睡眠脑电图控制下的光生物调节刺激淋巴清除小鼠脑毒素

摘要

本研究提出了在脑电图控制下经颅光生物调节的非侵入性和便携式技术，用于刺激淋巴清除老年和非麻醉 BALB/c 雄性小鼠在自然深度睡眠期间大脑中的毒素（例如，可溶性淀粉样蛋白 β）。

摘要

脑膜淋巴管 （MLV） 在清除大脑毒素方面起着重要作用。刺激 MLV 功能的创新技术的发展是治疗与 MLV 异常相关的各种脑部疾病进展的一个有前途的方向，包括阿尔茨海默病和帕金森病、脑肿瘤、创伤性脑损伤和颅内出血。睡眠是大脑排水过程最活跃的自然状态。因此，在睡眠期间刺激大脑的引流和 MLV 可能具有最显着的治疗效果。但是，目前不存在此类商业技术。

本研究提出了一种在脑电图 （EEG） 控制睡眠下经颅光生物调节 （tPBM） 的新型便携式技术，旨在光刺激从老年 BALB/c 小鼠的大脑中清除毒素（例如，可溶性淀粉样蛋白 β （Aβ）），并能够比较不同光学资源的治疗效果。该技术可以在没有麻醉的家笼自然条件下使用，保持小鼠的运动活动。这些数据为开发非侵入性和临床上有前途的光技术开辟了新的前景，以纠正 MLV 功能和大脑引流过程中与年龄相关的变化，并有效清除脑组织中的代谢物和毒素。该技术既可用于睡眠大脑功能的临床前研究，也可用于开发与睡眠相关的脑部疾病的临床相关治疗方法。

引言

脑膜淋巴管 （MLV） 在清除脑组织中的毒素和代谢物方面起着重要作用 ^1,2,3。MLV 在各种脑部疾病（包括肿瘤、创伤性脑损伤、出血和神经退行性过程）中的损伤伴随着 MLV 功能的下降，从而导致这些病理的进展 1,2,3,4,5,6 .因此，刺激 MLV 的方法的开发为治疗脑部疾病的有效技术的出现开辟了新的视野。最近，已提出有效的经颅光生物调节 （tPBM） 的非侵入性技术，以刺激 MLV 并清除大脑中的血液和 Aβ 等毒素 5,7,8,9,10,11,12。有趣的是，深度睡眠是激活大脑淋巴引流过程的自然因素^13,14。基于这一事实，合乎逻辑地假设 MLV 在睡眠期间的 tPBM 可能比清醒期间具有更有效的治疗效果 9,11,12,15。然而，目前还没有针对睡眠期间 tPBM 的商业技术¹⁶。此外，研究 tPBM 治疗效果的动物实验是在麻醉下进行的，这是将光准确传递到大脑所必需的。然而，麻醉会显着影响大脑的引流，从而降低研究结果的质量¹⁷。

Aβ 是正常神经活动的代谢产物¹⁸。由于它是在培养的大鼠皮质神经元中建立的，因此 Aβ 以高速率从它们释放到细胞外空间（Aβ 为 2-4 个分子/神经元/秒）¹⁹。有证据表明，位于细胞外和血管周围间隙的 Aβ 溶解形式对神经元和突触的毒性最大²⁰。可溶性 Aβ 在 1-2.5 小时内从人脑中迅速清除²¹。MLV 是从大脑中去除可溶性 Aβ^{的隧道 1,7}，该 Aβ 会随着年龄的增长而下降，导致 Aβ 在老年大脑中积累 ^1,22。有证据表明，大脑中 Aβ 水平的细胞外异常与衰老时的认知表现相关，并与阿尔茨海默病 （AD） 的发展有关^23,24。因此，老年和老年啮齿动物被认为是研究淀粉样变性（包括 AD^25,26）的转基因模型的替代品。

本研究提出了一种原始的便携式 tPBM 技术，该技术由不同年龄的非麻醉雄性 BALB/c 小鼠的深度或非快速眼动 （NREM） 睡眠脑电图 （EEG） 控制，以刺激 Aβ 从大脑淋巴清除到外周淋巴系统（颈深淋巴结，dcLNs）。

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研究方案

所有程序均按照“实验动物护理和使用指南”、关于保护用于科学目的的动物的指令 2010/63/EU 和俄罗斯联邦科学与高等教育部的指南（1984 年 11 月 13 日第 742 号）执行，该指南已获得萨拉托夫国立大学生物伦理委员会的批准（第 7 号协议， 22.09.2022).

1. 硬件组装

1. 将一块 1.5 毫米厚的铝箔 textolite 切割成 1.5 毫米 x 2 毫米的尺寸。这部分将被称为发光二极管 （LED） 印刷电路板 （PCB）（图 1C）。
2. 将 LED 焊接到 PCB 上，如图 1 所示。
3. 将两根绞合铜线焊接到 LED 的引脚上，然后用套管盖住它们。
4. 打印出框架的 3D 模型（图 1A）;在框架上放置一个 LED（图 1B）和磁铁（图 1D）;在鼠标头上放置一个垫圈（图 1E）。
5. 要组装电路（图 2），请按照以下步骤操作。
   1. 首先，连接电阻器（图 2;R1） 在 LED 阳极和 Arduino 上的 5 V 端口之间。
   2. 接下来，将 LED 阴极连接到金属氧化物半导体场效应晶体管 （MOSFET）（图 2;Q1） 引流。然后，将 MOSFET 源极接地。
   3. 连接下拉电阻（图 2;R2） 的 MOSFET 栅极和地之间。最后，将 MOSFET 栅极连接到 Arduino 上的引脚 3。
6. 将液晶显示器 （LCD） 键盘扩展板连接到 Arduino。
7. 打印出外壳、盖板和按钮的 3D 模型。将带有 LCD 键盘扩展板、MOSFET 和 LED 连接器的 Arduino 板插入外壳，如图 3 所示。

2. 软件指南（图 4）

1. 下载 Arduino sketch（.ino 文件）并通过 Arduino 集成开发环境 （IDE）（补充编码文件 1）打开它。
2. 选择正确的通信 （COM） 端口并刷新固件。
3. 该界面包括两列。使用按钮 Left 和 Right 在这些列之间导航。选择指示器位于列的左侧。
4. 屏幕上的左侧列是脉宽调制 （PWM） 占空比选择字段。使用 Up 和 Down 按钮调整占空比。在 17 分钟的会话中实现 10/20/30 Dj/cm² 剂量的 PBM，并具有相应的 2%/4%/6% PWM 占空比。
5. 屏幕上的右侧列是 RUN/Off 字段。要选择此列，请按键盘上的 Right 按钮，然后按 Select。当进程运行时，活动指示器将闪烁，并且 RUN 按钮上的文本将变为 OFF。
   注意。准备小鼠进行为期10天的实验，包括植入脑电图电极，将慢性导管植入右侧心室以注射荧光Aβ，以及放置用于PBM的板。

3. 植入脑电图记录系统（图5）

1. 称量小鼠，并通过肌肉注射到大腿中，用 Zoletil 100 和木兰酸盐（分别为 100 mg/kg;10 mg/kg）的混合物麻醉它。
2. 当后脚撤退反射和尾巴捏合反应停止时，将鼠标放在加热垫上的立体定位框架中（图 5A）。
3. 在眼睑上涂抹眼药膏，以防止手术过程中眼球干燥。必要时重复此过程。
4. 使用剃须机剃掉从鼻骨到枕骨的区域的头部，并先用酒精对裸露的皮肤进行消毒。
5. 使用直解剖剪刀，切下头皮，用微镊子固定，清洁筋膜上的颅骨，然后用棉签擦干。如有必要，使用止血剂。
6. 使用直径为 1.3 毫米的钻头，沿坐标在颞骨每侧打 2 个孔：第一对螺钉 AP = -1 毫米，第二对螺钉 AP = -3 毫米。
7. 将带有导线的脑电图螺钉放入酒精中 5 分钟。然后，将脑电图螺钉放入盐水溶液中。
8. 将四个带有电极的镀银螺钉放入孔中，深度为 1 毫米（图 5B）。
9. 使用牙科丙烯酸将螺钉固定在颅骨表面，以便从它们伸出的电极位于动物的鼻子上（图 5C）。让牙科丙烯酸硬化 15 分钟。
10. 使用牙科丙烯酸将 EEG 记录传感器连接到动物的鼻子上。让牙科丙烯酸硬化 30 分钟（图 5D）。
11. 使用弯曲的镊子将 EMG 电极放在眼轮匝肌的背面，并用牙科丙烯酸固定它们。让牙科丙烯酸硬化 15 分钟（图 5E）。
12. 将 EEG 电极连接到传感器的镀银凹槽，并使用焊台焊接它们。之后，使用牙科丙烯酸固定 EEG 电极（图 5F）。
13. 手术后，将鼠标放在加热垫上以保持体温，直到动物从麻醉中完全恢复。
14. 之后，将小鼠放在一个单独的家笼中，可以免费获得含有布洛芬的食物和水（40 mg/kg 在 200 mL 水中）用于手术后的镇痛，持续 10 天。

4. 植入 PBM 板

1. 称重小鼠，并在植入脑电图记录系统后 7 天用 Zoletil 100 和木兰酸盐（分别为 100 mg/kg;10 mg/kg）的混合物肌肉注射到大腿中麻醉。
2. 当后脚退缩反射和尾巴捏合反应停止时，将鼠标固定在立体定向系统中。
3. 在眼睑上涂抹眼药膏，以防止手术过程中眼球干燥。必要时重复此过程。
4. 使用牙科丙烯酸和 Dumont 镊子将直径为 5 毫米的金属板固定在颅骨的枕骨上。让牙科丙烯酸硬化 15 分钟（图 6）。

5. 准备慢性导管

1. 在胰岛素针上标记距斜面一侧 2 cm 的一段。
2. 将胰岛素针固定在持针器中，从斜面尖端的一侧到标记的段。
3. 将 2 cm-PE-10 聚乙烯导管放在针头的整个剩余长度上。
4. 用生理盐水溶液填充导管，并用塑料帽盖住以密封。

6. 将慢性导管植入右心室

1. 植入PBM板后，使用钻头在坐标AP = -0.5 mm和ML = 1.2 mm处打一个直径为1.5 mm的穿孔。
2. 将 PE-10 聚乙烯导管放入立体定向支架中，并将其插入小鼠颅骨 （DV = 2 mm）。然后，使用牙科丙烯酸固定它。让牙科丙烯酸硬化 15 分钟（图 7）。
3. 手术后，将鼠标放在加热垫上以保持体温，直到动物从麻醉中完全恢复。
4. 之后，将小鼠放在一个单独的家笼中，可以免费获得含有布洛芬的食物和水（40 mg/kg 在 200 mL 水中）用于手术后的镇痛，持续 10 天。

7. NREM睡眠脑电图控制下的tPBM

1. 将任何商用 EEG 记录系统连接到鼠标头上的连接器，并设置 PWM 占空比的要求值。
2. 监测 EEG 信号并等待 delta 节律活动。如果看到 NREM 睡眠，则启动 PBM 过程，如果 NREM 睡眠转变为快速眼动 （REM） 睡眠或觉醒，则停止该过程。剂量会随着每次交互作用而增加，直到达到所需的值。
3. 当获得所需的 PBM 剂量时，会话结束。

8. 小鼠脑中 Aβ 淋巴去除的共聚焦成像

1. 将 10 cm 导管连接到胰岛素针头。
2. 使用带有 29 G 针头的 Hamilton 注射器，准备将 5 μL 体积的荧光 β-淀粉样蛋白 （FAβ） 输注到导管中。让导管留在 Hamilton 注射器上。
3. 固定鼠标的手，通过针头将导管连接到植入的慢性导管。
4. 将导管连接到显微注射器。然后，将鼠标放在一个单独的框中;
5. 在显微注射器菜单中选择 0.1 μL/min 的进样速率，然后按开始按钮。
6. 将 FAβ 注射到右侧心室。
7. FAβ 给药后，按照以下算法使用 LED 制作 PBM 61 分钟：17 分钟 - 点亮和 5 分钟 - 暂停超过 61 分钟。
8. PBM 后，静脉注射任何示踪剂，用于通过尾部标记脑血管。
9. 注射后，使用 CO₂ 安乐死室对小鼠实施安乐死。
10. 使用锋利的直剪刀，沿着气管在皮肤上做一个小的横向切口，用笔直的非锋利镊子固定皮肤。
11. 用直剪刀沿着脖子的整个长度做一个纵向切口。
12. 使用弯曲的镊子，夹起唾液腺并小心地将它们与结缔组织分开。将伤口牵开器放在切口的开放部分，并以推回周围组织的方式固定。
13. 使用颈部两侧的两把弯曲镊子检查气管和锁乳突肌之间的区域。
14. 当在每一侧检测到颈深淋巴结 （dcLN） 时，使用钝端的直镊子取下 dcLN 并将其从结缔组织中切下。
15. 将 dcLN 放入装有盐水溶液的培养皿中，并用水平方向的盖玻片（25 mm × 50 mm × 0.17 mm）覆盖它们。
16. 使用任何商用共聚焦显微镜获取整个 dcLN 的图像。

9. 脑组织裂解物中 Aβ 的分析

1. 准备用于测定的样品。
   1. 使用 CO₂ 安乐死室对小鼠实施安乐死。
   2. 将鼠标斩首，去除其头部的皮肤，并去除颅骨上的肌肉。
   3. 用锋利的直剪刀从枕大孔到耳道切开两个切口。
   4. 使用直镊子，将颅骨的腹侧部分、枕骨和形成中耳腔的骨骼分开。
   5. 使用镊子将大脑与顶骨和额骨分开。
   6. 使用直剪刀，去除上颌并剪掉嗅球。
   7. 将大脑置于生理溶液中。
   8. 用冷磷酸盐缓冲盐水冲洗大脑以彻底去除多余的血液，并在均质化前称重。
   9. 制备含有 1.5 mm KH₂PO₄、8 mm Na₂HPO₄、3 mm KCl、137 mm NaCl 和 0.1% Tween20、10 mM EDTA 和新鲜制备的蛋白酶抑制混合物的裂解缓冲液 pH 7.2。
   10. 在冰上用玻璃匀浆器在新鲜裂解缓冲液（200-500 mg 组织样品为 1 mL 裂解缓冲液）中匀浆大脑。
   11. 用超声细胞破碎仪对所得悬浮液进行超声处理，直至溶液澄清。
   12. 将匀浆以 10,000 × g 离心 5 分钟。
   13. 使用单通道机械移液器 （100-1000 μL） 收集上清液并立即检测或分装并储存在 ≤-20 °C。
2. 准备以下材料：具有 450 nm ± 10 nm 滤光片的酶标仪;微量离心管;具有高精度和一次性吸头的单通道或多通道移液器;用于吸干微孔板的吸水纸;洗涤液容器;0.01 mol/L（或 1x）磷酸盐缓冲盐水 （PBS）;以及去离子水或蒸馏水。
3. 准备试剂。
   1. 使用前，将试剂盒和样品的组分置于室温 （RT;18-25 °C）。
   2. 用 1.0 mL 标准稀释剂复溶标准品，在 RT 下保持 10 分钟，然后轻轻摇晃（不要起泡）。标准储备液为 300 pg/mL。准备 5 个含有 0.6 mL 标准稀释剂的试管，并制作三倍稀释系列。
   3. 设置稀释标准品的 5 个点（300 pg/mL、100 pg/mL、33.33 pg/mL、11.11 pg/mL 和 3.70 pg/mL），最后的样品管为空，仅含有标准稀释剂 （0 pg/mL）。
   4. 使用前快速离心检测试剂 A 和检测试剂 B 的储备液。用测定稀释剂 A 和 B 将它们稀释 100 倍以制备工作浓度。
   5. 用 580 mL 去离子水或蒸馏水稀释 20 mL 浓洗涤液 （30x），制成 600 mL 洗涤液 （1x）。
   6. 用消毒过的吸头吸出所需剂量的溶液，不要再次将残留溶液倒入样品瓶中。
4. 进行检测。
   1. 确定稀释标准品、空白样品和样品的孔。
   2. 准备 5 个孔用于标准点，1 个孔用于空白。
      1. 将标准液、空白液和样品稀释液分别加入相应的孔中。然后，立即向每个孔中加入 50 μL 检测试剂 A。
      2. 轻轻摇晃板（建议使用微孔板摇床）并用板密封剂盖住。将板在 37 °C 下孵育 1 小时。检测试剂 A 可能看起来浑浊。将溶液加热至 RT 并轻轻混合，直到看起来均匀。
   3. 吸出溶液，并在喷瓶、多通道移液器、歧管分配器或自动清洗器的帮助下，用 350 μL 的 1x 洗涤溶液洗涤每个孔。让板不受干扰 1-2 分钟。将板卡在吸水纸上，以完全去除所有孔中剩余的液体。重复此过程 3 次。
   4. 最后一次洗涤后，吸出或倒出任何剩余的洗涤缓冲液。通过倒置板并用吸水纸吸干洗涤液，确保完全去除洗涤液。
   5. 向每个孔中加入 100 μL 检测试剂 B 工作溶液，用板密封剂覆盖板后，在 37 °C 下孵育板 30 分钟。
   6. 重复吸液/洗涤步骤，总共 5 分钟。
   7. 向每个孔中加入 90 μL 底物溶液，并用新的板密封剂覆盖板。在 37 °C 下避光孵育 10-20 分钟（不要超过 30 分钟）。加入底物溶液后，液体会变成蓝色。
   8. 向每个孔中加入 50 μL 终止液以终止反应。添加终止液会使液体变黄。轻敲板的侧面以混合液体。如果颜色变化不一致，请轻轻敲击板以确保充分混合。
   9. 确保完全去除板底部的水和指纹，并且液体表面不会形成气泡。然后，立即在酶标仪中以 450 nm 读取板。
5. 计算结果。
   1. 确定每个标准品、对照品和样品的重复读数的平均值。绘制一条标准曲线，y 轴上是 Aβ 1-42 浓度的对数，x 轴上是吸光度。
   2. 绘制一条通过点的最佳拟合曲线，这可以通过回归分析来确定。
   3. 如果使用稀释的样品，则将从标准曲线获得的浓度乘以稀释因子。
      注：对于 ELISA，本研究中使用了测定 Aβ 1-42 的试剂盒。

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结果

第一步，该研究的重点是确定有效的光剂量（1050 nm LED），用于刺激清醒的成年 （2-3 个月大，26-29 g） 雄性 BALB/c 小鼠将荧光 Aβ 从大脑淋巴清除到 dcLNs。根据我们之前对 tPBM 对从大脑中去除不同染料和红细胞的影响的研究，随机选择 10 J/cm^2、20 J/cm² 和 30 J/cm² 的光剂量 7,8,9,10,11,12。

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讨论

MLV 是开发创新技术的重要目标，用于调节大脑的排水和清除大脑中的细胞碎片和废物，尤其是在 MLV 功能下降的老年受试者中 ^1,22。在稳态状态下，深度睡眠与脑组织清洁的自然激活有关^13,14。因此，很明显，预期在深度睡眠期间刺激 MLV 将比在清醒期间更有效^15,16?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Tween20	Helicon,  Russia	SB-G2009-100ML
Catheter	Scientific Commodities Inc., USA	PE-10, 0.28 mm ID × 0.61 mm OD
CO2 chamber	Binder, Germany	CB-S 170
Confocal microscop	Nikon, Japan	A1R MP
Dental acrylic	Zermack, Poland-Russia	Villacryl S, V130V4Z05
Drill	Foredom, Russia	SR W-0016
Dumont forceps	Stoelting, USA	52100-07
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Switzerland	29 G needle
Ibuprofen	Sintez OJSC, Russia	N/A	Analgesic drug
Insulin needle	INSUPEN, Italy	31 G, 0.25 mm x 6 mm
Levomekol antibacterial ointment	Nizhpharm	D06C	For external use at a dose of 40 mg/g, 1 time per day
Micro forceps	Stoelting, USA	52102-02P
Microcentrifuge	Gyrozen, South Korea	GZ-1312
Microinjector	Stoelting, USA	53311
Non-sharp tweezer	Stoelting, USA	52108-83P
PINNACLE system	Pinnacle Technology, USA	8400-K3-SL	System for recording EEG (2 channels) and EMG (1 channel) of mice
Shaving machine	Braun	Series 3310s
Single and multi-channel pipettes	Eppendorf, Austria	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Sodium chloride	Kraspharma, Russia	N/A
Soldering station	AOYUE, China	N/A
Stereotaxic frame	Stoelting, USA	51500
Straight dissecting scissors	Stoelting, USA	52132-10P
Tetracycline	JSC Tatkhimfarmpreparaty, Russia	N/A	Eye ointment
Tweezer	Stoelting, USA	52100-03
Ultrasonic cell disrupter	Biobase, China	USD-500
Wound retractor	Stoelting, USA	52125
Xylanit	Nita-Farm, Russia	N/A	Muscle relaxant
Zoletil 100	Virbac Sante Animale, France	N/A	General anesthesia