פוטוביומודולציה תחת בקרות אלקטרואנצפלוגרפיות של שינה לגירוי של הסרת רעלים לימפטיים ממוח העכבר

Summary

מחקר זה מציג את הטכנולוגיה הלא פולשנית והניידת של פוטוביומודולציה טרנס-גולגולתית תחת בקרה אלקטרואנצפלוגרפית לגירוי הסרת רעלים לימפטיים (למשל, עמילואיד-בטא מסיס) ממוחם של עכברים זכרים מזדקנים ולא מורדמים מסוג BALB/c במהלך שינה עמוקה טבעית.

Abstract

כלי הלימפה של קרום המוח (MLVs) ממלאים תפקיד חשוב בסילוק רעלים מהמוח. פיתוח טכנולוגיות חדשניות לגירוי תפקודי MLV הוא כיוון מבטיח בהתקדמות הטיפול במחלות מוח שונות הקשורות להפרעות MLV, כולל מחלות אלצהיימר ופרקינסון, גידולי מוח, פגיעות מוח טראומטיות ודימומים תוך גולגולתיים. שינה היא מצב טבעי שבו תהליכי הניקוז של המוח פעילים ביותר. לכן, גירוי של ניקוז המוח MLV במהלך השינה עשוי להיות ההשפעות הטיפוליות הבולטות ביותר. עם זאת, טכנולוגיות מסחריות כאלה אינן קיימות כיום.

מחקר זה מציג טכנולוגיה ניידת חדשה של פוטוביומודולציה טרנס-גולגולתית (tPBM) תחת בקרה אלקטרואנצפלוגרפית (EEG) של שינה, שנועדה לעורר סילוק רעלים (למשל, עמילואיד-בטא מסיס (Aβ)) ממוחם של עכברי BALB/c מזדקנים עם היכולת להשוות את היעילות הטיפולית של משאבים אופטיים שונים. ניתן להשתמש בטכנולוגיה במצב הטבעי של כלוב ביתי ללא הרדמה, תוך שמירה על הפעילות המוטורית של עכברים. נתונים אלה פותחים אפשרויות חדשות לפיתוח טכנולוגיות פוטו לא פולשניות ומבטיחות קלינית לתיקון שינויים הקשורים לגיל בתפקודי MLV ובתהליכי ניקוז המוח ולניקוי יעיל של רקמות המוח ממטבוליטים ורעלנים. טכנולוגיה זו מיועדת הן למחקרים פרה-קליניים של תפקודי המוח הישן והן לפיתוח טיפולים רלוונטיים קלינית למחלות מוח הקשורות לשינה.

Introduction

כלי הלימפה של קרום המוח (MLVs) ממלאים תפקיד חשוב בסילוק רעלים ומטבוליטים מרקמות המוח ^1,2,3. נזק של MLV במחלות מוח שונות, כולל גידולים, פגיעות מוח טראומטיות, דימומים ותהליכים נוירודגנרטיביים, מלווה בירידה בתפקודי MLV מה שמוביל להתקדמות של פתולוגיות אלה 1,2,3,4,5,6 . לכן, פיתוח שיטות לגירוי של MLVs פותח אופקים חדשים בהופעתן של טכנולוגיות יעילות לטיפול במחלות מוח. לאחרונה, הוצעה טכנולוגיה לא פולשנית לפוטוביומודולציה טרנס-גולגולתית יעילה (tPBM) כדי לעורר MLV ולהסיר רעלים כגון דם ו-Aβ מהמוח 5,7,8,9,10,11,12. מעניין לציין כי שינה עמוקה היא גורם טבעי להפעלת תהליכי ניקוז לימפטי במוח^13,14. בהתבסס על עובדה זו, הגיוני להניח כי tPBM של MLV במהלך השינה עשוי להיות בעל השפעות טיפוליות יעילות יותר מאשר במהלך ערות 9,11,12,15. עם זאת, אין כיום טכנולוגיות מסחריות עבור tPBM במהלך שינה¹⁶. בנוסף, ניסויים בבעלי חיים לחקר ההשפעות הטיפוליות של tPBM מבוצעים תחת הרדמה, אשר נדרשת כדי להעביר אור במדויק למוח. עם זאת, הרדמה משפיעה באופן משמעותי על ניקוז המוח, מה שמקטין את איכות תוצאות המחקר¹⁷.

Aβ הוא תוצר מטבולי של פעילות עצבית תקינה¹⁸. כפי שהתבסס בתאי עצב בקליפת המוח של חולדות בתרבית, Aβ משתחרר מהם בקצב גבוה לתוך החלל החוץ-תאי (2-4 מולקולות/נוירונים/ים עבור Aβ)¹⁹. ישנן ראיות לכך שהצורה המומסת של Aβ, הממוקמת בחללים החוץ תאיים והפריווסקולריים, רעילה ביותר לנוירונים ולסינפסות²⁰. Aβ המסיס מנוקה במהירות מהמוח האנושי במהלך 1-2.5 שעות²¹. MLVs הם המנהרות להסרת Aβ המסיס מהמוח ^1,7 שיורד עם הגיל, מה שמוביל להצטברות של Aβ במוח הזקן ^1,22. ישנן ראיות לכך שהפרעות חוץ-תאיות ברמות Aβ במוח מתואמות עם ביצועים קוגניטיביים בהזדקנות וקשורות להתפתחות מחלת אלצהיימר (AD)^23,24. לכן, מכרסמים זקנים וזקנים נחשבים חלופות למודלים טרנסגניים לחקר עמילואידוזיס, כולל AD^25,26.

מחקר זה מציג טכנולוגיית tPBM מקורית וניידת תחת בקרה אלקטרואנצפלוגרפית (EEG) של שינה עמוקה או לא מהירה של תנועות עיניים (NREM) בעכברי BALB/c זכרים לא מורדמים בגילאים שונים כדי לעורר פינוי לימפתי של Aβ מהמוח למערכת הלימפה ההיקפית (בלוטות הלימפה הצוואריות העמוקות, dcLNs).

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם ל"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה", הנחיה 2010/63/האיחוד האירופי להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות, והנחיות משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (Nº 742 מיום 13.11.1984), שאושרו על ידי הוועדה לביואתיקה של אוניברסיטת סראטוב (פרוטוקול מס '7, 22.09.2022).

1. הרכבת חומרה

1. חותכים חתיכת רדיד אלומיניום בעובי 1.5 מ"מ למידות של 1.5 מ"מ x 2 מ"מ. חלק זה ייקרא דיודה פולטת אור (LED) מעגל מודפס (PCB) (איור 1C).
2. הלחמת נורית LED ללוח מעגלים מודפסים, כפי שמוצג באיור 1.
3. הלחמת שני חוטי נחושת תקועים לפינים של LED ולאחר מכן לכסות אותם בשרוול.
4. הדפס את המודל התלת-ממדי של המסגרת (איור 1A); מקמו נורית LED (איור 1B) ומגנטים (איור 1D) על המסגרת; הניחו מכונת כביסה (איור 1E) על ראשו של העכבר.
5. כדי להרכיב את המעגל (איור 2), בצעו את השלבים הבאים.
   1. ראשית, חברו את הנגד (איור 2; R1) בין אנודת LED ליציאת 5 V בארדואינו.
   2. לאחר מכן, חברו קתודה מסוג LED לטרנזיסטור אפקט שדה של מתכת-תחמוצת-מוליך למחצה (MOSFET) (איור 2; שאלה 1) ניקוז. לאחר מכן, חבר את מקור MOSFET לאדמה.
   3. חבר את הנגד הנפתח (איור 2; R2) בין שער MOSFET לקרקע. לבסוף, חבר את שער MOSFET לסיכה 3 על הארדואינו.
6. חבר מגן לוח מקשים עם צג גביש נוזלי (LCD) לארדואינו.
7. הדפס את המודלים התלת-ממדיים של המארז, את לוחית הכיסוי ואת הכפתורים. הכניסו את לוח הארדואינו עם מגן לוח מקשים LCD, MOSFET ומחבר LED לתוך המארז, כפי שמוצג באיור 3.

2. מדריך תוכנה (איור 4)

1. הורד את סקיצה Arduino (קובץ .ino) ופתח אותו באמצעות סביבת הפיתוח המשולבת Arduino (IDE) (קובץ קידוד משלים 1).
2. בחר את יציאת התקשורת (COM) הנכונה והבהב את הקושחה.
3. הממשק כולל שתי עמודות. השתמש בלחצנים שמאל וימין כדי לנווט בין עמודות אלה. מחוון הבחירה ממוקם משמאל לעמודה.
4. העמודה השמאלית במסך היא שדה בחירת מחזור העבודה של אפנון רוחב פולס (PWM). השתמש בלחצנים למעלה ולמטה כדי להתאים את מחזור העבודה. השג את המינון של 10/20/30 Dj/cm² של PBM עם מחזור עבודה PWM מקביל של 2%/4%/6% בהפעלה של 17 דקות.
5. העמודה השמאלית במסך היא השדה RUN/Off . כדי לבחור עמודה זו, לחץ על לחצן לחצן ימין בלוח המקשים ולאחר מכן הקש בחר. כאשר התהליך פועל, מחוון הפעילות יהבהב והטקסט בלחצן הפעל ישתנה לכבוי.
   הערה. עכברים מוכנים לניסויים במשך תקופה של 10 ימים, כולל השתלת אלקטרודות EEG, השתלת קטטר כרוני בחדר הצדדי הימני להזרקת Aβ פלואורסצנטי, ומיקום צלחת עבור PBM.

3. השתלת מערכת רישום EEG (איור 5)

1. שקלו את העכבר והרדימו אותו בתערובת של זולטיל 100 וקסילניט (100 מ"ג/ק"ג; 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה) על ידי הזרקה תוך שרירית לירך.
2. כאשר רפלקסי הנסיגה של כף הרגל האחורית ותגובת צביטת הזנב נפסקים, הניחו את העכבר במסגרת סטריאוטקסית מעל כרית חימום (איור 5A).
3. יש למרוח משחה אופתלמית על העפעפיים כדי למנוע התייבשות של גלגלי העיניים במהלך הניתוח. חזור על הליך זה במידת הצורך.
4. יש לגלח את הראש באזור שבין עצמות האף לעצמות העורפיות באמצעות מכונת גילוח ולעקר תחילה עור חשוף באלכוהול.
5. בעזרת מספריים ישרים חותכים את הקרקפת, מחזיקים אותה במלקחיים זעירים, מנקים את הגולגולת מהפאשיה ומייבשים אותה במקלוני צמר גפן. במידת הצורך, השתמש בסוכנים המוסטטיים.
6. באמצעות מקדחה בקוטר של 1.3 מ"מ, צור 2 חורים בעצמות הרקתיות בכל צד לאורך הקואורדינטות: AP = -1 מ"מ עבור זוג הברגים הראשון ו- AP = -3 מ"מ עבור זוג הברגים השני.
7. מניחים את ברגי ה-EEG עם מוליכי חוט באלכוהול למשך 5 דקות. לאחר מכן, הניחו את ברגי ה-EEG בתמיסת המלח.
8. הכניסו ארבעה ברגים מצופים כסף עם אלקטרודות לתוך החורים לעומק של 1 מ"מ (איור 5B).
9. קבעו את הברגים על פני הגולגולת באמצעות אקריליק דנטלי כך שהאלקטרודות היוצאות מהם ימוקמו לכיוון האף של החיה (איור 5C). תנו לאקריליק הדנטלי להתקשות למשך 15 דקות.
10. חברו חיישן רישום EEG לאף של בעל החיים באמצעות אקריליק דנטלי. אפשרו לאקריליק הדנטלי להתקשות במשך 30 דקות (איור 5D).
11. הניחו את אלקטרודות ה-EMG על גב שריר ה-orbicularis oculi באמצעות פינצטה מעוקלת וקיבעו אותן באמצעות אקריליק דנטלי. אפשרו לאקריליק הדנטלי להתקשות במשך 15 דקות (איור 5E).
12. חברו את אלקטרודות ה-EEG לשקע המצופה כסף של החיישן והלחמתו באמצעות תחנת הלחמה. לאחר מכן, תקנו את אלקטרודות ה-EEG באמצעות אקריליק דנטלי (איור 5F).
13. לאחר הניתוח, הניחו את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד שבעל החיים יתאושש לחלוטין מההרדמה.
14. לאחר מכן, הכנס את העכבר לכלוב ביתי אישי עם גישה חופשית למזון ומים עם איבופרופן (40 מ"ג / ק"ג ב 200 מ"ל מים) לשיכוך כאבים לאחר ניתוח במשך 10 ימים.

4. השתלת צלחת עבור PBM

1. שקלו את העכבר והרדימו אותו בתערובת של זולטיל 100 וקסילניט (100 מ"ג/ק"ג; 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה) על ידי הזרקה תוך שרירית לירך 7 ימים לאחר השתלת מערכת רישום EEG.
2. כאשר רפלקסי הנסיגה של כף הרגל האחורית ותגובת צביטת הזנב מפסיקים, תקן את העכבר במערכת סטריאוטקטית.
3. יש למרוח משחה אופתלמית על העפעפיים כדי למנוע התייבשות של גלגלי העיניים במהלך הניתוח. חזור על הליך זה במידת הצורך.
4. תקן צלחת מתכת בקוטר של 5 מ"מ על עצם העורפית של הגולגולת באמצעות אקריליק דנטלי ומלקחיים Dumont. אפשרו לאקריליק הדנטלי להתקשות במשך 15 דקות (איור 6).

5. הכנת קטטר כרוני

1. סמן על מחט האינסולין קטע 2 ס"מ מהצד של הקצה המשופע.
2. קבע את מחט האינסולין במחזיק המחט מהצד של הקצה המשופע לקטע המסומן.
3. מניחים קטטר פוליאתילן 2 ס"מ-PE-10 על כל אורך המחט הנותרת.
4. מלאו את הצנתר בתמיסת מלח וכסו אותו במכסה פלסטיק כדי לאטום אותו.

6. השתלת קטטר כרוני בחדר הלטרלי הימני

1. לאחר השתלת הצלחת עבור PBM, צור חור טרפנציה בקואורדינטות AP = -0.5 מ"מ ו- ML = 1.2 מ"מ, בקוטר של 1.5 מ"מ, באמצעות מקדחה.
2. הניחו את צנתר הפוליאתילן PE-10 במחזיק סטריאוטקטי והכניסו אותו לגולגולת העכבר (DV = 2 מ"מ). לאחר מכן, תקן אותו באמצעות אקריליק דנטלי. אפשרו לאקריליק הדנטלי להתקשות במשך 15 דקות (איור 7).
3. לאחר הניתוח, הניחו את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד שבעל החיים יתאושש לחלוטין מההרדמה.
4. לאחר מכן, הכנס את העכבר לכלוב ביתי אישי עם גישה חופשית למזון ומים עם איבופרופן (40 מ"ג / ק"ג ב 200 מ"ל מים) לשיכוך כאבים לאחר ניתוח במשך 10 ימים.

7. tPBM תחת בקרת EEG של שנת NREM

1. חבר כל מערכת הקלטה מסחרית EEG למחבר שעל ראש העכבר והגדר את ערך הדרישה של מחזור העבודה של PWM.
2. עקוב אחר אות ה- EEG והמתן לפעילות קצב דלתא. אם רואים שנת NREM, התחילו את תהליך PBM ועצרו את התהליך אם שנת NREM עוברת לשינה או ערות של תנועת עיניים מהירה (REM). המינון עולה עם כל אינטראקציה עד שהוא מגיע לערך הנדרש.
3. כאשר מתקבל מינון PBM הנדרש, הפגישה מסתיימת.

8. הדמיה קונפוקלית של הסרת הלימפה של Aβ ממוח העכבר

1. חברו קטטר בקוטר 10 ס"מ למחט אינסולין.
2. בעזרת מזרק המילטון עם מחט 29 גרם, מכינים עירוי של בטא-עמילואיד פלואורסצנטי (FAβ) בנפח של 5 μL לתוך הצנתר. תנו לצנתר להישאר על מזרק המילטון.
3. תקן את ידו של העכבר וחבר את הצנתר דרך מחט לצנתר הכרוני המושתל.
4. חבר את הצנתר למיקרו-מזרק. לאחר מכן, הנח את העכבר בתיבה בודדת;
5. בחר את קצב ההזרקה 0.1 μL/min בתפריט המיקרו-מזרק ולחץ על לחצן התחל.
6. בצע הזרקה של FAβ לחדר הלטרלי הימני.
7. לאחר ניהול FAβ, בצע PBM באמצעות נורית LED למשך 61 דקות בהתאם לאלגוריתם: 17 דקות - אור ו -5 דקות - הפסקה מעל 61 דקות.
8. לאחר PBM, להזריק תוך ורידי כל נותב עבור תיוג כלי הדם במוח דרך הזנב.
9. לאחר ההזרקה, הרדימו עכברים באמצעות תא המתת חסד CO₂ .
10. בעזרת מספריים חדים וישרים מבצעים חתך רוחבי קטן בעור לאורך קנה הנשימה, ומחזיקים את העור בפינצטה ישרה ולא חדה.
11. בצע חתך אורכי לכל אורך הצוואר באמצעות מספריים ישרים.
12. באמצעות פינצטה מעוקלת, לקחת את בלוטות הרוק בזהירות להפריד אותם מרקמת החיבור. מניחים מסיר פצע על החלק הפתוח של החתך ולתקן אותו באופן כזה כדי לדחוף בחזרה את הרקמות שמסביב.
13. בדקו את האזור שבין קנה הנשימה לשריר הקליידומסטואיד באמצעות שתי פינצטות מעוקלות משני צידי הצוואר.
14. כאשר בלוטת הלימפה הצווארית העמוקה (dcLN) מזוהה בכל צד, להסיר dcLN באמצעות פינצטה ישרה עם קצוות קהים לחתוך אותו מרקמת החיבור.
15. מניחים dcLN בצלחת פטרי עם תמיסת מלח ומכסים אותם בזכוכית כיסוי אופקית (25 מ"מ × 50 מ"מ × 0.17 מ"מ).
16. השתמש בכל מיקרוסקופ קונפוקלי מסחרי כדי לקבל תמונות של dcLN שלמים.

9. ניתוח של Aβ בליזטים של רקמות המוח

1. הכינו את הדגימות לבדיקה.
   1. המתת חסד עכברים באמצעות תא המתת חסד CO₂ .
   2. ערפו את ראשו של העכבר, הסירו את העור מראשו והסירו את שרירי הגולגולת.
   3. בצע שני חתכים עם מספריים חדים וישרים מהפתח העורפי הגדול לתעלת השמע.
   4. באמצעות פינצטה ישרה, להפריד את החלק הגחוני של הגולגולת, עצם העורפית, ואת העצמות היוצרות את חללי האוזן התיכונה.
   5. באמצעות פינצטה, להפריד את המוח מן העצמות הקודקודית והמצחית.
   6. בעזרת מספריים ישרים מסירים את הלסת העליונה וחותכים את פקעות הריח.
   7. מקמו את המוח בתמיסה הפיזיולוגית.
   8. שטפו את המוח במי מלח קרים החוצצים בפוספט כדי להסיר דם עודף ביסודיות ולשקול לפני הומוגניזציה.
   9. הכינו חיץ ליסינג pH 7.2 המכיל 1.5 מ"מ KH₂PO₄, 8 מ"מ Na₂HPO₄, 3 מ"מ KCl, 137 מ"מ NaCl ו-0.1% Tween20, 10 mM EDTA עם תערובת מעכבת פרוטאז טרייה.
   10. הומוגניזציה של המוח במאגר ליזה טרי (1 מ"ל של חיץ ליזיס עבור דגימת רקמה של 200-500 מ"ג) עם הומוגנייזר זכוכית על קרח.
   11. סוניק מתלה שנוצר עם משבש תאים קולי עד לפתרון הבהרה.
   12. צנטריפוגה הומוגנטים ב 10,000 × גרם במשך 5 דקות.
   13. לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה מכנית ערוץ יחיד (100-1000 μL) ולבדוק מיד או aliquot ולאחסן ב ≤-20 ° C.
2. הכן את החומרים הבאים: קורא microplate עם מסנן 450 ננומטר ± 10 ננומטר; צינורות מיקרוצנטריפוגה; פיפטות חד פעמיות או רב ערוציות עם דיוק גבוה וטיפים חד פעמיים; נייר סופג עבור blotting microplate; מיכל לתמיסת שטיפה; 0.01 mol/L (או 1x) פוספט מלח חוצץ (PBS); ומים שעברו דה-יוניזציה או זיקוק.
3. הכינו את הריאגנטים.
   1. יש להביא את רכיבי הערכה והדגימות לטמפרטורת החדר (RT; 18-25°C) לפני השימוש.
   2. הרכיבו מחדש את התקן עם 1.0 מ"ל של מדלל סטנדרטי, שמרו למשך 10 דקות ב-RT ונערו בעדינות (לא להקציף). פתרון המלאי הסטנדרטי הוא 300 pg/mL. הכינו 5 צינורות המכילים נפח של 0.6 מ"ל של מדלל סטנדרטי ובצעו סדרת דילול משולש.
   3. הגדר 5 נקודות (300 pg/mL, 100 pg/mL, 33.33 pg/mL, 11.11 pg/mL ו-3.70 pg/mL) של התקן המדולל, ואת הצינורות האחרונים עם ריק המכיל רק את המדלל הסטנדרטי (0 pg/mL).
   4. סובב במהירות את פתרונות המלאי של מגיב זיהוי A ומגיב זיהוי B לפני השימוש. לדלל אותם 100 פעמים עם Assay מדלל A ו- B כדי להכין את ריכוז העבודה.
   5. לדלל 20 מ"ל של תמיסת השטיפה המרוכזת (30x) עם 580 מ"ל של מים נטולי יונים, או מזוקקים, כדי ליצור 600 מ"ל של תמיסת כביסה (1x).
   6. שאפו את המינון הדרוש של התמיסה עם טיפים מעוקרים, ואל תזרקו שוב את התמיסה השיורית לבקבוקון.
4. בצע את הבדיקה.
   1. קבע בארות עבור תקן מדולל, ריק ודגימה.
   2. הכינו 5 בארות לנקודות סטנדרטיות ובאר אחת לריק.
      1. הוסף 50 μL כל אחד של דילולים סטנדרטיים, ריקים ומדגם לתוך הבארות המתאימות, בהתאמה. לאחר מכן, הוסף 50 μL של מגיב זיהוי A לכל באר מיד.
      2. נערו את הצלחת בעדינות (מומלץ שייקר מיקרו-צלחות) וכסו אותה באטם צלחת. לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך 1 שעה. מגיב זיהוי A עשוי להיראות מעונן. מחממים את התמיסה ל-RT ומערבבים בעדינות עד לקבלת מרקם אחיד.
   3. שאפו את התמיסה ושטפו היטב כל באר עם 350 מיקרוליטר של תמיסת כביסה 1x בעזרת בקבוק להשפריץ, פיפטה רב ערוצית, מתקן סעפת או מכונת כביסה אוטומטית. השאירו את הצלחת ללא הפרעה למשך 1-2 דקות. הצמד את הצלחת על נייר סופג כדי להסיר לחלוטין את הנוזל שנותר מכל הבארות. חזור על הליך זה 3 פעמים.
   4. לאחר השטיפה האחרונה, יש לשאוף או לרוקן כל חיץ כביסה שנותר. הקפידו על הסרה מלאה של תמיסת הכביסה על ידי היפוך הצלחת והדבקתה כנגד נייר סופג.
   5. הוסף 100 μL של פתרון עבודה מגיב B לגילוי לכל באר ודגר על הצלחת במשך 30 דקות ב 37 ° C לאחר כיסוי אותו עם אוטם הצלחת.
   6. חזרו על שלבי השאיפה/כביסה במשך 5 דקות בסך הכל.
   7. הוסיפו 90 מיקרוליטר של תמיסת מצע לכל באר וכסו את הצלחת באטם פלטות חדש. יש לדגור במשך 10-20 דקות בטמפרטורה של 37°C (אין לחרוג מ-30 דקות) המוגנת מפני אור. לאחר הוספת תמיסת המצע, הנוזל יהפוך כחול.
   8. הוסף 50 μL של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה. הוספת תמיסת העצירה תהפוך את הנוזל לצהוב. הקש על הצלחת על צדה כדי לערבב את הנוזל. אם שינוי הצבע אינו עקבי, טפחו בעדינות על הצלחת כדי להבטיח ערבוב יסודי.
   9. יש להקפיד על הסרה מלאה של מים וטביעות אצבע בתחתית הצלחת וללא היווצרות בועות על פני השטח הנוזליים. לאחר מכן, קרא את הצלחת בקורא microplate ב 450 ננומטר מיד.
5. חשב את התוצאות.
   1. קבע את הממוצע של הקריאות הכפולות עבור כל תקן, פקד ודגימה. התווה עקומה סטנדרטית עם לוג של ריכוז Aβ 1-42 על ציר y וספיגה על ציר x.
   2. צייר עקומה המתאימה ביותר דרך הנקודות, אשר ניתן לקבוע על ידי ניתוח רגרסיה.
   3. אם נעשה שימוש בדגימות מדוללות, הכפילו את הריכוז המתקבל מהעקומה הסטנדרטית בגורם הדילול.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש בערכה לקביעת Aβ 1-42.

תוצאות

בשלב הראשון, המחקר התמקד בביסוס מינון האור היעיל (נורית LED של 1050 ננומטר) לגירוי הסרה לימפטית של Aβ פלואורסצנטי מהמוח ל-dcLN בעכברים בוגרים ערים (בני 2-3 חודשים, 26-29 גרם) זכרים מסוג BALB/c. המינונים הקלים נבחרו באופן אקראי כ-10 J/cm², 20 J/cm² ו-30 J/cm² בהתבסס על מחקרים קודמים שלנו על השפ?...

Discussion

MLV הם יעד חשוב לפיתוח טכנולוגיות חדשניות לוויסות ניקוז המוח וסילוק פסולת תאית ופסולת מהמוח, במיוחד בקרב נבדקים מבוגרים שתפקוד MLV שלהם יורד ^1,22. במצב הומיאוסטטי, שינה עמוקה קשורה להפעלה טבעית של ניקוי רקמת המוח^13,14. לכן, ברור לצפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Tween20	Helicon,  Russia	SB-G2009-100ML
Catheter	Scientific Commodities Inc., USA	PE-10, 0.28 mm ID × 0.61 mm OD
CO2 chamber	Binder, Germany	CB-S 170
Confocal microscop	Nikon, Japan	A1R MP
Dental acrylic	Zermack, Poland-Russia	Villacryl S, V130V4Z05
Drill	Foredom, Russia	SR W-0016
Dumont forceps	Stoelting, USA	52100-07
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Switzerland	29 G needle
Ibuprofen	Sintez OJSC, Russia	N/A	Analgesic drug
Insulin needle	INSUPEN, Italy	31 G, 0.25 mm x 6 mm
Levomekol antibacterial ointment	Nizhpharm	D06C	For external use at a dose of 40 mg/g, 1 time per day
Micro forceps	Stoelting, USA	52102-02P
Microcentrifuge	Gyrozen, South Korea	GZ-1312
Microinjector	Stoelting, USA	53311
Non-sharp tweezer	Stoelting, USA	52108-83P
PINNACLE system	Pinnacle Technology, USA	8400-K3-SL	System for recording EEG (2 channels) and EMG (1 channel) of mice
Shaving machine	Braun	Series 3310s
Single and multi-channel pipettes	Eppendorf, Austria	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Sodium chloride	Kraspharma, Russia	N/A
Soldering station	AOYUE, China	N/A
Stereotaxic frame	Stoelting, USA	51500
Straight dissecting scissors	Stoelting, USA	52132-10P
Tetracycline	JSC Tatkhimfarmpreparaty, Russia	N/A	Eye ointment
Tweezer	Stoelting, USA	52100-03
Ultrasonic cell disrupter	Biobase, China	USD-500
Wound retractor	Stoelting, USA	52125
Xylanit	Nita-Farm, Russia	N/A	Muscle relaxant
Zoletil 100	Virbac Sante Animale, France	N/A	General anesthesia