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要約

提示されたプロトコルは、デジタル葉の人相と面積あたりの葉の質量の再構築方法を使用して古気候と古生態学を再構築するために、化石の葉の連続的な葉の生理学的形質のデジタル測定と分析を示しています。

要約

気候と環境は、植物の葉のサイズ、形状、歯の開き具合(人相)に強く影響します。これらの関係、特に木質の非単子葉植物の被子植物では、地球の歴史の過去~1億2000万年にわたる古代の陸生生態系の再構築に適用された古気候と古生態学の葉ベースのプロキシを開発するために使用されてきました。さらに、これらの関係が生きている植物で文書化されていることを考えると、植物の進化の側面や、植物が気候や環境の変化にどのように反応するかを理解するために重要です。現生植物と化石植物についてこの種の分析を行うには、再現可能な方法論を用いて葉の人相を正確に測定する必要があります。このプロトコルは、現代の葉と化石の葉のさまざまな葉の生理学的変数を測定および分析するためのコンピューターベースの方法を説明しています。この方法では、葉の生理学的形質、特に古気候を再構築するためのデジタル葉の人相学プロキシで使用される葉の鋸歯状、葉の面積、葉の解剖、および線形性に関連する変数、および古生態学的なプロキシである面積あたりの葉の質量を再構築するために使用される葉柄の幅と葉の面積の測定が可能になります。このデジタル葉形質測定法は、化石植物や現生植物に適用できるため、古気候の再構築や古生態学に関連するアプリケーションに限定されません。また、葉の形態の機能、葉の発達、葉の形質の系統関係、および植物の進化を理解するのに役立つ可能性のある葉の形質を探索するためにも使用できます。

概要

葉は、植物とその周辺環境との間のエネルギー(光、熱など)と物質(二酸化炭素、水蒸気など)の交換を容易にする基本的な生産単位である1,2。これらの機能を果たすためには、葉は静止した風の強い空気の中で、自重を重力に対して機械的に支えなければならない3,4。これらの固有の関連性により、葉のサイズ、形状、歯の開き方(人相学)のいくつかの側面は、葉の機能と生体力学の詳細を反映し、それらの環境と生態学への洞察を提供します。先行研究は、現代世界全体の葉の人相学、気候、および生態学の間の関係を定量化して、化石の葉の群集に適用できるプロキシを確立しました5,6。これらのプロキシは、古気候と古生態学を再構築する重要な機会を提供し、その歴史を通じて地球のさまざまなシステム間の複雑な相互作用をより深く理解することに貢献します。この記事では、1)古生態学を解明するための面積あたりの葉の質量の再構築方法と、2)古気候を再構築するためのデジタル葉の人相学の2つのプロキシを使用するために必要な方法について詳しく説明します。

面積あたりの葉の乾燥質量(MA)は、新植物学と古植物学の両方で頻繁に測定される植物形質です。MAの主な価値は、特に化石の再構築において、葉の光合成速度、葉の寿命、および質量7による葉の栄養素含有量を含む、よく相関する葉形質の協調軸である葉の経済スペクトルの一部であることです。化石から MAを再構築する能力は、他の方法ではアクセスできないこれらの代謝および化学プロセスへの窓を提供し、最終的には植物の生態学的戦略と生態系機能に関する有用な情報を明らかにすることができます。

Royerら5は、葉身の面積と葉柄の幅に基づいて、木質の非単子葉植物(双子葉植物)被子植物の化石葉のMAを推定する方法を開発しました。理論的には、葉柄は片持ち梁として機能し、葉の重量を最適な位置に保持します3,4。したがって、ビーム強度の最も重要な要素を構成する葉柄の断面積は、葉の質量と強く相関しているはずです。葉柄の形状を円筒形のチューブに単純化することにより、葉柄の断面積を葉柄の幅の2乗で表すことができ、葉の質量を2次元の化石から推定することができます(詳細については、Royer et al.5を参照)。葉の面積を直接測定できます。一緒に、葉柄の幅を葉の面積で割ったもの(つまり、葉柄のメートル法。表1)化石MAの優れた代理を提供し、古植物学者が現代の形質ベースの生態学に足を踏み入れることを可能にします。また、M Aの再構成法は、広葉樹および葉柄の裸子植物5,8、草本被子植物8、シダ9にも拡大され、木本双子葉植物の被子植物で観察された関係とは異なる関係を生み出し、互いに異なる関係を生み出した。拡張されたウッディダイコットデータセットと、サイトレベルでのMAの分散と平均を再構築するための新しい回帰方程式により、化石植物相10のウッディダイコット被子植物の中で、葉の経済戦略の多様性と最も普及している戦略の推論が可能になります。

人相学的な葉の形質とその気候との関係は、1世紀以上にわたって注目されてきました11,12。具体的には、木本双子葉植物の被子植物の葉の人相は、温度および水分と強く相関している13。この関係は、陸生古気候の多数の単変量14,15,16,17および多変量6,18,19,20,21,22葉の生理学的プロキシの基礎を形成しています。単変量および多変量葉の生理学的古気候法は、地球の歴史の過去~1億2000万年(白亜紀から現代)にわたるすべての大陸の被子植物優位の化石植物相に広く適用されてきた23。

葉の生理学的な古気候プロキシで利用される2つの基本的な観察結果は、1)葉のサイズと平均年間降水量(MAP)との関係、および2)葉の歯(つまり、葉縁の外向きの投影)と平均年間気温(MAT)との関係です。具体的には、ある地域におけるすべての木本双子植物被子植物種の平均葉サイズはMAPと正の相関があり、歯のある葉を持つ地域における木本二子葉植物被子植物種の割合は、歯のサイズと数に加えて、MAT6,12,13,14,15,16,24と負の相関があります。

これらの葉の人相と気候の関係との間の機能的な関連性は、理論と観察の両方によって強く支持されています1,2,25。例えば、葉が大きいほど光合成表面積は大きくなりますが、葉はより大きな支持を必要とし、蒸散によってより多くの水分を失い、境界層が厚いため、より顕熱を保持します1,26,27。したがって、蒸散量の増加による水分損失が葉を効果的に冷却し、問題が少ないため、より大きな葉はより湿った、より暑い環境でより一般的です。対照的に、乾燥した暑い気候の小さな葉は、水の損失を減らし、代わりに顕熱損失を増加させることにより過熱を回避します28,29。どの因子、または因子の組み合わせが機能的関連性の説明に最も強く寄与するかの詳細は、他の葉の形質については謎のままです。例えば、葉の冷却、効率的な芽のパッキング、細い葉の支持と供給の強化、ヒダソードによるガットーション、およびシーズン初期の生産性の向上など、葉の歯とMATの関係を説明するためにいくつかの仮説が提案されている30,31,32,33。

ほとんどの葉の生理学的古気候プロキシは、連続変数の定量的測定ではなく、葉の形質のカテゴリー分割に依存しており、いくつかの潜在的な欠点につながります。カテゴリーカルアプローチは、気候と強く相関する連続測定によって取得されたより詳細な情報(例えば、歯の数、葉の直線性)の組み込みを除外し、古気候の推定6,20,34の精度を低下させる可能性があります。さらに、一部の葉形質のスコアリング方法では、カテゴリ別に採点される形質があいまいになり、再現性の問題につながる可能性があり、一部の形質は、気候への機能的なリンクを裏付ける経験的証拠が限られています6,15,16,35,36。

これらの欠点に対処するために、Huff et al.20は、デジタル葉の人相学(DiLP)として知られる方法で連続的な葉の形質をデジタルで測定することを提案しました。DiLPが従来の方法と比較した場合の主な利点は、1)ユーザー間で確実に測定できること、2)本質的に連続的であること、3)気候に機能的に関連していること、4)生育期間で表現型の可塑性を示すこと、という形質に依存していることである6,37。これにより、MATとMAPの推定は、以前の葉の生理学的古気候法よりも正確になりました6。さらに、この方法は、損傷した葉や不完全な葉を説明する手順を提供することにより、化石記録の不完全な性質に対応します。DiLP法は、地質時代の広い範囲にまたがる複数の大陸からのさまざまな化石植物相にうまく適用されています6,38,39,40,41,42。

次のプロトコルは、以前の研究5,6,20,34で説明したプロトコルの拡張です。DiLPおよびMA再構成法を使用して、木質双子葉植物の被子植物の化石の葉から古気候および古生態学を再構築するために必要な手順を説明します(このプロトコルを使用して測定および計算された変数の説明については、表1を参照してください)。さらに、このプロトコルは、DiLPまたはMA分析に含まれない葉の形質を記録および計算する手順を提供しますが、実装が容易で、葉の人相の有用な特性評価を提供します(表1)。プロトコルは次の形式に従います:1)化石の葉をイメージングします。2)葉のデジタル準備、5つの可能な準備シナリオに整理されています。3)葉のデジタル測定は、同じ5つの可能な準備シナリオに整理されています。4)Rパッケージdilp10を使用したDiLPおよびMA分析。

MA再構成のプロトコルは、両方が互いに並行して準備および測定するのに便利であるため、DiLPプロトコルに組み込まれています。MA解析のみに関心がある場合は、葉の縁が歯付きであるかどうかのDiLP調製シナリオ2で説明されている準備手順と、葉柄の幅、葉柄の面積、葉の面積の測定のみを説明する測定手順に従う必要があります。その後、ユーザーは mA 再構成を実行する dilp R パッケージ内の適切な関数を実行できます。

プロトコル

1. 化石葉のイメージング

  1. 葉の化石をカメラの下に置き、化石の下に挟み込むためのサンドボックスやパテなどを使用して、できるだけ平らに横たわっていることを確認します。
    注:1つのブロックで複数の標本を撮影する場合は、化石の細部が明確でシャープであることを確認するために、それらを別々にクローズアップして撮影するのが最善です。また、化石を黒のフェルトやベルベットなどの固い暗いつや消しの背景に配置すると便利です。
  2. スケールバーを水平に、葉と同じ垂直面に配置し、化石の近くに置きますが、化石の一部を覆わないようにします。化石を囲むマトリックスがほとんどまたはまったくない場合は、スケールをフォトフレーム内に配置し、焦点を合わせる必要があります。
  3. カメラの三脚またはコピースタンドを使用して、レンズを岩の表面と平行にして、カメラを化石の葉の真上に配置します。葉のディテールを鮮明に捉えるには、レンズ/カメラの焦点距離内にとどまり、化石全体が写真のフレーム内にあることを確認しながら、カメラを化石にできるだけ近づけます。
    注:可能であれば、高解像度のデジタルカメラと、マニュアルフォーカスと処理する葉に鮮明に焦点を合わせるのに十分な被写界深度を備えたマクロレンズを使用するのが最善です。
  4. 間接光を使用して、必要に応じて化石に光を当て、標本の全体の輪郭をはっきりと見ることができます。多くの場合、化石ごとに照明を再調整する必要があります。
  5. 化石の葉を撮影し、画像ファイルに適切なラベルを付けます。

2. デジタル準備

注:これらのプロトコル全体で使用されるリーフアーキテクチャ用語の図を 図1に示します。決定木(図2)と提供された例(図3)を使用して、測定する化石葉にどの準備シナリオが適用できるかを判断し、その適切なセクションに進みます。調製手順のその他の考慮事項については、 表2 を参照してください。葉がシナリオ1または5に該当する場合、葉は定量的な葉の人相測定のために準備できません。

  1. シナリオ 2: 余白のある葉全体 (半分の面積) が保持されているか、再構築できる。
    1. 画像処理ソフトウェア(Adobe PhotoshopやGIMPなど)でファイルを開きます。必要に応じて画像を切り抜くと、最終的なファイルサイズを縮小するのに役立ちますが、スケールバーは引き続き含まれるようになります。
    2. [ 画像] > [キャンバス] をクリックして、作業領域の幅を 2 倍にします (Photoshop)。画像はキャンバスサイズ(GIMP)>。現在のキャンバスの右側または左側に新しいキャンバスを追加することをお勧めします。
    3. 葉の縁に再構築が必要な場合は、葉の面積と形状を半分の葉と全体の葉のどちらからより確実に測定できるかを決定します(図3)。
    4. 岩石マトリックスから葉をコピーします。なげなわツールを使用して、葉柄がある場合は葉柄を含む葉全体または半分をトレースします( 表2を参照)。選択範囲をコピーして貼り付け、キャンバスの空き領域に配置します。この選択範囲のコピーを 2 つ貼り付け、1 つは未編集のものにして、準備プロセスを再開する必要がある場合は戻します。
    5. 適切な色の線を使用して、マージンの損傷した部分を修復します(通常は白い背景の場合は黒)。損傷した余白にまたがる線を描画して、余白が確実に再構築されるようにします。これは、ペイントブラシや線ツールなどを使用して行います。線が見えるほど太く(~1-2 pt の太さ)、損傷した領域のマージンを接続していることを確認してください。
    6. なげなわツールを使用して、葉柄が存在する場合は、葉柄を葉から取り除きます。
      1. 視覚的には、葉の縁に沿って葉の縁をたどり、葉柄が葉柄に接触する点まで進みますが、葉柄は色が濃く、特徴的な葉脈はありません。そこになげなわポイントを置きます。葉の残りの半分でも同じことを行い、そこに2番目のポイントを配置します。
        注:葉の基部が対称の場合、線は葉柄に対して~垂直になります。非対称の場合、線は斜めになります。
      2. 葉柄全体を囲んで選択を終了します。カットアンドペースト、または移動ツールを使用して、葉柄を葉身の隣に配置しますが、触れないようにします。
        注:コルデートまたは葉状の葉の基部の場合、つまり、基部が葉柄が葉身に付着する場所の下に伸びている場合、葉柄は葉柄が葉身に付着する場所の下の葉の基部に留まる可能性があります。葉柄が実際に付着しているところを切り取り、葉柄の縁をしっかりとなぞり、傷んだ縁を修復するように注意してください。これはほとんどの化石では見づらいかもしれないと認識されています。
    7. 必要に応じて、画像の最後の領域を切り抜いて、ファイルサイズを縮小します。完成した準備済みイメージの表示例については、 図 3 を参照してください。
  2. シナリオ 3: 歯のある葉の面積 (半分) は再構築できないが、2 本の連続した歯が≥、葉の ≥25% が保存されている
    注:歯の測定は、このカテゴリの葉で測定できる唯一の特性であるため、葉はこれらの測定のためだけに準備されます。
    1. 画像処理ソフトウェア(Adobe PhotoshopやGIMPなど)でファイルを開きます。必要に応じて画像をトリミングすると、最終的なファイルサイズを縮小できますが、スケールバーは引き続き含まれていることを確認できます。
    2. [ 画像] > [キャンバス ] (Photoshop) をクリックして、作業領域の幅を 4 倍にするトライします。 画像はキャンバスサイズ (GIMP)>。現在のキャンバスの右側または左側に新しいキャンバスを追加することをお勧めします。
    3. 岩石マトリックスから葉をコピーします。なげなわツールを使用して、葉柄が存在する場合は葉柄を含む、保存された葉の範囲をトレースします。マージンの損傷した部分を正確にトレースする心配はありません。選択範囲をコピーして貼り付け、キャンバスの空き領域に配置します。この選択範囲のコピーを 2 つ貼り付け、1 つは未編集のバージョンにして、準備プロセスを再開する必要がある場合に戻すことを検討してください。
    4. 存在する場合は、なげなわツールを使用して葉柄を葉から取り除きます。
      1. 視覚的には、葉の縁に沿って葉の縁をたどり、葉柄が葉柄に接触する点まで進みますが、葉柄は色が濃く、特徴的な葉脈はありません。そこになげなわポイントを置きます。葉の残りの半分でも同じことを行い、そこに2番目のポイントを配置します。
        注:葉の基部が対称の場合、線は葉柄に対して~垂直になり、非対称の場合、線は斜めになります。
      2. 葉柄全体を囲んで選択を終了します。カットアンドペースト、または移動ツールを使用して、葉柄を葉身の隣に配置しますが、触れないようにします。
        注:コルデートまたは葉状の葉の基部の場合、つまり、基部が葉柄が葉身に付着する場所の下に伸びている場合、葉柄は葉柄が葉身に付着する場所の下の葉の基部に留まる可能性があります。葉柄が実際に付着しているところを切り取り、葉柄の縁をしっかりとなぞり、傷んだ縁を修復するように注意してください。これは、ほとんどの化石では見づらいかもしれません。
    5. なげなわツールを使用して、マージンの損傷した部分に隣接する領域を削除します。
      1. 損傷した部分を囲むマージンに沿った点から選択を開始し、その点からその主静脈に垂直な主静脈まで直線を描きます(図4)。損傷に最も近い保存された主歯洞から選択を開始します。これにより、歯の側面がその後の測定で内部周囲として含まれず、補助歯が主歯であるかのように測定されることがなくなります。歯の間隔が離れている場合は、保存されているマージンが多すぎると最終的に除去される可能性があるため、これは適切ではない可能性があります(図4)。
      2. 損傷したマージンの他の境界と同じ高さになるまで、メジャー静脈に沿って選択を進め、マージンに対してメジャー静脈に垂直な直線を引きます(図4)。
        注:羽状の葉(図1A)の場合、アグロフィック静脈の有無にかかわらず(Ellis et al.43を参照)、主要な静脈は主要な静脈(つまり、中静脈)です。掌状に縞模様の葉(図1B、D)の場合、主静脈は最も近い一次静脈です(例: 図4B)。羽状葉の場合(図1C)、損傷が羽状葉にある場合、主静脈は葉に栄養を供給する静脈(通常は二次静脈)です。
      3. 選択を完了し、リーフのこの部分を削除します。葉のすべての損傷した部分について繰り返します。
    6. この準備した葉をコピーして貼り付け、キャンバスの空き領域に配置します。
    7. なげなわツールを使用して歯を取り除きます。
      1. 葉の頂点、葉の頂端の1つ、または葉の断片の最も頂端の歯から始めて、その葉、葉、または断片に沿った各主歯洞で選択します(図5;主歯と副歯を区別する方法、および歯と葉を区別する方法については 、補足図1、補足図2 を参照)。歯を抜くときは、適切なルールに従ってください(表2;補足図3)。
        注:乳歯は、基部と頂点に向かって小さくなることがよくあります。
      2. 最も基底歯の頂端洞を選択した後、エクステンションルールを適用します(表2;補足図4)シーケンスの最後の歯を切り取ります。
      3. 歯を抜いた歯を触れないように、葉身の横の歯を切り取って貼り付けて歯を取り除きます。準備に歯を取り除く必要がある追加の葉または断片がある場合は、すべての歯が取り除かれるまで上記の手順を繰り返します。
    8. 元の切り抜きリーフの追加バージョンが作成された場合は、追加バージョンを削除します。必要に応じて、画像の最後の領域を切り抜いて、ファイルサイズを縮小します。完成した準備済みイメージの表示例については、 図 3 を参照してください。
  3. シナリオ 4: 歯のある葉の領域 (葉の領域) が保存されているか、再構築できる
    1. 画像処理ソフトウェア(Adobe PhotoshopやGIMPなど)でファイルを開きます。必要に応じて画像をトリミングすると、最終的なファイルサイズを縮小できますが、スケールバーは引き続き含まれていることを確認できます。
    2. [ 画像] > [キャンバス ] (Photoshop) をクリックして、作業領域の幅を 4 倍にするトライします。 画像はキャンバスサイズ (GIMP)>。現在のキャンバスの右側または左側に新しいキャンバスを追加することをお勧めします。
    3. 葉をどのように準備するかを決定します。葉の面積/形状の測定は、葉全体または半葉で行う必要があり、どちらのオプションがより正確な測定になるかを決定します。歯の測定は、保存されたマージンのすべてのセクションに沿って行う必要があります。場合によっては、葉の面積/形状の測定は、歯の変数が測定されるサブセットとは異なる葉のサブセットで行われることがあります。
      注:提供された例(図6)では、半分の葉が全体の葉よりも確実に再構築されることが決定されました。右下の保存されたマージン(>1個の保存された歯)は、歯の測定に含まれていました。次のシナリオ 4 のプロトコルは、提供された例 (図 6) にほぼ従っていますが、詳細は準備のコンテキストによって若干異なる場合があります。
    4. 岩石マトリックスから葉をコピーし、保持されているすべてのマージンが含まれていることを確認します。
      1. なげなわツールを使用して、葉柄がある場合は葉柄を含む葉の縁をトレースします。面積/形状の測定に含まれないマージンの損傷した部分( 図6の葉の右半分など)を正確にトレースしないでください。
      2. 選択範囲をコピーして貼り付け、キャンバスの空き領域に配置します。この選択範囲のコピーを 2 つ貼り付け、1 つは未編集のものにして、準備プロセスを再開する必要がある場合は戻します。
    5. 存在する場合は、なげなわツールを使用して葉柄を葉から取り除きます。
      1. 視覚的には、葉の縁に沿って葉の縁をたどり、葉柄が葉柄に接触する点まで進みますが、葉柄は色が濃く、特徴的な葉脈はありません。そこになげなわポイントを置きます。葉の残りの半分でも同じことを行い、そこに2番目のポイントを配置します。
        注:葉の基部が対称の場合、線は葉柄に対して~垂直になります。非対称の場合、線は斜めになります。葉柄全体を囲んで選択を終了します。
      2. カットアンドペースト、または移動ツールを使用して、葉柄を葉の隣に配置しますが、葉には触れません。
        注:コルデートまたは葉状の葉の基部の場合、つまり、基部が葉柄が葉身に付着する場所の下に伸びている場合、葉柄は葉柄が葉身に付着する場所の下の葉の基部に留まる可能性があります。葉柄が付着している部分を切り取り、葉柄の縁を密接になぞり、損傷した縁を修復するように注意してください(補足図5)。これは、ほとんどの化石では見づらいかもしれません。
    6. 葉柄を取り除いた分離した葉をコピーして貼り付け、歯の測定を準備するための2番目のコピーを作成し、キャンバスの空き領域に配置します。
    7. 葉の面積と形状を測定するための葉のバージョンを準備します。
      1. 半葉を準備する場合は、なげなわツールを使用して余分な葉の材料を切り取り、完全な半葉だけが残るようにします。完全な葉を準備する場合は、葉の材料を取り除かないでください。
      2. 必要に応じて、線またはペイントブラシツール(通常は白い背景の場合は黒い線)を使用して、適切な色の線を使用してマージンに沿った損傷した領域を修復します。線が見えるほど太く(~1-2 pt の太さ)、損傷した領域のマージンを接続していることを確認してください。
    8. 歯の測定用に葉のバージョンを準備します。
      1. なげなわツールを使用して、マージンの損傷した部分に隣接する領域を削除します。
        1. 損傷した部分を囲む余白に沿った点から選択を開始し、その点からその主静脈に垂直な主静脈まで直線を引きます(図4)。損傷に最も近い保存された主歯洞から選択を開始します。これにより、歯の側面がその後の測定で内部周囲として含まれず、補助歯が主歯であるかのように測定されることがなくなります。歯の間隔が離れている場合は、保存されているマージンが多すぎると最終的に除去される可能性があるため、これは適切ではない可能性があります(図4)。
        2. 損傷したマージンの他の境界と同じ高さになるまで、メジャー静脈に沿って選択を進め、マージンに対してメジャー静脈に垂直な直線を引きます(図4)。
          注:羽状の葉(図1A)の場合、アグロフィック静脈がある場合とない場合(定義と例についてはEllis et al.43 を参照)、主静脈は一次静脈(つまり、中静脈)です。掌状に縞模様の葉(図1B、D)の場合、主静脈は最も近い一次静脈です(例: 図4B)。羽状葉の場合(図1C)、損傷が羽状葉にある場合、主静脈は葉に栄養を供給する静脈(通常は二次静脈)です。
        3. リーフの損傷した部分を削除します。葉のすべての損傷した部分に対して同じことを行います。
    9. 歯の測定用に用意されたバージョンをコピーして貼り付け、損傷した部分を取り除き、キャンバスの空き領域に置きます。
    10. なげなわツールを使用して歯を取り除きます。
      1. 葉の頂点、葉の頂点の1つ、または葉の断片の最も頂端の歯から始めて、葉、葉、または断片に沿った各主歯洞で選択します(図5;主歯と副歯を区別する方法、および歯と葉を区別する方法については 、補足図2 を参照してください)。歯を抜くときは、適切なルールに従ってください(表2;補足図2)。
        注:乳歯は、基部と頂点に向かって小さくなることがよくあります。
      2. 最も基底歯の頂端洞を選択した後、エクステンションルールを適用します(表2;補足図4)シーケンスの最後の歯を切り取ります。
      3. 歯を抜いた歯を触れないように、葉身の横の歯を切り取って貼り付けて歯を取り除きます。準備に歯を取り除く必要がある追加の葉または断片がある場合は、すべての歯が取り除かれるまで上記の手順を繰り返します。
    11. 元の切り抜きリーフの追加バージョンが作成された場合は、追加バージョンを削除します。必要に応じて、画像の最後の領域を切り抜いて、ファイルサイズを縮小します。完成した準備済みイメージの表示例については、 図 3 を参照してください。

3. デジタル測定

注: データ入力テンプレート スプレッドシートは、 補足ファイル 1 として提供されます。測定ステップのその他の考慮事項については、 表3 を参照してください。シナリオ 1 と 5 では、必要な手順は、データ入力スプレッドシートにリーフ マージンの状態を記録することだけです (手順 3.5)。

  1. ImageJソフトウェア44を開きます。自動的に行われる測定を設定します(これはプログラムのインストール後に一度行います)。
  2. 「解析」をクリックして「測定値を設定」>、「面積」、「周長」、および「フェレット直径」のみを選択します。小数点以下の桁数が 3 に設定されていることを確認します。
  3. 準備した化石の葉の画像を開くには 、[ファイル] > [開く ] をクリックするか、すでに開いている ImageJ ツールバーに画像をドラッグ アンド ドロップします。
  4. 新しい葉の画像ごとにスケールを設定します。
    注:これは重要なステップであり、正確な測定を確実にするために、新しい葉の画像ごとに実行する必要があります。
    1. 直線ツールをクリックします。縮尺記号を拡大し、縮尺記号を横切るできるだけ長い直線を描きます。
    2. 「解析」をクリックして >スケールを設定します。既知の距離に、測定された長さを cm 単位で入力します (最新のキャリブレーション データセットで使用されている単位と一致するようにするため)。長さの単位を変更する必要はありません。 [OK] をクリックします。
  5. データ入力スプレッドシートで葉を歯付き (0) または全体 (1) としてマークします。
  6. 葉柄が存在する場合は、葉柄の幅を測定します。測定は、岩石マトリックスにまだ残っている葉の元のコピーで行う必要があります。
    注:葉柄が存在しない場合、場合によっては、葉柄の代わりにその基底位置にある中静脈の幅を測定できます。ただし、これは、中静脈の全幅が保存されている場合(つまり、静脈の上部に圧縮された椎弓板がないか、化石が葉の軸側を保持している)場合にのみ行う必要があります。また、同じ種または形態型の他の標本は、基底静脈の幅が葉柄の幅と同等であることを示しています。
    1. 葉柄が葉身と接するところで葉柄に垂直な直線を引くか、挿入点が非対称の場合は、挿入の最も基本的な点で葉柄に垂直な線を引きます。この線は慎重に引くことが重要です。したがって、葉のこの領域を拡大して、線を正確に描きやすくすることをお勧めします。
      注:挿入の最も基本的な点に、損傷、毛状突起、蜜、とげ、または葉柄の幅の正確な測定を妨げるその他の特徴が存在する場合など、この手順を変更する必要がある特別な状況があります。このような場合は、確実に測定できるフィーチャの下の最初のポイントで葉柄の幅を測定します。
    2. [ 分析] > [メジャー] をクリックするか、ショートカットを使用して描画されたラインの長さを計測します。画像上に同じ線を描画して、測定が行われた場所を正確に記録するには 、[編集] > [描画 ] をクリックするか、ショートカットを使用します。必要に応じて、メインツールバーのツール(カラーピッカー)を使用して線の色を変更します。
    3. 線が引かれたら、できれば変更したファイル名で画像を保存します。
    4. この行の長さをデータ入力スプレッドシートの葉柄幅の下に記録します。
  7. 画像を白黒にして、追加の測定のために葉を準備します。これを行うには、[ Image (画像)] > [Type (8 ビット>タイプ)] をクリックします。
  8. 画像のしきい値を設定するには 、[画像] > [しきい値の調整 ] をクリックするか>ショートカットを使用します。「しきい値」というタイトルのボックスが開き、画像の一部が赤に変わります。葉の色が薄く、背景が暗い場合は、[ 暗い背景] をクリックします。
  9. スライダーバーを使用して、葉の内部が赤くなり、背景と区別されるまでしきい値を調整します。これは重要なステップであり、不正確なデータを簡単に生成できる場所です。赤い領域が葉に正確に対応していること(つまり、葉のすべての周囲が赤で、それ以上は赤くない)ことを確認します。葉の内部に赤の隙間があっても許容され、測定値に影響はありません。
    注:葉の輪郭が明確に定義されていない場合は、まずズームインしながらしきい値を調整して、葉の輪郭が赤であることを確認してください。化石と背景のコントラストが悪いために信頼性の高い閾値を適用できない場合は、ペイントブラシツールを使用して、コントラストが悪すぎる領域の葉の周囲にしっかりとした輪郭を追加します。または、葉を画像処理ソフトウェア(Adobe PhotoshopやGIMPなど)に戻し、分離された葉のレイヤーのコントラストまたは背景の色を調整して、それらをより区別します。
  10. シナリオ 2 (ステップ 2.1) と 4 (ステップ 2.4) で準備された葉の葉の面積と形状を測定します。
    注: 図2 と 図6B は、準備した画像のどのコンポーネントでどの変数を測定するかのガイドとして使用してください。シナリオ3(ステップ2.2)で葉を準備した場合は、このステップをスキップしてステップ3.11に進みます。
    1. 葉の面積と形状の測定用に準備された葉を測定し、葉柄のみを取り除く必要があります(葉柄が存在する場合)。 ワンド ツールを選択します。葉の内側をクリックします。葉全体の輪郭が黄色で描かれているはずです—輪郭が正しいことを確認してください。
    2. 測定を行うには 、「分析」>「測定 」をクリックするか、ショートカットを使用します。
    3. 測定された面積が全体の葉として準備されている場合は、データ入力スプレッドシートに面積、周囲長、フェレット、および最小フェレットを記録します。測定された領域が半分の葉として準備されている場合は、フェレットのみを記録し、次のステップに進みます。
    4. 測定された領域が半分の葉の場合は、葉を半分に切った結果として生じる人工的な周囲の長さである、葉の人工的な中央周囲を測定します(図6B)。測定された領域が葉全体の場合は、この手順と手順3.10.5をスキップします。
      注意: 人工的な中央周囲を測定すると、ブレードの周囲を半分の葉から計算できます(以下の手順3.10.5を参照)。ブレード周囲長は、DiLPおよびMA 分析に含まれる変数には使用されませんが、人相特性評価に役立つ他の変数(形状係数、コンパクトさ; 表 1)。
      1. 線ツールを右クリックして、セグメント化された線ツールを選択します。人工的な中央周の全長をトレースします。
      2. 「分析」>「測定」をクリックするか、ショートカットを使用して長さを測定します。この測定値は、以下のブレード周囲を計算する式で使用されます(ステップ3.10.5)。
    5. 測定された領域がハーフリーフの場合は、データ入力スプレッドシートに入力するときに、面積に 2 を掛け、最小フェレットに 2 を掛け、最初にハーフリーフの周囲に人工的な中央周囲を差し引き、次に次の式を使用して 2 を掛けてブレード周囲を計算して、測定値を変更します。
      ブレード周囲 = (周囲 - 人工中周) x 2
    6. 切り欠きのある葉柄がある場合は、その面積を測定します。存在しない場合、シナリオ2の測定は完了しますが、シナリオ4のステップ3.11に進みます。
      1. 切り欠いた葉柄をワンドツールでクリックします。葉柄は黄色で輪郭を描く必要があります。測定を行うには 、「分析」>「測定 」をクリックするか、ショートカットを使用します。データ入力スプレッドシートの葉柄面積の下のレコード領域。
    7. シナリオ 2 (ステップ 2.1) では、測定が完了しました。シナリオ 4 (ステップ 2.3) の場合は、次のステップに進みます。
  11. シナリオ 3 (ステップ 2.2) と 4 (ステップ 2.3) で準備された葉の歯の変数を測定します。
    1. 生の刃を測ります。ワンドツールを使用して、生のブレードの内部を選択します(つまり、歯の測定用に準備された葉で、まだ歯があります。 図6B)。黄色で輪郭が描かれている必要があります。測定を行うには 、「分析」>「測定」をクリックするか、 ショートカットを使用します。
      注:葉の調製方法によっては、いくつかの分離セクションを測定し、それらの領域を合計する必要がある場合があります(例: 図6B)。または、 Shift キーを押しながらワンドツールで2番目のセクションを選択することで、一度に複数のセクションを選択することもできます。
    2. データ入力スプレッドシートの生ブレード領域と生ブレード周囲の下に領域と周囲を記録します。
    3. 内部の生ブレードを測定します。内部の生の刃の内部を選択します(つまり、歯が取り除かれた歯の測定用に準備された葉。 図6B)。黄色で輪郭が描かれている必要があります。測定を行うには 、「分析」>「測定 」をクリックするか、ショートカットを使用します。
      注:葉の調製方法によっては、いくつかの分離セクションを測定し、それらの領域を合計する必要がある場合があります(例: 図6B)。または、 Shift キーを押しながらワンドツールで2番目のセクションを選択することで、一度に複数のセクションを選択することもできます。
    4. データ入力スプレッドシートで、内部生ブレード領域と内部生ブレード周囲の下に領域と周囲を記録します。
    5. カット周囲の長さを測定します。しきい値を削除してリーフをはっきりと表示するには、しきい値ボックスの [リセット ]をクリックするか、[ 編集]>[元に戻す]をクリックします。後者の場合、通常、白黒の8ビット変換も削除されます。セグメント化されたラインツールを選択し、生のブレードでカット周囲の全長をトレースします。
    6. 「 分析」>「測定 」をクリックするか、ショートカットを使用して測定します。複数の部分がある場合は、前の手順を繰り返して、各部分のカット周囲の長さを測定します。データ入力スプレッドシートのカット周長の長さの下に、長さまたは長さの合計を記録します。
      注:カット周囲は、損傷を取り除くことにより葉を準備することによって導入されます。ほとんどの場合、これは人工的な中央周囲とは異なります(図6B)。
    7. 主歯と副歯がある場合は数えます。
      注意: 一次歯と副歯を区別する方法のヒントについては 、補足図2 を参照してください。
      1. しきい値がまだ削除されていない場合は、ここで削除します。しきい値を削除するには、しきい値ボックスの [リセット ] をクリックするか、[編集] > [元に戻す] をクリックします。後者の場合、通常、白黒の 8 ビット変換も削除されます。
      2. 主歯の数を数えます(主歯と副歯を区別する方法のヒントについては、補足図2を参照してください)。マルチポイントツールを選択します。マルチポイントツールを選択するには、最初にポイントツールを右クリックする必要がある場合があります。各一次歯をクリックして番号を付けます。
      3. 誤って選択したポイントを削除するには、 Alt キー (Windows OS) または Command/cmd または Option キー (Mac OS) を押しながらポイントをクリックします。データ入力スプレッドシートの # の下に最終的な番号を記録します。
      4. マルチポイント ツールの数とアノテーションをクリアするには 、[選択項目の編集] > [選択項目なし] > をクリックするか、 キーボード ショートカットを使用します。
      5. 歯の総数を数えます(つまり、葉に存在するすべての一次歯と副歯)。マルチポイントツールを選択します。マルチポイントツールを選択するには、最初にポイントツールを右クリックする必要がある場合があります。一次歯と補助歯を含む各歯をクリックして番号を付けます。
        注意: 補助歯の数ではなく、歯の総数を数えると、歯が二重にカウントされることがなくなります。歯の総数を主歯の数で減算して、補助歯の数を決定します(ステップ3.11.7.6を参照)。
      6. 誤って選択したポイントを削除するには、 Alt キー (Windows OS) または Command/cmd または Option キー (Mac OS) を押しながらポイントをクリックします。歯の総数から主歯の数を差し引いて、副歯の数を決定します。これをデータ入力スプレッドシートの # of subsidiary teeth の下に記録します。
        注:一部のユーザーは、測定するときよりも葉の画像を準備するときに歯の数を作ることを好みます。

4. Rソフトウェアで解析を実行する

注:次の手順には、Rパッケージdilp11が必要です。データ入力スプレッドシートは R に読み込まれ、パッケージによって使用されます。データ入力スプレッドシート(補足ファイル2)の「Additional Instructions」タブを参照してください。R スクリプトは、複数のサイトの同時分析または単一サイトの分析に対応できます。

  1. お好みの環境を使用して R を開きます (R Studio をお勧めします)。R の概要については、たとえば https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.pdf を参照してください。
  2. Rセッションにdilpパッケージをインストールします。 パッケージのインストール方法とそれに関連する機能の実行方法の詳細については、次の Web サイトを参照してください https://cran.r-project.org/package=dilp
  3. 化石ウッディダイコット被子葉葉形質データ(データ入力スプレッドシートに記録されているデータ)を含む.csvファイルを読み込みます。
  4. 関数 dilp() を実行して、平均年間気温 (MAT) と平均年間降水量 (MAP) の再構成と関連するエラーを求めます。MATとMAPの結果は、多重線形回帰モデル(MLR、DiLP)と2つの単一線形回帰モデル(SLR、葉面積分析、マージン分析)から報告されます。関数 lma() を実行して、morphotype レベルと site レベルでの面積あたりの葉の質量 (MA) 再構成を実行します。
  5. dilp() を実行した後は、dilp() の結果に含まれる外れ値やエラーオブジェクトを見て、データ収集の潜在的な問題を確認し、データの品質を確認することをお勧めします。または、関数 dilp_processing() を使用し、その後に dilp_outliers() と dilp_errors() を使用します。フラグが立てられた問題に対処するには、準備した標本を参照し、場合によっては再測定します。元のデータ ファイルを編集してから、R に再読み込みすることをお勧めします。
  6. 化石サイトがキャリブレーションデータセットの葉の生理学的多変量空間内にあるかどうかを、関数 dilp_cca()を使用して判断します。

代表的な結果

ブリティッシュコロンビア州中南部の始新世初期のマカビー化石遺跡から採取された葉の人相測定のデータセットは、デジタル葉の人相学(DiLP)と面積あたりの葉の質量(MA)の両方の再構成方法を使用した代表的な結果の例を提供するために使用されました(Lowe et al.38;データは補足ファイル2で提供されました).このサイトは、高地と火山の風景38,45,46,47で、新生代(始新世前期の気候最適)の最も暖かい期間の古気候と古生態学を再構築する機会を提供します。化石群集は、H1(厚さ28cm)とH2(厚さ27cm)と名付けられた湖沼配列の2つの別々の地平線からサンプリングされ、国勢調査技術を使用して狭い範囲の層序にプールされ、形態型を割り当てることができるすべての標本が収集またはカウントされました38,48。

McAbeeの葉の生理学的データは、 dilp_errors()によってフラグが立てられたエラーチェックに合格し、 dilp_outliers() によってフラグが立てられた7つの外れ値が二重にチェックされ、値がデータの真の変動を表し、方法論的な誤りではないことを確認しました。その後、データは dilp() 関数を介して実行され、古気候が生成され、 lma() 関数が面積あたりの葉の質量の再構成を生成しました。

MA再構成とその95%予測区間の下限と上限は、Royer et al.5およびButrim et al.10に示されている方程式を使用して、種レベルとサイトレベルの両方で表4に報告されています。再構成された値は、現代の陸生種に典型的なMAの範囲内にある(30-330 g/m2)49。Royerら5で論じた閾値を用いると、ほとんどの種は、<1年(≤87g/m2)、一部~1年(88-128g/m2)の葉の寿命と一致する再構成されたMAを有するが、>1年(≥129 g/m2)の典型的なものは一つもない。サイトMの再構築 マカビーでの平均と分散は、サイト10,50での葉の経済戦略の普及率と多様性を反映しています。H1とH2のサイト平均と分散の間に顕著な違いはなく、したがって、葉の経済戦略の構成と多様性が2つの時点間で異なるという証拠はありません。さらに、Royer et al.5 と Butrim et al.10 の方程式を使用して行われたサイト平均再構成は非常に類似していました。

Peppe et al.6 に示されている多重線形回帰 (DiLP) および単一線形回帰 (葉縁および葉面積分析) 方程式を使用した平均年間気温 (MAT) と平均年間降水量 (MAP) の再構成を 表 5 に示します。古気候の推定は、化石の葉の群集の葉の人相がキャリブレーションデータセットの人相空間内で発生する場合に最も確実に推測されます。これは、関数 dilp_cca() によって実行される正準コレスポンデンス分析 (CCA) 分析ステップを通じて評価されます。McAbee H1とH2はどちらも、キャリブレーションデータセットで観察された葉の人相の範囲内にあります(図7A)。もしサイトが較正空間から外れた値を再構築していた場合、古気候の再構築は慎重に解釈されるべきである(例えば、独立した証拠との比較を通じて;さらなる議論についてはPeppe et al.6 を参照)。H1とH2の両方の再構成されたMATとMAPは、温帯の季節性バイオーム(図7B、C)と一致しており、McAbee45の化石の花と昆虫の両方のコミュニティの最も近い生きている親戚に基づく推論を含む、独立した証拠ラインとよく一致しています。

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図1:この記事全体にわたる葉の人相学と建築用語 (A)羽状縞模様の葉、葉状でない葉、および全体縁の葉、(B)手掌状に縞模様の葉、葉のない歯のある葉、(C)羽状に縞模様の葉、葉状、および全体縁の葉、(D)手のひら状に縞模様の葉、葉、および歯のある葉。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:メソッドのフローチャート。 さまざまな葉の保存条件と葉の種類によって、どの一般的な葉の形質が確実に測定できるかを決定する方法を示すフローチャート(黄色のボックス)。これにより、プロトコールで従う準備シナリオと、データ入力スプレッドシートにデータが入力される列(箇条書き)が決まります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:さまざまな準備シナリオ。 デジタルで準備された完成した画像の例を示すさまざまな準備シナリオで、測定フェーズの準備が整いました。(A)シナリオ1、面積または半分の面積が再構築できない縁のある葉全体、(B)シナリオ5、面積または半分の面積が再構築できず、≥2本の連続した歯および/または葉の≥25%が保存されていない歯のある葉、(C)シナリオ2、面積または半分の面積が保存されているか、または再構築できる縁のある葉全体、 (D)シナリオ3、面積または半分の面積が再構築できないが、≥2本の連続した歯があり、葉の≥25%が保存されている歯のある葉、(E)シナリオ4、面積または半分の面積が保存されているか、再構築できる歯のある葉。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:損傷除去の図。 損傷したマージンを切り取る方法と、その損傷したマージンに隣接する葉の領域を示しています。赤い破線は、なげなわツールで選択がどのように行われるかを示しています。損傷の境界は、意図的に乳歯の副鼻腔から開始されたことに注意してください(主歯と副歯を区別するための 補足図2 を参照してください)。(A)選択が中静脈まで拡張されている羽状縞模様の葉。(B)選択が最も近い一次静脈に拡張されている手のひら状の葉。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:歯を切る方法の例を示しています。 (A)赤い破線は、なげなわツールで選択を行う方法を示しています。この場合、歯は複合歯であるため、選択は一次副鼻腔間でのみ行われました(一次歯と副鼻腔を区別するための 補足図2 を参照)、(B)選択中にマウスがクリックされた場所を表す赤い点で、歯の選択がどのように行われたかを拡大した視点、(C)歯が取り除かれたときの葉のコピー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図 6: 準備シナリオ 4 の図。 シナリオ 4 で準備した葉の例の準備決定と測定手順の図。(A)半葉が最も信頼性の高い葉の形と面積の測定値を提供すると判断され、両方の内側半分の保存されたマージンが歯の測定に含まれた準備シナリオ。(B)調製された葉のさまざまな成分でどの変数が測定されるかを示す例。太字のテキストはDiLPおよびMA 分析に必要な測定値を強調し、太字でないテキスト(ブレード周囲長、最小フェレット、人工中間周囲長)は、必須ではないが追加の人相特性評価に役立つ測定値を強調しています(形状係数やコンパクトさなど。 表 1)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:代表的な結果。 始新世初期のMcAbee化石層でサンプリングされた2つの化石地平線(H1とH2)の結果、Lowe et al.38。(A)キャリブレーションデータセットにおける多変量葉の人相の表現を示す正準コレスポンデンス分析。キャリブレーションデータはPeppe et al.6によるものです。2つのMcAbee地平線の葉の人相は、キャリブレーションスペース内でオーバーレイされ、発生します。(B および C)気温と降水量の推定、およびそれらに関連する不確実性(モデルの標準誤差)は、ウィテカーバイオーム図に重ねられた2つのMcAbee地平線のPeppeら6 で示された方程式を使用して。(B)デジタルリーフフィジオグノミー(DiLP)多重線形回帰モデル(MLR)を使用して再構築された推定値、(C)ウィテカーバイオーム図に重ねられた2つのMcAbee地平線の葉面積分析(LAA)および葉マージン分析(LMA)単一線形回帰(SLR)方程式を使用して再構築された推定値。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:葉の生理学的変数。 このプロトコルを使用して予測モデルで測定および/または計算および適用され、面積あたりの葉の乾燥質量(MA)、平均年間気温(MAT)、および平均年間降水量(MAP)を再構築する変数。MATとMAPは、Digital Leaf Physiognomy(DiLP)の多変量アプローチと、葉マージン分析(LMA)および葉面積分析(LAA)の単変量アプローチを使用して、Peppe et al.6 で提示された方程式で再構築されます。「その他」としてリストされた変数は、MA、DiLP、LMA、およびLAA分析では使用されませんが、実装が容易で葉の人相の有用な特性評価を提供するため、このプロトコルを使用して測定および計算されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2: 準備手順に関する追加の考慮事項と説明。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3: ステップの測定に関する追加の考慮事項と説明。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4: Lowe et al.38によるMcAbee Fossil Bedsの95%予測区間の面積あたりの葉乾燥質量(MA)および関連する上限と下限の再構築。再構成は、形態型平均5、部位平均 5,10、および部位分散10 に対して行われます。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表5:始新世初期のMcAbee化石床におけるHorizon 1(H1)および2(H2)の平均年間気温(MAT)および平均年間降水量(MAP)の再構築は、DiLP(Digital Leaf Physiognomy)の多重線形回帰(MLR)と、Peppe et al.6で提示された葉マージン分析(LMA)および葉面積分析(LAA)の単一線形回帰(SLR)を使用して行われます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:ハーバードフォレストの Quercus rubra の葉は、葉と歯のルールを示しています。 線分セグメント p と d はテキストで定義されます。スケールバー = 1 cm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:ハーバードフォレストの ベチュラ・ルテア の葉は、補助歯と乳歯を区別するためのルールを示しています。 孤立した葉のセグメントは2倍に拡大されています。青い線は、切開度が最も高い副鼻腔(つまり、一次副鼻腔)を接続し、これらの副鼻腔に関連する歯は一次静脈(青い矢印)と見なされます。赤い点は、歯の頂端洞があまり切開されていないため、補助的な歯として区別できる歯を示しています。赤い矢印で示されている歯は、乳歯と同程度の切開がありますが、主静脈が主歯に比べて比較的細いゲージで補助歯と識別できます。スケールバー = 1 cm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:歯の選択、羽状葉のルール、および葉の優先順位のルールの図。 (A)Huyck保護区からの Hamamelis virginianaの 葉の歯の選択。暗くなった領域は、補助歯が一次歯と区別されるため、全歯選択に含まれる葉組織に対応します。(B)IESの Quercus alba の葉は、ローブの優先ルールを示しています。暗くなった領域はローブとして測定され、暗くなっていない領域は歯として測定されますが、すべての投影はローブ優先ルールを介してローブと見なされます。スケールバー = 1 cm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:アレゲニー国有林の カエデ の葉は、延長と孤立歯のルールを示しています。 破線は選択歯を示しています。実線は、関連付けられた歯の対称軸を示しています。黒い部分は、写真撮影のために葉を平らにするための重りです。スケールバー = 1 cm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図5:コルデートベースの上に配置された葉柄を切り取る理想的な方法を示しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:測定されたすべてのデジタル葉の人相変数のデータ入力テンプレート。 このファイルは R パッケージの入力ファイルとして使用されるため、変更しないでください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:Lowe et al.38のMcAbee化石層からのデータ例。 このデータは、 図7 の生成と代表的な結果の議論に使用されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:化石デジタル葉の人相学のルール文書。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事では、葉の生理学の連続的な形質を木質双子葉植物の被子植物の化石の葉で測定し、その後、現代のキャリブレーションデータから開発されたプロキシに適用して、古気候と古生態学を再構築する方法を紹介します。これには、方法論的なステップをプロキシキャリブレーションデータセット5、6、10に示されているものと一致させるように注意する必要があります。この検討は、化石葉の収集中にこのプロトコルを適用する前に、特にサンプルサイズに関して開始されます。化石の葉の群集をできるだけ狭い範囲の層序にプールして、適切な数の測定可能な標本と形態型を取得し、時間平均化を最小限に抑えることをお勧めします。古気候の再構築を、少なくとも350の識別可能な標本と少なくとも15-20の木質双子葉植物の被子植物の形態型を持つ場所に限定することも推奨されます19,51,52。さらに、分析のために葉を選択するときは、モルフォタイプごとにできるだけ多くの葉を測定し、少なくとも、モルフォタイプ内の葉の人相の変動性を表す標本を選択することをお勧めします。

試料作製セクションと測定セクションを実装する際には、キャリブレーションデータセットとの一貫性を保つために、さらに注意を払う必要があります。準備段階で実施されるステップは、主観性が最も強く、ユーザー間で結果が異なる可能性があります。しかし、プロトコールが意図的に守られ、追加の考慮事項の表(表2、表3)および規則文書(補足ファイル3)が頻繁に参照される場合、この方法は、葉の人相の客観的で再現性のある測定をもたらす。この方法を初めて使用するユーザーには、葉が正しく準備されていることを、より経験のある人に確認することをお勧めします。MA 再構成のための葉柄幅を測定する際には、特別な注意が必要です。これらの値は二乗されるため、測定値の不正確さは誇張されます。不完全な保存と損傷は葉柄の寸法を変更する可能性があるため、慎重に避ける必要があります。

これらの方法には、注目に値するいくつかの制限があります。最も重要なことは、dilp Rパッケージに含まれる代理再構成は、木質双子葉植物の被子植物のみを対象としているため、古代コミュニティの顕著な構成要素であった他の植物グループを除外する可能性があることです。しかし、種レベルのMAのための追加の葉柄ベースのプロキシは、葉柄および広葉類の裸子植物5,8、草本の被子植物8、およびシダ9について公開されており、ユーザーは必要に応じて別々に組み込むことができる。木本双子葉植物の被子植物以外のコミュニティの著名な植物グループの除外は、コミュニティ全体の経済戦略の不完全な視点を提供するため、サイトレベルのMA平均と分散の再構築に最も影響を与える可能性があります。系統発生史は葉歯の発生に影響を及ぼし23、新しい分類学的組成を持つ化石群集を分析すると、結果として得られる推定値に不確実性が生じる可能性がある可能性が紹介されていますが、この潜在的な影響の実現はまだテストおよび実証されていません。

化石の葉は、縁辺の状態を超えた葉の人相の定量的測定を組み込むためにも適切に保存する必要があります。DiLPの場合、これは特に全体のマージンリーフに当てはまり、全体の葉または半分の葉が保存されているか、再構築できる場合にのみ、マージン状態を超えて情報を提供できるためです。同様に、葉をMA 再構成に組み込むことができるのは、(1)葉身への挿入時の葉柄の両方が保存されている場合、または特定の場合には、葉の基部と中静脈の基底部の最上部が保存されている場合(ステップ3.6の注を参照)、および(2)葉のサイズを推定できる場合、 全葉測定または半葉再構成のいずれかによって。これは、一部の形態型が部位レベルのMA 解析から完全に除外される可能性があることを意味します。最後に、このプロトコルでは時間の制限があり、古気候の再構築のための単変量代替案は、作成にかかる時間が比較的短いためです。

これらの制限にもかかわらず、DiLPおよびMA再構成法の使用には、他の方法に比べていくつかの利点があります。MAの再構築は、化石記録の葉の経済戦略を再構築する唯一の方法の1つであり、2次元の葉柄の幅と葉の面積の測定を使用することで、一般的な印象/圧縮葉の化石を使用して再構築を行うことができます。DiLPでは、気候と機能的に関連した複数の連続測定を組み込むことで、測定の再現性と結果として生じる気候再構成の精度が向上します6,13。このプロトコルは、葉の断片を使用して葉の歯の有無の測定を行うことを許可することにより、化石記録の不完全な性質に対応するように設計されています。葉の面積の連続的な測定は葉のサイズについてより多くの情報を提供しますが、DiLP MAPの推定値は、サンプルサイズ16,53を増やすために葉のサイズクラスを使用するものによって、または葉の面積42,54,55の静脈スケーリング推定を組み込むことによって補完することができます.ほとんどの複雑な方法と同様に、このプロトコルの時間効率は、特に準備ステップにおいて、ユーザーがより経験豊富で自信を持つにつれて向上します。サイトレベルのDiLP測定が、これまでに>150の現代の6,10,56と少なくとも22の化石群集に対してこのプロトコルに従って行われてきたという事実は、その実現可能性を証明しています6,38,39,40,41,42.最後に、葉の人相学の包括的な測定は、ここで議論したもの以外にも応用があり、植物の生態学、生理学、進化、および発達の他の側面を説明するのに役立つ可能性があり、現代の56と古研究40の両方に適用できます。

要約すると、この記事で詳述されている方法の実装により、ユーザーは堅牢で再現性のある方法を使用して古気候と古生態学を再構築できます。これらの手法は、環境摂動に対する気候と生態系の応答の過去の例を紹介し、地球の自然システムの複雑な相互作用についてさらなる洞察を提供する重要な機会を提供します。

開示事項

何一つ。

謝辞

AJLは、ワシントン大学の2020-2022年度の学部生Team Leafに対し、DiLPの効果的なトレーニング教材を作成するためのモチベーションと提案に感謝します。AGF、AB、DJP、およびDLRは、ウェズリアン大学とベイラー大学の多くの学部生が、現生および化石の葉を測定し、このプロトコルの変更と更新に非常に貴重な意見を提供してくれたことに感謝します。著者らは、PBot Quantitative Traits Working GroupとPBOTチームが、このプロトコルを形式化してより広範なコミュニティにとってよりアクセスしやすくするための作業を奨励してくれたことを認めています。この研究は、全米科学財団(DLRにEAR-0742363、DJPにEAR-132552)とベイラー大学(DJPにYoung Investigator Development Program)の支援を受けました。このプロトコルの明確さと包括性を向上させるためのフィードバックを提供してくださった2人の匿名のレビュアーとレビューエディターに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Copy stand or tripodFor fossil photography
Digital cameraFor fossil photography, high resolution camera preferred
Image editing software For digital preperation. Examples include Adobe Photoshop and GIMP, the latter of which is free (https://www.gimp.org/)
ImageJ softwareIJ1.46prFor making digital measurments, free software (https://imagej.net/ij/index.html)
Microsoft ExcelMicrosoftOr similar software for data entry
R softwareThe R foundationFor running provided R script (https://www.r-project.org/). R studio offers a user friendly R enviornment (https://posit.co/download/rstudio-desktop/). Both are free.
dilp R PackageCan be installed following instructions here: https://github.com/mjbutrim/dilp

参考文献

  1. Gates, D. M. Transpiration and leaf temperature. Ann Rev Plant Physiol. 19 (1), 211-238 (1968).
  2. Givnish, T. On the adaptive significance of leaf form. Topics Plant Pop Biol. , 375-407 (1979).
  3. Niklas, K. J. . Plant biomechanics: an engineering approach to plant form and function. , (1992).
  4. Niklas, K. J. . Plant Allometry: The Scaling of Form and Process. , (1994).
  5. Royer, D. L., et al. Fossil leaf economics quantified: Calibration, Eocene case study, and implications. Paleobiology. 33 (4), 574-589 (2007).
  6. Peppe, D. J., et al. Sensitivity of leaf size and shape to climate: global patterns and paleoclimatic applications. New Phytol. 190 (3), 724-739 (2011).
  7. Wright, I. J., et al. The worldwide leaf economics spectrum. Nature. 428 (6985), 821-827 (2004).
  8. Royer, D. L., Miller, I. M., Peppe, D. J., Hickey, L. J. Leaf economic traits from fossils support a weedy habit for early angiosperms. Am J Botany. 97 (3), 438-445 (2010).
  9. Peppe, D. J., et al. Biomechanical and leaf-climate relationships: a comparison of ferns and seed plants. Am J Botany. 101 (2), 338-347 (2014).
  10. . dilp: Reconstruct paleoclimate and paleoecology with leaf physiognomy. R package version 1.1.0 Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dilp/index.html (2024)
  11. Bailey, I. W., Sinnott, E. W. A botanical index of Cretaceous and Tertiary climates. Science. 41 (1066), 831-834 (1915).
  12. Bailey, I. W., Sinnott, E. W. The climatic distribution of certain types of angiosperm leaves. Am J Botany. 3 (1), 24-39 (1916).
  13. Peppe, D. J., Baumgartner, A., Flynn, A. G., Blonder, B. Reconstructing paleoclimate and paleoecology using fossil leaves. Meth Paleoecol: Reconstructing Cenozoic Terre Environ Ecol Comm. , 289-317 (2018).
  14. Wolfe, J. A. . Temperature parameters of humid to mesic forests of eastern Asia and relation to forests of other regions of the Northern Hemisphere and Australasia. , (1979).
  15. Wilf, P. When are leaves good thermometers? A new case for Leaf Margin Analysis. Paleobiology. 23 (3), 373-390 (1997).
  16. Wilf, P., Wing, S. L., Greenwood, D. R., Greenwood, C. L. Using fossil leaves as paleoprecipitation indicators: An Eocene example. Geology. 26 (3), 203-206 (1998).
  17. Miller, I. M., Brandon, M. T., Hickey, L. J. Using leaf margin analysis to estimate the mid-Cretaceous (Albian) paleolatitude of the Baja BC block. Earth Planetary Sci Lett. 245 (1), 95-114 (2006).
  18. Wing, S. L., Greenwood, D. R. Fossils and fossil climate: The case for equable continental interiors in the Eocene. Philosophical Transact: Biol Sci. 341 (1297), 243-252 (1993).
  19. Wolfe, J. A. A method of obtaining climatic parameters from leaf assemblages. U S Geol Sur. (2040), 1-71 (1993).
  20. Huff, P. M., Wilf, P., Azumah, E. J. Digital future for paleoclimate estimation from fossil leaves? Preliminary results. Palaios. 18 (3), 266-274 (2003).
  21. Spicer, R. A. Recent and future developments of CLAMP: Building on the legacy of Jack A. Wolfe. Adv Angiosperm Paleobotany Paleoclimatic Reconstruct. 258, 109-118 (2007).
  22. Yang, J., Spicer, R. A., Spicer, T. E. V., Li, C. S. CLAMP Online': a new web-based palaeoclimate tool and its application to the terrestrial Paleogene and Neogene of North America. Palaeobiodivers Palaeoenviron. 91 (3), 163-183 (2011).
  23. Little, S. A., Kembel, S. W., Wilf, P. Paleotemperature proxies from leaf fossils reinterpreted in light of evolutionary history. PLoS One. 5 (12), e15161 (2010).
  24. Webb, L. J. A physiognomic classification of Australian rain forests. J Ecol. 47 (3), 551-570 (1959).
  25. Schmerler, S. B., et al. Evolution of leaf form correlates with tropical-temperate transitions in Viburnum (Adoxaceae). Proc Royal Soci B: Biol Sci. 279 (1744), 3905-3913 (2012).
  26. Nicotra, A. B., et al. The evolution and functional significance of leaf shape in the angiosperms. Funct Plant Biol. 38 (7), 535-552 (2011).
  27. Leigh, A., Sevanto, S., Close, J. D., Nicotra, A. B. The influence of leaf size and shape on leaf thermal dynamics: does theory hold up under natural conditions. Plant Cell Environ. 40 (2), 237-248 (2017).
  28. Wright, I. J., et al. Global climatic drivers of leaf size. Science. 357 (6354), 917-921 (2017).
  29. Givnish, T. J. Leaf and canopy adaptations in tropical forests. Physiol Ecol Plants Wet Tropics. 12, 51-84 (1984).
  30. Feild, T. S., Sage, T. L., Czerniak, C., Iles, W. J. Hydathodal leaf teeth of Chloranthus japonicus (Chloranthaceae) prevent guttation-induced flooding of the mesophyll. Plant, Cell Environ. 28 (9), 1179-1190 (2005).
  31. Royer, D. L., Wilf, P. Why do toothed leaves correlate with cold climates? Gas exchange at leaf margins provides new insights into a classic paleotemperature proxy. Int J Plant Sci. 167 (1), 11-18 (2006).
  32. Edwards, E. J., Spriggs, E. L., Chatelet, D. S., Donoghue, M. J. Unpacking a century-old mystery: Winter buds and the latitudinal gradient in leaf form. Botanical Soc Am. 103 (6), 975-978 (2016).
  33. Givnish, T. J., Kriebel, R. Causes of ecological gradients in leaf margin entirety: Evaluating the roles of biomechanics, hydraulics, vein geometry, and bud packing. Am J Botany. 104 (3), 354-366 (2017).
  34. Royer, D. L., Wilf, P., Janesko, D. A., Kowalski, E. A., Dilcher, D. L. Correlations of climate and plant ecology to leaf size and shape: potential proxies for the fossil record. Am J Botany. 92 (7), 1141-1151 (2005).
  35. Green, W. A. Loosening the CLAMP: an exploratory graphical approach to the climate leaf analysis multivariate program. Palaeontol Electro. 9 (2), 19 (2006).
  36. Peppe, D. J., Royer, D. L., Wilf, P., Kowalski, E. A. Quantification of large uncertainties in fossil leaf paleoaltimetry. Tectonics. 29 (3), 002549 (2010).
  37. Royer, D. L., Meyerson, L. A., Robertson, K. M., Adams, J. M. Phenotypic plasticity of leaf shape along a temperature gradient in Acer rubrum. PLoS One. 4 (10), e7653 (2009).
  38. Lowe, A. J., et al. Plant community ecology and climate on an upland volcanic landscape during the early Eocene climatic optimum: McAbee fossil beds, British Columbia, Canada. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 511, 433-448 (2018).
  39. Flynn, A. G., Peppe, D. J. Early Paleocene tropical forest from the Ojo Alamo Sandstone, San Juan Basin, New Mexico, USA. Paleobiology. 45 (4), 612-635 (2019).
  40. Allen, S. E., Lowe, A. J., Peppe, D. J., Meyer, H. W. Paleoclimate and paleoecology of the latest Eocene Florissant flora of central Colorado, U.S.A. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 551, 109678 (2020).
  41. Baumgartner, A., Peppe, D. J. Paleoenvironmental changes in the Hiwegi Formation (lower Miocene) of Rusinga Island, Lake Victoria, Kenya. Palaeogeograp, Palaeoclimatol, Palaeoecol. 574, 110458 (2021).
  42. Wagner, J. D., Peppe, D. J., O'keefe, J. M., Denison, C. N. Plant community change across the Paleocene-Eocene boundary in the Gulf coastal plain, Central Texas. Palaios. 38 (10), 436-451 (2023).
  43. Ellis, B., et al. . Manual of leaf architecture. , (2009).
  44. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9, 671-675 (2012).
  45. Greenwood, D. R., Pigg, K. B., Basinger, J. F., DeVore, M. L. A review of paleobotanical studies of the Early Eocene Okanagan (Okanogan) Highlands floras of British Columbia, Canada, and Washington, USA. Canadian J Earth Sci. 53 (6), 548-564 (2016).
  46. Lowe, A. J., West, C. K., Greenwood, D. R. Volcaniclastic lithostratigraphy and paleoenvironment of the lower Eocene McAbee fossil beds, Kamloops Group, British Columbia, Canada. Canadian J Earth Sci. 55 (8), 923-934 (2018).
  47. Lowe, A. J., et al. Dynamics of deposition and fossil preservation at the early Eocene Okanagan Highlands of British Columbia, Canada: insights from organic geochemistry. Palaios. 37 (5), 185-200 (2022).
  48. Gushulak, C. A. C., West, C. K., Greenwood, D. R. Paleoclimate and precipitation seasonality of the Early Eocene McAbee megaflora, Kamloops Group, British Columbia. Canadian J Earth Sci. 53 (6), 591-604 (2016).
  49. Poorter, H., Niinemets, &. #. 2. 2. 0. ;., Poorter, L., Wright, I. J., Villar, R. Causes and consequences of variation in leaf mass per area (LMA): a meta-analysis. New Phytol. 182 (3), 565-588 (2009).
  50. Enquist, B. J., et al. Scaling from traits to ecosystems. Adv Ecol Res. 52, 249-318 (2015).
  51. Burnham, R. J., Wing, S. L., Parker, G. G. The reflection of deciduous forest communities in leaf litter: implications for autochthonous litter assemblages from the fossil record. Paleobiology. 18 (1), 30-49 (1992).
  52. Burnham, R. J., Ellis, B., Johnson, K. R. Modern tropical forest taphonomy: does high biodiversity affect paleoclimatic interpretations. PALAIOS. 20 (5), 439-451 (2005).
  53. Jacobs, B. F. Estimation of low-latitude paleoclimates using fossil angiosperm leaves: examples from the Miocene Tugen Hills, Kenya. Paleobiology. 28 (3), 399-421 (2002).
  54. Sack, L., et al. Developmentally based scaling of leaf venation architecture explains global ecological patterns. Nat Comm. 3 (1), 837 (2012).
  55. Merkhofer, L., et al. Resolving Australian analogs for an Eocene Patagonian paleorainforest using leaf size and floristics. Am J Botany. 102 (7), 1160-1173 (2015).
  56. Baumgartner, A., Donahoo, M., Chitwood, D. H., Peppe, D. J. The influences of environmental change and development on leaf shape in Vitis. Am J Botany. 107 (4), 676-688 (2020).

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