Fotobiomodulación bajo controles electroencefalográficos del sueño para la estimulación de la eliminación linfática de toxinas del cerebro de ratón

Resumen

Este estudio presenta la tecnología no invasiva y portátil de fotobiomodulación transcraneal bajo control electroencefalográfico para la estimulación de la eliminación linfática de toxinas (por ejemplo, beta amiloide soluble) del cerebro de ratones machos BALB/c envejecidos y no anestesiados durante el sueño profundo natural.

Resumen

Los vasos linfáticos meníngeos (MLV, por sus siglas en inglés) desempeñan un papel importante en la eliminación de toxinas del cerebro. El desarrollo de tecnologías innovadoras para la estimulación de las funciones de MLV es una dirección prometedora en el progreso del tratamiento de diversas enfermedades cerebrales asociadas con anomalías de MLV, incluidas las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, tumores cerebrales, lesiones cerebrales traumáticas y hemorragias intracraneales. El sueño es un estado natural en el que los procesos de drenaje del cerebro están más activos. Por lo tanto, la estimulación del drenaje cerebral y los MLV durante el sueño pueden tener los efectos terapéuticos más pronunciados. Sin embargo, en la actualidad no existen estas tecnologías comerciales.

Este estudio presenta una nueva tecnología portátil de fotobiomodulación transcraneal (tPBM) bajo control electroencefalográfico (EEG) del sueño, diseñada para fotoestimular la eliminación de toxinas (por ejemplo, beta amiloide soluble (Aβ)) del cerebro de ratones BALB/c envejecidos con la capacidad de comparar la eficacia terapéutica de diferentes recursos ópticos. La tecnología se puede utilizar en las condiciones naturales de una jaula doméstica sin anestesia, manteniendo la actividad motora de los ratones. Estos datos abren nuevas perspectivas para el desarrollo de fototecnologías no invasivas y clínicamente prometedoras para la corrección de los cambios relacionados con la edad en las funciones del MLV y los procesos de drenaje del cerebro, y para la limpieza eficaz de los tejidos cerebrales de metabolitos y toxinas. Esta tecnología está pensada tanto para estudios preclínicos de las funciones del cerebro dormido como para el desarrollo de tratamientos clínicamente relevantes para las enfermedades cerebrales relacionadas con el sueño.

Introducción

Los vasos linfáticos meníngeos (MLV) desempeñan un papel importante en la eliminación de toxinas y metabolitos de los tejidos cerebrales ^1,2,3. El daño de los MLV en diversas enfermedades cerebrales, incluyendo tumores, lesiones cerebrales traumáticas, hemorragias y procesos neurodegenerativos, se acompaña de una disminución de las funciones de los MLV que conduce a la progresión de estas patologías 1,2,3,4,5,6 . Por lo tanto, el desarrollo de métodos para la estimulación de MLVs abre nuevos horizontes en la aparición de tecnologías efectivas para el tratamiento de enfermedades cerebrales. Recientemente, se ha propuesto una tecnología no invasiva para la fotobiomodulación transcraneal efectiva (tPBM) para estimular los MLV y eliminar toxinas como la sangre y el Aβ del cerebro 5,7,8,9,10,11,12. Es interesante notar que el sueño profundo es un factor natural para la activación de los procesos de drenaje linfático en el cerebro ^13,14. Con base en este hecho, es lógico suponer que el tPBM de los MLV durante el sueño puede tener efectos terapéuticos más efectivos que durante la vigilia 9,11,12,15. Sin embargo, actualmente no existen tecnologías comerciales para el tPBM durante el sueño¹⁶. Además, se realizan experimentos con animales para estudiar los efectos terapéuticos del tPBM bajo anestesia, que es necesaria para suministrar luz con precisión al cerebro. Sin embargo, la anestesia afecta significativamente el drenaje del cerebro, lo que reduce la calidad de los resultados de la investigación¹⁷.

Aβ es un producto metabólico de la actividad neuronal normal¹⁸. Como se estableció en neuronas corticales de rata cultivadas, Aβ se libera de ellas a altas tasas en el espacio extracelular (2-4 moléculas/neurona/s para Aβ)¹⁹. Existen evidencias de que la forma disuelta de Aβ, localizada en los espacios extracelular y perivascular, es la más tóxica para las neuronas y las sinapsis²⁰. El Aβ soluble se elimina rápidamente del cerebro humano durante 1-2,5 h²¹. Los MLV son los túneles para la eliminación del Aβ soluble del cerebro ^1,7 que disminuye con la edad, lo que lleva a la acumulación de Aβ en el cerebro envejecido ^1,22. Existen evidencias de que las anormalidades extracelulares de los niveles de Aβ en el cerebro se correlacionan con el rendimiento cognitivo en el envejecimiento y están asociadas al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA)^23,24. Por lo tanto, los roedores viejos y envejecidos se consideran alternativas a los modelos transgénicos para el estudio de la amiloidosis, incluyendo el AD^25,26.

Este estudio presenta una tecnología original y portátil de tPBM bajo control electroencefalográfico (EEG) del sueño profundo o de movimientos oculares no rápidos (NREM) en ratones machos BALB/c no anestesiados de diferentes edades para estimular el aclaramiento linfático de Aβ desde el cerebro hacia el sistema linfático periférico (los ganglios linfáticos cervicales profundos, dcLNs).

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio", Directiva 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos, y las directrices del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación Rusa (Nº 742 de 13.11.1984), que han sido aprobadas por la Comisión de Bioética de la Universidad Estatal de Saratov (Protocolo No. 7, 22.09.2022).

1. Montaje de herrajes

1. Corta un trozo de textolito de aluminio de 1,5 mm de grosor con unas dimensiones de 1,5 mm x 2 mm. Esta parte se denominará placa de circuito impreso (PCB) de diodo emisor de luz (LED) (Figura 1C).
2. Suelde un LED a una PCB, como se muestra en la Figura 1.
3. Suelde dos cables de cobre trenzados a las clavijas de un LED y luego cúbralos con una funda.
4. Imprima el modelo 3D del marco (Figura 1A); coloque un LED (Figura 1B) e imanes (Figura 1D) en el marco; coloque una arandela (Figura 1E) en la cabeza del ratón.
5. Para ensamblar el circuito (Figura 2), siga estos pasos.
   1. Primero, conecte la resistencia (Figura 2; R1) entre un ánodo LED y un puerto de 5 V en el Arduino.
   2. A continuación, conecte un cátodo LED al transistor de efecto de campo (MOSFET) de semiconductor de óxido metálico (Figura 2; Q1) desagüe. A continuación, conecte la fuente MOSFET a tierra.
   3. Conecte la resistencia pull-down (Figura 2; R2) entre la puerta del MOSFET y el suelo. Finalmente, conecte la puerta MOSFET al pin 3 en el Arduino.
6. Conecte un protector de teclado con pantalla de cristal líquido (LCD) al Arduino.
7. Imprime los modelos 3D de la carcasa, la placa de cubierta y los botones. Inserte la placa Arduino con el blindaje del teclado LCD, el MOSFET y el conector LED en la caja, como se muestra en la Figura 3.

2. Guía de software (Figura 4)

1. Descargue el boceto de Arduino (archivo .ino) y ábralo a través del entorno de desarrollo integrado (IDE) de Arduino (Archivo de codificación suplementario 1).
2. Seleccione el puerto de comunicación (COM) correcto y actualice el firmware.
3. La interfaz incluye dos columnas. Utilice los botones Izquierda y Derecha para navegar entre estas columnas. El indicador de selección se encuentra a la izquierda de la columna.
4. La columna de la izquierda de la pantalla es el campo de selección del ciclo de trabajo de modulación de ancho de pulso (PWM). Utilice los botones Arriba y Abajo para ajustar el ciclo de trabajo. Logre la dosis de 10/20/30 Dj/^cm2 de PBM con un ciclo de trabajo PWM correspondiente del 2%/4%/6% en una sesión de 17 minutos.
5. La columna de la derecha de la pantalla es el campo RUN/Off . Para seleccionar esta columna, presione el botón derecho en el teclado y, a continuación, presione Seleccionar. Cuando el proceso se esté ejecutando, el indicador de actividad parpadeará y el texto del botón EJECUTAR cambiará a APAGADO.
   NOTA. Los ratones se preparan para los experimentos durante un período de 10 días, incluida la implantación de electrodos de EEG, la implantación de un catéter crónico en el ventrículo lateral derecho para la inyección de Aβ fluorescente y la colocación de una placa para PBM.

3. Implantación de un sistema de registro de EEG (Figura 5)

1. Pesar al ratón y anestesiarlo con una mezcla de Zoletil 100 y Xilanita (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) mediante inyección intramuscular en el muslo.
2. Cuando cesen los reflejos de retirada del pie trasero y la respuesta de pellizco de la cola, coloque el ratón en un marco estereotáxico sobre una almohadilla térmica (Figura 5A).
3. Aplique ungüento oftálmico en los párpados para evitar que los globos oculares se sequen durante la cirugía. Repita este procedimiento siempre que sea necesario.
4. Afeita la cabeza en el área desde los huesos nasales hasta los huesos occipitales con una máquina de afeitar y esteriliza primero la piel expuesta con alcohol.
5. Con unas tijeras de disección rectas, corte el cuero cabelludo, sujételo con micropinzas, limpie el cráneo de la fascia y séquelo con hisopos de algodón. Si es necesario, utilice los agentes hemostáticos.
6. Con un taladro con un diámetro de 1,3 mm, haga 2 agujeros en los huesos temporales a cada lado a lo largo de las coordenadas: AP = -1 mm para el primer par de tornillos y AP = -3 mm para el segundo par de tornillos.
7. Coloque los tornillos de EEG con cables conductores en alcohol durante 5 min. Después, coloque los tornillos de EEG en la solución salina.
8. Coloque cuatro tornillos plateados con electrodos en los orificios a una profundidad de 1 mm (Figura 5B).
9. Fije los tornillos en la superficie del cráneo con acrílico dental de modo que los electrodos que se extienden desde ellos se ubiquen hacia la nariz del animal (Figura 5C). Deje que el acrílico dental se endurezca durante 15 minutos.
10. Coloque un sensor de registro de EEG en la nariz del animal con acrílico dental. Deje que el acrílico dental se endurezca durante 30 minutos (Figura 5D).
11. Coloque los electrodos EMG en la parte posterior del músculo orbicular de los ojos con pinzas curvas y fíjelos con el acrílico dental. Deje que el acrílico dental se endurezca durante 15 minutos (Figura 5E).
12. Conecte los electrodos de EEG al hueco plateado del sensor y suéldelos con una estación de soldadura. Después, fije los electrodos de EEG con el acrílico dental (Figura 5F).
13. Después de la cirugía, coloque el ratón en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal hasta que el animal se recupere completamente de la anestesia.
14. Después, coloque al ratón en una jaula doméstica individual con libre acceso a comida y agua con ibuprofeno (40 mg/kg en 200 mL de agua) para la analgesia después de la cirugía durante 10 días.

4. Implantación de una placa para PBM

1. Pesar el ratón y anestesiarlo con una mezcla de Zoletil 100 y Xilanita (100 mg/kg; 10 mg/kg, respectivamente) mediante inyección intramuscular en el muslo 7 días después de la implantación del sistema de registro de EEG.
2. Cuando cesen los reflejos de retirada del pie trasero y la respuesta de pellizco de la cola, fije el ratón en un sistema estereotáctico.
3. Aplique ungüento oftálmico en los párpados para evitar que los globos oculares se sequen durante la cirugía. Repita este procedimiento siempre que sea necesario.
4. Fije una placa metálica de 5 mm de diámetro en el hueso occipital del cráneo utilizando acrílico dental y pinzas Dumont. Deje que el acrílico dental se endurezca durante 15 minutos (Figura 6).

5. Preparación de un catéter crónico

1. Marque en la aguja de insulina un segmento a 2 cm del lado del extremo biselado.
2. Fije la aguja de insulina en el soporte de la aguja desde el lado de la punta biselada hasta el segmento marcado.
3. Colocar un catéter de polietileno PE-10 de 2 cm en toda la longitud restante de la aguja.
4. Llene el catéter con una solución salina y cúbralo con una tapa de plástico para sellarlo.

6. Implante de un catéter crónico en el ventrículo lateral derecho

1. Después de la implantación de la placa para PBM, haga un orificio de trepanación en las coordenadas AP = -0,5 mm y ML = 1,2 mm, con un diámetro de 1,5 mm, utilizando un taladro.
2. Coloque el catéter de polietileno PE-10 en un soporte estereotáctico e insértelo en el cráneo del ratón (DV = 2 mm). Después, fíjalo con el acrílico dental. Deje que el acrílico dental se endurezca durante 15 minutos (Figura 7).
3. Después de la cirugía, coloque el ratón en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal hasta que el animal se recupere completamente de la anestesia.
4. Después, coloque al ratón en una jaula doméstica individual con libre acceso a comida y agua con ibuprofeno (40 mg/kg en 200 mL de agua) para la analgesia después de la cirugía durante 10 días.

7. tPBM bajo control EEG del sueño NREM

1. Conecte cualquier sistema de registro de EEG comercial al conector en la cabeza del mouse y establezca el valor requerido del ciclo de trabajo PWM.
2. Controle la señal del EEG y espere la actividad del ritmo delta. Si se observa sueño NREM, inicie el proceso PBM y deténgalo si el sueño NREM pasa a un sueño de movimientos oculares rápidos (REM) o vigilia. La dosis aumenta con cada interacción hasta alcanzar el valor requerido.
3. Cuando se obtiene la dosis requerida de PBM, la sesión termina.

8. Imagen confocal de la eliminación linfática de Aβ del cerebro de ratón

1. Conecte un catéter de 10 cm a una aguja de insulina.
2. Con una jeringa Hamilton con aguja de 29 G, prepare una infusión de beta-amiloide fluorescente (FAβ) en un volumen de 5 μL en el catéter. Deje que el catéter permanezca en una jeringa Hamilton.
3. Fije la mano del ratón y conecte el catéter a través de una aguja al catéter crónico implantado.
4. Conecte el catéter a un microinyector. Luego, coloque el mouse en una caja individual;
5. Seleccione la tasa de inyección de 0,1 μL/min en el menú del microinyector y pulse el botón Inicio.
6. Inyectar FAβ en el ventrículo lateral derecho.
7. Después de la administración de FAβ, realice PBM usando un LED durante 61 min siguiendo el algoritmo: 17 min - luz y 5 min - pausa durante 61 min.
8. Después de la PBM, inyecte por vía intravenosa cualquier marcador para marcar los vasos cerebrales a través de la cola.
9. Después de la inyección, eutanasiar ratones utilizando la cámara de eutanasia de CO₂ .
10. Con unas tijeras afiladas y rectas, haga una pequeña incisión transversal en la piel a lo largo de la tráquea, sujetando la piel con pinzas rectas no afiladas.
11. Haz una incisión longitudinal a lo largo de todo el cuello con unas tijeras rectas.
12. Con pinzas curvas, tome las glándulas salivales y sepárelas cuidadosamente del tejido conectivo. Coloque un retractor de heridas en la sección abierta de la incisión y fíjelo de tal manera que empuje hacia atrás los tejidos circundantes.
13. Examine el área entre la tráquea y el músculo cleidomastoideo con dos pinzas curvas de ambos lados del cuello.
14. Cuando se detecte el ganglio linfático cervical profundo (dcLN, por sus siglas en inglés) en cada lado, quítese los dcLN con pinzas rectas con extremos romos y córtelo del tejido conectivo.
15. Coloque los dcLN en una placa de Petri con una solución salina y cúbralos con un cubreobjetos orientado horizontalmente (25 mm × 50 mm × 0,17 mm).
16. Utilice cualquier microscopio confocal comercial para obtener imágenes de dcLN completos.

9. Análisis de Aβ en los lisados de tejidos cerebrales

1. Prepare las muestras para el ensayo.
   1. Eutanasia de ratones utilizando la cámara de eutanasia de CO₂ .
   2. Decapita al ratón, quítale la piel de la cabeza y quita los músculos del cráneo.
   3. Haga dos incisiones con tijeras afiladas y rectas desde el agujero occipital grande hasta el conducto auditivo.
   4. Con unas pinzas rectas, separe la parte ventral del cráneo, el hueso occipital y los huesos que forman las cavidades del oído medio.
   5. Con unas pinzas, separe el cerebro de los huesos parietal y frontal.
   6. Con unas tijeras rectas, retire la mandíbula superior y corte los bulbos olfativos.
   7. Coloca el cerebro en la solución fisiológica.
   8. Enjuague el cerebro con solución salina fría tamponada con fosfato para eliminar completamente el exceso de sangre y pesarlo antes de la homogeneización.
   9. Prepare un tampón de lisado pH 7,2 que contenga 1,5 mm de KH₂PO₄, 8 mm de Na,₂HPO₄, 3 mm de KCl, 137 mm de NaCl y 0,1% de Tween20, 10 mM de EDTA con una mezcla inhibidora de proteasas recién preparada.
   10. Homogeneizar el cerebro en tampón de lisis fresco (1 mL de tampón de lisis para una muestra de tejido de 200-500 mg) con un homogeneizador de vidrio en hielo.
   11. Sonicar una suspensión resultante con un disruptor celular ultrasónico hasta que la solución se clarifique.
   12. Centrifugar los homogeneizados a 10.000 × g durante 5 min.
   13. Recoja el sobrenadante con una pipeta mecánica de un solo canal (100-1000 μL) y ensaye inmediatamente o alícuotas y almacene a ≤-20 °C.
2. Prepare los siguientes materiales: lector de microplacas con filtro de 450 nm ± 10 nm; tubos de microcentrífuga; pipetas monocanal o multicanal de alta precisión y puntas desechables; papel absorbente para secar la microplaca; recipiente para solución de lavado; 0,01 mol/L (o 1x) solución salina tamponada con fosfato (PBS); y agua desionizada o destilada.
3. Prepara los reactivos.
   1. Lleve los componentes del kit y las muestras a temperatura ambiente (RT; 18-25 °C) antes de usar.
   2. Reconstituya el patrón con 1,0 mL de diluyente estándar, manténgalo durante 10 min a RT y agite suavemente (no hasta formar espuma). La solución madre estándar es de 300 pg/mL. Prepare 5 tubos que contengan un volumen de 0,6 mL de diluyente estándar y haga una serie de dilución triple.
   3. Coloque 5 puntos (300 pg/mL, 100 pg/mL, 33.33 pg/mL, 11.11 pg/mL y 3.70 pg/mL) del patrón diluido, y los últimos tubos con un blanco que contenga solo el diluyente estándar (0 pg/mL).
   4. Centrifugar rápidamente las soluciones madre del reactivo de detección A y del reactivo de detección B antes de usarlas. Dilúyalos 100 veces con los diluyentes de ensayo A y B para preparar la concentración de trabajo.
   5. Diluya 20 mL de la solución de lavado concentrada (30x) con 580 mL de agua desionizada o destilada para hacer 600 mL de solución de lavado (1x).
   6. Aspire la dosis necesaria de la solución con puntas esterilizadas y no vuelva a verter la solución residual en el vial.
4. Realice el ensayo.
   1. Determine los pozos para un patrón diluido, un blanco y una muestra.
   2. Prepare 5 pocillos para los puntos estándar y un pocillo para los blancos.
      1. Agregue 50 μL de diluciones estándar, en blanco y de muestra en los pocillos correspondientes, respectivamente. A continuación, añada inmediatamente 50 μL de reactivo de detección A a cada pocillo.
      2. Agite la placa suavemente (se recomienda un agitador de microplacas) y cúbrala con un sellador de placas. Incubar la placa a 37 °C durante 1 h. El reactivo de detección A puede aparecer turbio. Caliente la solución a RT y mezcle suavemente hasta que parezca uniforme.
   3. Aspire la solución y lave cada pocillo con 350 μL de 1x solución de lavado con la ayuda de una botella rociadora, una pipeta multicanal, un dispensador de colector o una lavadora automática. Deje el plato sin tocar durante 1-2 minutos. Coloque la placa en papel absorbente para eliminar completamente el líquido restante de todos los pocillos. Repita este procedimiento 3 veces.
   4. Después del último lavado, aspire o decante cualquier tampón de lavado restante. Asegúrese de eliminar completamente la solución de lavado invirtiendo la placa y secándola contra el papel absorbente.
   5. Añada 100 μL de solución de trabajo del reactivo de detección B a cada pocillo e incube la placa durante 30 min a 37 °C después de cubrirla con el sellador de placas.
   6. Repita los pasos de aspiración/lavado durante un total de 5 minutos.
   7. Agregue 90 μL de solución de sustrato a cada pocillo y cubra la placa con un nuevo sellador de placas. Incubar durante 10-20 min a 37 °C (No exceder los 30 min) protegido de la luz. Después de agregar la solución de sustrato, el líquido se volverá azul.
   8. Agregue 50 μL de una solución de parada a cada pocillo para terminar la reacción. Agregar la solución de parada hará que el líquido se vuelva amarillo. Golpea el plato de lado para mezclar el líquido. Si el cambio de color es inconsistente, golpee suavemente la placa para asegurar una mezcla completa.
   9. Asegure la eliminación completa del agua y las huellas dactilares en la parte inferior de la placa y la formación de burbujas en la superficie del líquido. Luego, lea la placa en un lector de microplacas a 450 nm inmediatamente.
5. Calcula los resultados.
   1. Determine el promedio de las lecturas duplicadas para cada patrón, control y muestra. Traza una curva estándar con el logaritmo de la concentración de Aβ 1-42 en el eje y y la absorbancia en el eje x.
   2. Dibuje una curva de mejor ajuste a través de los puntos, que se puede determinar mediante un análisis de regresión.
   3. Si se utilizaron muestras diluidas, multiplique la concentración obtenida de la curva estándar por el factor de dilución.
      NOTA: Para ELISA, en este estudio se utilizó un kit para determinar Aβ 1-42.

Resultados

En el primer paso, el estudio se ha centrado en establecer la dosis de luz efectiva (un LED de 1050 nm) para la estimulación de la eliminación linfática de Aβ fluorescente del cerebro a dcLN en ratones BALB/c machos adultos despiertos (2-3 meses de edad, 26-29 g). Las dosis de luz se seleccionaron aleatoriamente como 10 J/^cm2, 20 J/^{cm2 y} 30 J/^cm2 en base a nuestros estudios previos de los efectos del tPBM en la eliminación de diferentes colorantes y glóbulos rojos del cer...

Discusión

Los MLV son un objetivo importante para el desarrollo de tecnologías innovadoras para la modulación del drenaje cerebral y la eliminación de desechos celulares y desechos del cerebro, especialmente en sujetos de edad avanzada cuya función de MLV^{disminuye 1,22}. En un estado homeostático, el sueño profundo se asocia con la activación natural de la limpieza del tejido cerebral^13,14. Por lo tanto, es o...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Tween20	Helicon,  Russia	SB-G2009-100ML
Catheter	Scientific Commodities Inc., USA	PE-10, 0.28 mm ID × 0.61 mm OD
CO2 chamber	Binder, Germany	CB-S 170
Confocal microscop	Nikon, Japan	A1R MP
Dental acrylic	Zermack, Poland-Russia	Villacryl S, V130V4Z05
Drill	Foredom, Russia	SR W-0016
Dumont forceps	Stoelting, USA	52100-07
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Switzerland	29 G needle
Ibuprofen	Sintez OJSC, Russia	N/A	Analgesic drug
Insulin needle	INSUPEN, Italy	31 G, 0.25 mm x 6 mm
Levomekol antibacterial ointment	Nizhpharm	D06C	For external use at a dose of 40 mg/g, 1 time per day
Micro forceps	Stoelting, USA	52102-02P
Microcentrifuge	Gyrozen, South Korea	GZ-1312
Microinjector	Stoelting, USA	53311
Non-sharp tweezer	Stoelting, USA	52108-83P
PINNACLE system	Pinnacle Technology, USA	8400-K3-SL	System for recording EEG (2 channels) and EMG (1 channel) of mice
Shaving machine	Braun	Series 3310s
Single and multi-channel pipettes	Eppendorf, Austria	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Sodium chloride	Kraspharma, Russia	N/A
Soldering station	AOYUE, China	N/A
Stereotaxic frame	Stoelting, USA	51500
Straight dissecting scissors	Stoelting, USA	52132-10P
Tetracycline	JSC Tatkhimfarmpreparaty, Russia	N/A	Eye ointment
Tweezer	Stoelting, USA	52100-03
Ultrasonic cell disrupter	Biobase, China	USD-500
Wound retractor	Stoelting, USA	52125
Xylanit	Nita-Farm, Russia	N/A	Muscle relaxant
Zoletil 100	Virbac Sante Animale, France	N/A	General anesthesia