do estado de margem se a folha inteira, ou meia folha, for preservada ou puder ser reconstruída. Da mesma forma, as folhas só podem ser incorporadas em reconstruções MA se (1) ambos os pecíolos em sua inserção na lâmina foliar forem preservados ou, em casos específicos, se a base da folha e a porção mais basal da nervura média forem preservadas (ver Nota na etapa 3.6) e (2) se o tamanho da folha puder ser estimado, seja por meio de medição de folhas inteiras ou reconstrução de meia folha. Isso significa que alguns morfotipos podem ser excluídos completamente das análises de MA no nível do local. Por fim, o tempo é uma limitação deste protocolo, pois as alternativas univariadas para reconstruções paleoclimáticas levam comparativamente menos tempo para serem produzidas.

Apesar dessas limitações, o uso dos métodos de reconstrução DiLP e MA ainda apresenta várias vantagens sobre outros métodos. As reconstruções de MA são uma das únicas maneiras de reconstruir as estratégias econômicas das folhas no registro fóssil, e o uso de medidas bidimensionais de largura do pecíolo e área foliar permite que as reconstruções sejam feitas usando fósseis de folhas comuns de impressão/compressão. Para o DiLP, a incorporação de múltiplas medições contínuas que estão funcionalmente ligadas ao clima melhora a reprodutibilidade das medições e a precisão das reconstruções climáticas resultantes 6,13. Este protocolo foi projetado para acomodar a natureza incompleta do registro fóssil, permitindo que as medições de dentibilidades foliares sejam feitas usando fragmentos de folhas. Embora as medições contínuas da área foliar forneçam mais informações sobre o tamanho da folha, as estimativas do DiLP MAP podem ser complementadas por aquelas que usam classes de tamanho de folha em um esforço para aumentar o tamanho da amostra16,53 ou através da incorporação de estimativas de raspagem de nervuras da área foliar 42,54,55. Tal como acontece com a maioria dos métodos envolvidos, a eficiência de tempo deste protocolo melhorará à medida que o usuário se tornar mais experiente e confiante, principalmente nas etapas de preparação. O fato de as medições de DiLP em nível de local terem sido feitas seguindo este protocolo para >150 modernas 6,10,56 e pelo menos 22 assembléias fósseis até o momento atestam sua viabilidade 6,38,39,40,41,42. Por fim, medições abrangentes da fisionomia foliar têm aplicações além daquelas discutidas aqui e podem ser úteis na descrição de outros aspectos da ecologia, fisiologia, evolução e desenvolvimento das plantas, com aplicação aos estudos modernos56 e paleo40.

Em resumo, a implementação dos métodos detalhados neste artigo permite ao usuário reconstruir o paleoclima e a paleoecologia usando métodos robustos e reprodutíveis. Esses métodos fornecem uma oportunidade importante para mostrar exemplos anteriores de respostas climáticas e ecossistêmicas a perturbações ambientais e fornecer mais informações sobre as complexas interações dos sistemas naturais da Terra.

Divulgações

Nenhum.

Agradecimentos

A AJL agradece à Equipe Leaf de graduação de 2020-2022 da Universidade de Washington pela motivação e sugestões para criar materiais de treinamento eficazes para o DiLP. AGF, AB, DJP e DLR agradecem aos muitos alunos de graduação da Wesleyan University e da Baylor University que mediram folhas modernas e fósseis e cuja contribuição foi inestimável na modificação e atualização deste protocolo. Os autores agradecem ao Grupo de Trabalho de Traços Quantitativos do PBot e à equipe do PBOT por incentivar o trabalho de formalizar este protocolo para torná-lo mais acessível a comunidades mais amplas. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (concessão EAR-0742363 para DLR, concessão EAR-132552 para DJP) e Baylor University (Programa de Desenvolvimento de Jovens Investigadores para DJP). Agradecemos a dois revisores anônimos e ao Editor de Revisão pelo feedback que ajudou a melhorar a clareza e a abrangência deste protocolo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Copy stand or tripodFor fossil photography
Digital cameraFor fossil photography, high resolution camera preferred
Image editing software For digital preperation. Examples include Adobe Photoshop and GIMP, the latter of which is free (https://www.gimp.org/)
ImageJ softwareIJ1.46prFor making digital measurments, free software (https://imagej.net/ij/index.html)
Microsoft ExcelMicrosoftOr similar software for data entry
R softwareThe R foundationFor running provided R script (https://www.r-project.org/). R studio offers a user friendly R enviornment (https://posit.co/download/rstudio-desktop/). Both are free.
dilp R PackageCan be installed following instructions here: https://github.com/mjbutrim/dilp

Referências

  1. Gates, D. M. Transpiration and leaf temperature. Ann Rev Plant Physiol. 19 (1), 211-238 (1968).
  2. Givnish, T. On the adaptive significance of leaf form. Topics Plant Pop Biol. , 375-407 (1979).
  3. Niklas, K. J. . Plant biomechanics: an engineering approach to plant form and function. , (1992).
  4. Niklas, K. J. . Plant Allometry: The Scaling of Form and Process. , (1994).
  5. Royer, D. L., et al. Fossil leaf economics quantified: Calibration, Eocene case study, and implications. Paleobiology. 33 (4), 574-589 (2007).
  6. Peppe, D. J., et al. Sensitivity of leaf size and shape to climate: global patterns and paleoclimatic applications. New Phytol. 190 (3), 724-739 (2011).
  7. Wright, I. J., et al. The worldwide leaf economics spectrum. Nature. 428 (6985), 821-827 (2004).
  8. Royer, D. L., Miller, I. M., Peppe, D. J., Hickey, L. J. Leaf economic traits from fossils support a weedy habit for early angiosperms. Am J Botany. 97 (3), 438-445 (2010).
  9. Peppe, D. J., et al. Biomechanical and leaf-climate relationships: a comparison of ferns and seed plants. Am J Botany. 101 (2), 338-347 (2014).
  10. . dilp: Reconstruct paleoclimate and paleoecology with leaf physiognomy. R package version 1.1.0 Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dilp/index.html (2024)
  11. Bailey, I. W., Sinnott, E. W. A botanical index of Cretaceous and Tertiary climates. Science. 41 (1066), 831-834 (1915).
  12. Bailey, I. W., Sinnott, E. W. The climatic distribution of certain types of angiosperm leaves. Am J Botany. 3 (1), 24-39 (1916).
  13. Peppe, D. J., Baumgartner, A., Flynn, A. G., Blonder, B. Reconstructing paleoclimate and paleoecology using fossil leaves. Meth Paleoecol: Reconstructing Cenozoic Terre Environ Ecol Comm. , 289-317 (2018).
  14. Wolfe, J. A. . Temperature parameters of humid to mesic forests of eastern Asia and relation to forests of other regions of the Northern Hemisphere and Australasia. , (1979).
  15. Wilf, P. When are leaves good thermometers? A new case for Leaf Margin Analysis. Paleobiology. 23 (3), 373-390 (1997).
  16. Wilf, P., Wing, S. L., Greenwood, D. R., Greenwood, C. L. Using fossil leaves as paleoprecipitation indicators: An Eocene example. Geology. 26 (3), 203-206 (1998).
  17. Miller, I. M., Brandon, M. T., Hickey, L. J. Using leaf margin analysis to estimate the mid-Cretaceous (Albian) paleolatitude of the Baja BC block. Earth Planetary Sci Lett. 245 (1), 95-114 (2006).
  18. Wing, S. L., Greenwood, D. R. Fossils and fossil climate: The case for equable continental interiors in the Eocene. Philosophical Transact: Biol Sci. 341 (1297), 243-252 (1993).
  19. Wolfe, J. A. A method of obtaining climatic parameters from leaf assemblages. U S Geol Sur. (2040), 1-71 (1993).
  20. Huff, P. M., Wilf, P., Azumah, E. J. Digital future for paleoclimate estimation from fossil leaves? Preliminary results. Palaios. 18 (3), 266-274 (2003).
  21. Spicer, R. A. Recent and future developments of CLAMP: Building on the legacy of Jack A. Wolfe. Adv Angiosperm Paleobotany Paleoclimatic Reconstruct. 258, 109-118 (2007).
  22. Yang, J., Spicer, R. A., Spicer, T. E. V., Li, C. S. CLAMP Online': a new web-based palaeoclimate tool and its application to the terrestrial Paleogene and Neogene of North America. Palaeobiodivers Palaeoenviron. 91 (3), 163-183 (2011).
  23. Little, S. A., Kembel, S. W., Wilf, P. Paleotemperature proxies from leaf fossils reinterpreted in light of evolutionary history. PLoS One. 5 (12), e15161 (2010).
  24. Webb, L. J. A physiognomic classification of Australian rain forests. J Ecol. 47 (3), 551-570 (1959).
  25. Schmerler, S. B., et al. Evolution of leaf form correlates with tropical-temperate transitions in Viburnum (Adoxaceae). Proc Royal Soci B: Biol Sci. 279 (1744), 3905-3913 (2012).
  26. Nicotra, A. B., et al. The evolution and functional significance of leaf shape in the angiosperms. Funct Plant Biol. 38 (7), 535-552 (2011).
  27. Leigh, A., Sevanto, S., Close, J. D., Nicotra, A. B. The influence of leaf size and shape on leaf thermal dynamics: does theory hold up under natural conditions. Plant Cell Environ. 40 (2), 237-248 (2017).
  28. Wright, I. J., et al. Global climatic drivers of leaf size. Science. 357 (6354), 917-921 (2017).
  29. Givnish, T. J. Leaf and canopy adaptations in tropical forests. Physiol Ecol Plants Wet Tropics. 12, 51-84 (1984).
  30. Feild, T. S., Sage, T. L., Czerniak, C., Iles, W. J. Hydathodal leaf teeth of Chloranthus japonicus (Chloranthaceae) prevent guttation-induced flooding of the mesophyll. Plant, Cell Environ. 28 (9), 1179-1190 (2005).
  31. Royer, D. L., Wilf, P. Why do toothed leaves correlate with cold climates? Gas exchange at leaf margins provides new insights into a classic paleotemperature proxy. Int J Plant Sci. 167 (1), 11-18 (2006).
  32. Edwards, E. J., Spriggs, E. L., Chatelet, D. S., Donoghue, M. J. Unpacking a century-old mystery: Winter buds and the latitudinal gradient in leaf form. Botanical Soc Am. 103 (6), 975-978 (2016).
  33. Givnish, T. J., Kriebel, R. Causes of ecological gradients in leaf margin entirety: Evaluating the roles of biomechanics, hydraulics, vein geometry, and bud packing. Am J Botany. 104 (3), 354-366 (2017).
  34. Royer, D. L., Wilf, P., Janesko, D. A., Kowalski, E. A., Dilcher, D. L. Correlations of climate and plant ecology to leaf size and shape: potential proxies for the fossil record. Am J Botany. 92 (7), 1141-1151 (2005).
  35. Green, W. A. Loosening the CLAMP: an exploratory graphical approach to the climate leaf analysis multivariate program. Palaeontol Electro. 9 (2), 19 (2006).
  36. Peppe, D. J., Royer, D. L., Wilf, P., Kowalski, E. A. Quantification of large uncertainties in fossil leaf paleoaltimetry. Tectonics. 29 (3), 002549 (2010).
  37. Royer, D. L., Meyerson, L. A., Robertson, K. M., Adams, J. M. Phenotypic plasticity of leaf shape along a temperature gradient in Acer rubrum. PLoS One. 4 (10), e7653 (2009).
  38. Lowe, A. J., et al. Plant community ecology and climate on an upland volcanic landscape during the early Eocene climatic optimum: McAbee fossil beds, British Columbia, Canada. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 511, 433-448 (2018).
  39. Flynn, A. G., Peppe, D. J. Early Paleocene tropical forest from the Ojo Alamo Sandstone, San Juan Basin, New Mexico, USA. Paleobiology. 45 (4), 612-635 (2019).
  40. Allen, S. E., Lowe, A. J., Peppe, D. J., Meyer, H. W. Paleoclimate and paleoecology of the latest Eocene Florissant flora of central Colorado, U.S.A. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 551, 109678 (2020).
  41. Baumgartner, A., Peppe, D. J. Paleoenvironmental changes in the Hiwegi Formation (lower Miocene) of Rusinga Island, Lake Victoria, Kenya. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 574, 110458 (2021).
  42. Wagner, J. D., Peppe, D. J., O'keefe, J. M., Denison, C. N. Plant community change across the Paleocene-Eocene boundary in the Gulf coastal plain, Central Texas. Palaios. 38 (10), 436-451 (2023).
  43. Ellis, B., et al. . Manual of leaf architecture. , (2009).
  44. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9, 671-675 (2012).
  45. Greenwood, D. R., Pigg, K. B., Basinger, J. F., DeVore, M. L. A review of paleobotanical studies of the Early Eocene Okanagan (Okanogan) Highlands floras of British Columbia, Canada, and Washington, USA. Canadian J Earth Sci. 53 (6), 548-564 (2016).
  46. Lowe, A. J., West, C. K., Greenwood, D. R. Volcaniclastic lithostratigraphy and paleoenvironment of the lower Eocene McAbee fossil beds, Kamloops Group, British Columbia, Canada. Canadian J Earth Sci. 55 (8), 923-934 (2018).
  47. Lowe, A. J., et al. Dynamics of deposition and fossil preservation at the early Eocene Okanagan Highlands of British Columbia, Canada: insights from organic geochemistry. Palaios. 37 (5), 185-200 (2022).
  48. Gushulak, C. A. C., West, C. K., Greenwood, D. R. Paleoclimate and precipitation seasonality of the Early Eocene McAbee megaflora, Kamloops Group, British Columbia. Canadian J Earth Sci. 53 (6), 591-604 (2016).
  49. Poorter, H., Niinemets, &. #. 2. 2. 0. ;., Poorter, L., Wright, I. J., Villar, R. Causes and consequences of variation in leaf mass per area (LMA): a meta-analysis. New Phytol. 182 (3), 565-588 (2009).
  50. Enquist, B. J., et al. Scaling from traits to ecosystems. Adv Ecol Res. 52, 249-318 (2015).
  51. Burnham, R. J., Wing, S. L., Parker, G. G. The reflection of deciduous forest communities in leaf litter: implications for autochthonous litter assemblages from the fossil record. Paleobiology. 18 (1), 30-49 (1992).
  52. Burnham, R. J., Ellis, B., Johnson, K. R. Modern tropical forest taphonomy: does high biodiversity affect paleoclimatic interpretations. PALAIOS. 20 (5), 439-451 (2005).
  53. Jacobs, B. F. Estimation of low-latitude paleoclimates using fossil angiosperm leaves: examples from the Miocene Tugen Hills, Kenya. Paleobiology. 28 (3), 399-421 (2002).
  54. Sack, L., et al. Developmentally based scaling of leaf venation architecture explains global ecological patterns. Nat Comm. 3 (1), 837 (2012).
  55. Merkhofer, L., et al. Resolving Australian analogs for an Eocene Patagonian paleorainforest using leaf size and floristics. Am J Botany. 102 (7), 1160-1173 (2015).
  56. Baumgartner, A., Donahoo, M., Chitwood, D. H., Peppe, D. J. The influences of environmental change and development on leaf shape in Vitis. Am J Botany. 107 (4), 676-688 (2020).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Ci ncias AmbientaisEdi o 212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados