Photobiomodulation unter elektroenzephalographischen Kontrollen des Schlafes zur Stimulation der lymphatischen Entfernung von Toxinen aus dem Gehirn der Maus

Zusammenfassung

Diese Studie stellt die nicht-invasive und tragbare Technologie der transkraniellen Photobiomodulation unter elektroenzephalographischer Kontrolle zur Stimulation der lymphatischen Entfernung von Toxinen (z.B. lösliches Amyloid beta) aus dem Gehirn von gealterten und nicht anästhesierten BALB/c-Männchen während des natürlichen Tiefschlafs vor.

Zusammenfassung

Die meningealen Lymphgefäße (MLVs) spielen eine wichtige Rolle bei der Entfernung von Giftstoffen aus dem Gehirn. Die Entwicklung innovativer Technologien zur Stimulation der MLV-Funktionen ist eine vielversprechende Richtung in der Behandlung verschiedener Hirnerkrankungen, die mit MLV-Anomalien verbunden sind, einschließlich Alzheimer- und Parkinson-Krankheiten, Hirntumoren, traumatischen Hirnverletzungen und intrakraniellen Blutungen. Schlaf ist ein natürlicher Zustand, in dem die Drainageprozesse des Gehirns am aktivsten sind. Daher kann die Stimulation der Gehirndrainage und der MLVs während des Schlafs die ausgeprägtesten therapeutischen Effekte haben. Solche kommerziellen Technologien gibt es derzeit jedoch nicht.

In dieser Studie wird eine neue tragbare Technologie der transkraniellen Photobiomodulation (tPBM) unter elektroenzephalographischer (EEG) Kontrolle des Schlafes vorgestellt, die entwickelt wurde, um die Ausscheidung von Toxinen (z. B. lösliches Amyloid beta (Aβ)) aus dem Gehirn gealterter BALB/c-Mäuse zu stimulieren und die therapeutische Wirksamkeit verschiedener optischer Ressourcen zu vergleichen. Die Technologie kann unter dem natürlichen Zustand eines Heimkäfigs ohne Anästhesie verwendet werden, um die motorische Aktivität von Mäusen zu erhalten. Diese Daten eröffnen neue Perspektiven für die Entwicklung nicht-invasiver und klinisch vielversprechender Phototechnologien zur Korrektur altersbedingter Veränderungen der MLV-Funktionen und der Drainageprozesse des Gehirns sowie zur effektiven Reinigung des Hirngewebes von Metaboliten und Toxinen. Diese Technologie ist sowohl für präklinische Studien zu den Funktionen des schlafenden Gehirns als auch für die Entwicklung klinisch relevanter Therapien für schlafbezogene Hirnerkrankungen gedacht.

Einleitung

Meningeale Lymphgefäße (MLVs) spielen eine wichtige Rolle bei der Entfernung von Toxinen und Metaboliten aus dem Hirngewebe ^1,2,3. Die Schädigung von MLVs bei verschiedenen Hirnerkrankungen, einschließlich Tumoren, traumatischen Hirnverletzungen, Blutungen und neurodegenerativen Prozessen, geht mit einer Abnahme der MLV-Funktionen einher, die zum Fortschreiten dieser Pathologien führt 1,2,3,4,5,6 . Daher eröffnet die Entwicklung von Methoden zur Stimulation von MLVs neue Horizonte bei der Entstehung wirksamer Technologien zur Behandlung von Hirnerkrankungen. Kürzlich wurde eine nicht-invasive Technologie für eine effektive transkranielle Photobiomodulation (tPBM) vorgeschlagen, um MLVs zu stimulieren und Giftstoffe wie Blut und Aβ aus dem Gehirn zu entfernen 5,7,8,9,10,11,12. Interessant ist, dass der Tiefschlaf ein natürlicher Faktor für die Aktivierung von Lymphdrainageprozessen im Gehirn ist^13,14. Basierend auf dieser Tatsache ist es logisch anzunehmen, dass die tPBM von MLVs während des Schlafs wirksamere therapeutische Effekte haben kann als während des Wachzustands 9,11,12,15. Derzeit gibt es jedoch keine kommerziellen Technologien für tPBM während des Schlafs¹⁶. Darüber hinaus werden Tierversuche zur Untersuchung der therapeutischen Wirkung von tPBM unter Narkose durchgeführt, die erforderlich ist, um das Gehirn genau mit Licht zu versorgen. Die Narkose beeinflusst jedoch die Drainage des Gehirns erheblich, was die Qualität der Forschungsergebnisse mindert¹⁷.

Aβ ist ein Stoffwechselprodukt normaler neuronaler Aktivität¹⁸. Wie es in kultivierten kortikalen Neuronen von Ratten festgestellt wurde, wird Aβ von ihnen mit hohen Raten in den extrazellulären Raum freigesetzt (2-4 Moleküle/Neuron/s für Aβ)¹⁹. Es gibt Hinweise darauf, dass die gelöste Form von Aβ, die sich im extrazellulären und perivaskulären Raum befindet, für Neuronen und Synapsen am toxischsten ist²⁰. Das lösliche Aβ wird innerhalb von 1-2,5 h²¹ schnell aus dem menschlichen Gehirn ausgeschieden. MLVs sind die Tunnel zur Entfernung des löslichen Aβ aus dem Gehirn ^1,7, das mit zunehmendem Alter abnimmt und zur Akkumulation von Aβ im gealterten Gehirn führt ^1,22. Es gibt Hinweise darauf, dass extrazelluläre Anomalien des Aβ-Spiegels im Gehirn mit der kognitiven Leistungsfähigkeit im Alter korrelieren und mit der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit (AD) assoziiert ^sind23,24. Daher gelten gealterte und alte Nagetiere als Alternativen zu transgenen Modellen für die Untersuchung der Amyloidose, einschließlich AD^25,26.

In dieser Studie wird eine originelle und tragbare tPBM-Technologie unter elektroenzephalographischer (EEG) Kontrolle des tiefen oder nicht-schnellen Augenbewegungsschlafs (NREM) bei nicht anästhesierten männlichen BALB/c-Mäusen unterschiedlichen Alters vorgestellt, um die lymphatische Clearance von Aβ aus dem Gehirn in das periphere Lymphsystem (die tiefen zervikalen Lymphknoten, dcLNs) zu stimulieren.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren", der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere und den Richtlinien des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation (Nr. 742 vom 13.11.1984) durchgeführt, die von der Bioethikkommission der Staatlichen Universität Saratow genehmigt wurden (Protokoll Nr. 7, 22.09.2022).

1. Montage der Hardware

1. Schneiden Sie ein Stück Folientextolith mit einer Dicke von 1,5 mm x 2 mm zu. Dieses Teil wird als Leuchtdiode (LED) bezeichnet: Leiterplatte (PCB) (Abbildung 1C).
2. Löten Sie eine LED an eine Leiterplatte, wie in Abbildung 1 gezeigt.
3. Löten Sie zwei Kupferlitzen an die Pins einer LED und decken Sie diese dann mit einer Hülse ab.
4. Drucken Sie das 3D-Modell des Rahmens aus (Abbildung 1A); Platzieren Sie eine LED (Abbildung 1B) und Magnete (Abbildung 1D) auf dem Rahmen. Platzieren Sie eine Unterlegscheibe (Abbildung 1E) auf dem Kopf der Maus.
5. Gehen Sie folgendermaßen vor, um die Schaltung zu montieren (Abbildung 2).
   1. Schließen Sie zunächst den Widerstand an (Abbildung 2; R1) zwischen einer LED-Anode und einem 5-V-Anschluss am Arduino.
   2. Schließen Sie als Nächstes eine LED-Kathode an den Metalloxid-Halbleiter-Feldeffekttransistor (MOSFET) an (Abbildung 2; Q1) abtropfen lassen. Verbinden Sie dann die MOSFET-Quelle mit der Masse.
   3. Schließen Sie den Pulldown-Widerstand an (Abbildung 2; R2) zwischen dem MOSFET-Gate und der Masse. Verbinden Sie abschließend das MOSFET-Gate mit Pin 3 am Arduino.
6. Schließen Sie eine LCD-Tastatur (Liquid Crystal Display) an den Arduino an.
7. Drucken Sie die 3D-Modelle des Gehäuses, der Abdeckplatte und der Tasten aus. Setzen Sie die Arduino-Platine mit LCD-Tastaturabschirmung, MOSFET und LED-Anschluss in das Gehäuse ein, wie in Abbildung 3 gezeigt.

2. Software-Handbuch (Abbildung 4)

1. Laden Sie den Arduino-Sketch (.ino-Datei) herunter und öffnen Sie ihn über die integrierte Entwicklungsumgebung (IDE) von Arduino (Supplementary Coding File 1).
2. Wählen Sie den richtigen Kommunikationsport (COM) aus und flashen Sie die Firmware.
3. Die Benutzeroberfläche besteht aus zwei Spalten. Verwenden Sie die Schaltflächen Links und Rechts , um zwischen diesen Spalten zu navigieren. Der Selektionsindikator befindet sich links neben der Spalte.
4. Die linke Spalte auf dem Bildschirm ist das Auswahlfeld für das Tastverhältnis der Pulsweitenmodulation (PWM). Verwenden Sie die Tasten Nach oben und Nach unten , um das Arbeitsverhältnis einzustellen. Erreichen Sie die PBM-Dosis von 10/20/30 Dj/cm² mit einem entsprechenden PWM-Tastverhältnis von 2 %/4 %/6 % in einer 17-minütigen Sitzung.
5. Die rechte Spalte auf dem Bildschirm ist das Feld RUN/Off. Um diese Spalte auszuwählen, drücken Sie die rechte Taste auf der Tastatur und dann Auswählen. Wenn der Prozess ausgeführt wird, blinkt die Aktivitätsanzeige, und der Text auf der RUN-Taste ändert sich in OFF.
   ANMERKUNG. Die Mäuse werden über einen Zeitraum von 10 Tagen auf die Experimente vorbereitet, einschließlich der Implantation von EEG-Elektroden, der Implantation eines chronischen Katheters in den rechten Seitenventrikel zur Injektion von fluoreszierendem Aβ und der Platzierung einer Platte für PBM.

3. Implantation eines EEG-Aufzeichnungssystems (Abbildung 5)

1. Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus Zoletil 100 und Xylanit (100 mg/kg bzw. 10 mg/kg) durch intramuskuläre Injektion in den Oberschenkel.
2. Wenn die Rückzugsreflexe des hinteren Fußes und die Einklemmreaktion des Schwanzes aufhören, platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen über einem Heizkissen (Abbildung 5A).
3. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augenlider auf, um ein Austrocknen der Augäpfel während der Operation zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf.
4. Rasieren Sie den Kopf im Bereich von den Nasenknochen bis zum Hinterhauptbein mit einer Rasiermaschine und sterilisieren Sie die exponierte Haut zuerst mit Alkohol.
5. Schneiden Sie mit einer geraden Präparierschere die Kopfhaut ab, halten Sie sie mit einer Mikrozange fest, reinigen Sie den Schädel von Faszien und trocknen Sie ihn mit Wattestäbchen. Verwenden Sie bei Bedarf die Blutstillungsmittel.
6. Mit einem Bohrer mit einem Durchmesser von 1,3 mm bohren Sie auf jeder Seite entlang der Koordinaten 2 Löcher in die Schläfenknochen: AP = -1 mm für das erste Schraubenpaar und AP = -3 mm für das zweite Schraubenpaar.
7. Legen Sie die EEG-Schrauben mit den Drahtleitungen für 5 min in Alkohol. Setzen Sie anschließend die EEG-Schrauben in die Kochsalzlösung ein.
8. Setzen Sie vier versilberte Schrauben mit Elektroden bis zu einer Tiefe von 1 mm in die Löcher ein (Abbildung 5B).
9. Befestigen Sie die Schrauben mit Zahnacryl an der Oberfläche des Schädels, so dass die von ihnen ausgehenden Elektroden zur Nase des Tieres hin angeordnet sind (Abbildung 5C). Lassen Sie das Dentalacrylat 15 Minuten aushärten.
10. Befestigen Sie einen EEG-Aufzeichnungssensor mit Zahnacryl an der Nase des Tieres. Lassen Sie das Dentalkunststoff 30 Minuten lang aushärten (Abbildung 5D).
11. Platzieren Sie die EMG-Elektroden mit einer gebogenen Pinzette auf der Rückseite des Musculus orbicularis oculi und fixieren Sie sie mit dem Zahnacryl. Lassen Sie das Dentalkunststoff 15 Minuten lang aushärten (Abbildung 5E).
12. Schließen Sie die EEG-Elektroden an die versilberte Aussparung des Sensors an und löten Sie sie mit einer Lötstation ein. Befestigen Sie anschließend die EEG-Elektroden mit dem Dentalkunststoff (Abbildung 5F).
13. Legen Sie die Maus nach der Operation auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur zu halten, bis sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat.
14. Setzen Sie die Maus anschließend 10 Tage lang in einen individuellen Heimkäfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser mit Ibuprofen (40 mg/kg in 200 ml Wasser) zur Analgesie.

4. Implantation einer Platte für PBM

1. Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus Zoletil 100 und Xylanit (100 mg/kg; jeweils 10 mg/kg) durch intramuskuläre Injektion in den Oberschenkel 7 Tage nach der Implantation des EEG-Aufzeichnungssystems.
2. Wenn die Rückzugsreflexe des hinteren Fußes und die Einklemmreaktion des Schwanzes aufhören, fixieren Sie die Maus in einem stereotaktischen System.
3. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augenlider auf, um ein Austrocknen der Augäpfel während der Operation zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf.
4. Befestigen Sie eine Metallplatte mit einem Durchmesser von 5 mm mit Zahnacryl und Dumont-Pinzette auf dem Hinterhauptbein des Schädels. Lassen Sie das Dentalacrylat 15 Minuten lang aushärten (Abbildung 6).

5. Vorbereitung eines chronischen Katheters

1. Markieren Sie auf der Insulinnadel ein Segment 2 cm von der Seite des abgeschrägten Endes entfernt.
2. Befestigen Sie die Insulinnadel im Nadelhalter von der Seite der abgeschrägten Spitze bis zum markierten Segment.
3. Legen Sie einen 2 cm-PE-10 Polyethylen-Katheter über die gesamte verbleibende Länge der Nadel.
4. Füllen Sie den Katheter mit einer Kochsalzlösung und decken Sie ihn mit einer Plastikkappe ab, um ihn zu verschließen.

6. Implantation eines chronischen Katheters in den rechten Seitenventrikel

1. Nach der Implantation der Platte für PBM wird mit einem Bohrer ein Trepanationsloch bei den Koordinaten AP = -0,5 mm und ML = 1,2 mm mit einem Durchmesser von 1,5 mm gebohrt.
2. Legen Sie den PE-10 Polyethylen-Katheter in eine stereotaktische Halterung und führen Sie ihn in den Schädel der Maus ein (DV = 2 mm). Fixieren Sie es anschließend mit dem Dentalacryl. Lassen Sie das Dentalacrylat 15 Minuten lang aushärten (Abbildung 7).
3. Legen Sie die Maus nach der Operation auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur zu halten, bis sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat.
4. Setzen Sie die Maus anschließend 10 Tage lang in einen individuellen Heimkäfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser mit Ibuprofen (40 mg/kg in 200 ml Wasser) zur Analgesie.

7. tPBM unter EEG-Kontrolle des NREM-Schlafs

1. Schließen Sie ein beliebiges handelsübliches EEG-Aufzeichnungssystem an den Anschluss am Kopf der Maus an und stellen Sie den Anforderungswert für das PWM-Tastverhältnis ein.
2. Überwachen Sie das EEG-Signal und warten Sie auf die Aktivität des Delta-Rhythmus. Wenn der NREM-Schlaf zu sehen ist, starten Sie den PBM-Prozess und stoppen Sie den Prozess, wenn der NREM-Schlaf in den REM-Schlaf (Rapid Eye Movement) oder Wachzustand übergeht. Die Dosis erhöht sich mit jeder Wechselwirkung, bis sie den erforderlichen Wert erreicht.
3. Wenn die erforderliche PBM-Dosis erreicht ist, ist die Sitzung beendet.

8. Konfokale Bildgebung der lymphatischen Entfernung von Aβ aus dem Gehirn der Maus

1. Verbinden Sie einen 10 cm Katheter mit einer Insulinnadel.
2. Bereiten Sie mit einer Hamilton-Spritze mit einer 29-G-Nadel eine Infusion von fluoreszierendem Beta-Amyloid (FAβ) in einem Volumen von 5 μl in den Katheter vor. Lassen Sie den Katheter auf einer Hamilton-Spritze.
3. Fixieren Sie die Hand der Maus und verbinden Sie den Katheter über eine Nadel mit dem implantierten chronischen Katheter.
4. Verbinden Sie den Katheter mit einem Mikroinjektor. Platzieren Sie anschließend die Maus in einer einzelnen Box.
5. Wählen Sie im Mikroinjektor-Menü die Injektionsrate 0,1 μl/min aus und drücken Sie die Start-Taste.
6. Injektion von FAβ in den rechten Seitenventrikel vornehmen.
7. Nach der FAβ-Verabreichung wird PBM mit einer LED für 61 Minuten nach dem Algorithmus durchgeführt: 17 min - Licht und 5 min - Pause über 61 min.
8. Nach der PBM injizieren Sie intravenös einen beliebigen Tracer zur Markierung der Hirngefäße über den Schwanz.
9. Nach der Injektion werden die Mäuse mit der CO₂ -Euthanasiekammer eingeschläfert.
10. Machen Sie mit einer scharfen, geraden Schere einen kleinen Querschnitt in die Haut entlang der Luftröhre und halten Sie die Haut mit einer geraden, nicht scharfen Pinzette fest.
11. Machen Sie mit einer geraden Schere einen Längsschnitt über die gesamte Länge des Halses.
12. Nehmen Sie mit einer gebogenen Pinzette die Speicheldrüsen auf und trennen Sie sie vorsichtig vom Bindegewebe. Legen Sie einen Wundretraktor auf den offenen Abschnitt des Schnitts und fixieren Sie ihn so, dass das umgebende Gewebe zurückgedrückt wird.
13. Untersuchen Sie den Bereich zwischen der Luftröhre und dem M. cleidomastoideus mit zwei gebogenen Pinzetten von beiden Seiten des Halses.
14. Wenn der tiefe zervikale Lymphknoten (dcLN) auf jeder Seite erkannt wird, entfernen Sie die dcLNs mit einer geraden Pinzette mit stumpfen Enden und schneiden Sie sie aus dem Bindegewebe ab.
15. Legen Sie die dcLNs in eine Petrischale mit einer Kochsalzlösung und decken Sie sie mit horizontal ausgerichtetem Deckglas (25 mm × 50 mm × 0,17 mm) ab.
16. Verwenden Sie ein beliebiges handelsübliches konfokales Mikroskop, um Bilder von ganzen dcLNs zu erhalten.

9. Analyse von Aβ in den Lysaten des Hirngewebes

1. Bereiten Sie die Proben für den Assay vor.
   1. Euthanasieren Sie Mäuse mit der CO₂ -Euthanasiekammer.
   2. Enthaupte die Maus, entferne die Haut von ihrem Kopf und entferne die Muskeln vom Schädel.
   3. Machen Sie mit einer scharfen, geraden Schere zwei Schnitte vom großen Hinterhauptsforamen bis zum Gehörgang.
   4. Trennen Sie mit einer geraden Pinzette den ventralen Teil des Schädels, das Hinterhauptbein und die Knochen, die die Mittelohrhöhlen bilden.
   5. Trennen Sie mit einer Pinzette das Gehirn von den Scheitel- und Stirnknochen.
   6. Entfernen Sie mit einer geraden Schere den Oberkiefer und schneiden Sie die Riechkolben ab.
   7. Lege das Gehirn in die physiologische Lösung.
   8. Spülen Sie das Gehirn mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um überschüssiges Blut gründlich zu entfernen, und wiegen Sie es vor der Homogenisierung.
   9. Bereiten Sie einen Lysingpuffer pH 7,2 mit 1,5 mm KH₂PO₄, 8 mm Na₂HPO₄, 3 mm KCl, 137 mm NaCl und 0,1 % Tween20, 10 mM EDTA mit einer frisch zubereiteten Protease-Hemmmischung vor.
   10. Homogenisieren Sie das Gehirn in frischem Lysepuffer (1 ml Lysepuffer für 200-500 mg Gewebeprobe) mit einem Glashomogenisator auf Eis.
   11. Beschallen Sie eine resultierende Suspension mit einem Ultraschall-Zelldisruptor, bis die Lösung geklärt ist.
   12. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 10.000 × g für 5 min.
   13. Der Überstand wird mit einer mechanischen Einkanalpipette (100-1000 μl) entnommen und sofort untersucht oder aliquotiert und bei ≤-20 °C gelagert.
2. Bereiten Sie die folgenden Materialien vor: Mikroplatten-Reader mit 450 nm ± 10 nm Filter; Mikrozentrifugenröhrchen; Ein- oder Mehrkanalpipetten mit hoher Präzision und Einwegspitzen; saugfähiges Papier zum Abtupfen der Mikrotiterplatte; Behälter für Waschlösung; 0,01 mol/l (oder 1x) phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS); und deionisiertes oder destilliertes Wasser.
3. Bereiten Sie die Reagenzien vor.
   1. Bringen Sie die Bestandteile des Kits und die Proben vor der Verwendung auf Raumtemperatur (RT; 18-25 °C).
   2. Rekonstituieren Sie den Standard mit den 1,0 mL Standardverdünnungsmittel, halten Sie ihn 10 Minuten lang bei RT und schütteln Sie ihn vorsichtig (nicht zum Schäumen). Die Standard-Stammlösung ist 300 pg/ml. Bereiten Sie 5 Röhrchen mit einem Volumen von 0,6 ml Standardverdünnungsmittel vor und erstellen Sie eine dreifache Verdünnungsreihe.
   3. Setzen Sie 5 Punkte (300 pg/ml, 100 pg/ml, 33,33 pg/ml, 11,11 pg/ml und 3,70 pg/ml) des verdünnten Standards und die letzten Röhrchen mit dem Blindwert ein, der nur das Standardverdünnungsmittel (0 pg/ml) enthält.
   4. Drehen Sie die Stammlösungen von Nachweisreagenz A und Nachweisreagenz B vor der Verwendung schnell herunter. Verdünnen Sie sie 100-fach mit dem Assay-Verdünnungsmittel A und B, um die Arbeitskonzentration herzustellen.
   5. Verdünnen Sie 20 mL der konzentrierten Waschlösung (30x) mit 580 mL entionisiertem oder destilliertem Wasser, um 600 mL Waschlösung (1x) herzustellen.
   6. Aspirieren Sie die erforderliche Dosierung der Lösung mit sterilisierten Spitzen und schütten Sie die restliche Lösung nicht erneut in das Fläschchen.
4. Führen Sie den Assay durch.
   1. Bestimmen Sie die Vertiefungen für einen verdünnten Standard, einen Blindwert und eine Probe.
   2. Bereiten Sie 5 Vertiefungen für Standardspitzen und eine Vertiefung für Blindspitzen vor.
      1. Geben Sie jeweils 50 μl Standard-, Blind- und Probenverdünnungen in die entsprechenden Vertiefungen. Geben Sie dann sofort 50 μl Nachweisreagenz A in jede Vertiefung.
      2. Schütteln Sie die Platte vorsichtig (ein Mikroplattenschüttler wird empfohlen) und decken Sie sie mit einem Plattenversiegeler ab. Die Platte 1 h lang bei 37 °C inkubieren. Nachweisreagenz A kann trüb erscheinen. Erwärmen Sie die Lösung auf RT und mischen Sie sie vorsichtig, bis sie gleichmäßig erscheint.
   3. Aspirieren Sie die Lösung und waschen Sie jede Vertiefung mit 350 μl 1x Waschlösung mit Hilfe einer Spritzflasche, einer Mehrkanalpipette, eines Verteilerspenders oder einer automatischen Waschmaschine. Den Teller 1-2 Min. ungestört stehen lassen. Lassen Sie die Platte auf saugfähigem Papier einrasten, um die restliche Flüssigkeit vollständig aus allen Vertiefungen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 Mal.
   4. Nach der letzten Wäsche den restlichen Waschpuffer aspirieren oder dekantieren. Stellen Sie sicher, dass die Waschlösung vollständig entfernt wird, indem Sie die Platte umdrehen und gegen saugfähiges Papier tupfen.
   5. Geben Sie 100 μl Arbeitslösung aus Nachweisreagenz B in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 °C, nachdem Sie sie mit dem Plattenversiegeler abgedeckt haben.
   6. Wiederholen Sie die Aspirations-/Waschschritte für insgesamt 5 Minuten.
   7. Geben Sie 90 μl Substratlösung in jede Vertiefung und bedecken Sie die Platte mit einem neuen Plattenversiegeler. 10-20 min bei 37 °C (nicht länger als 30 min) lichtgeschützt inkubieren. Nach der Zugabe der Substratlösung färbt sich die Flüssigkeit blau.
   8. Geben Sie 50 μl einer Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu beenden. Durch die Zugabe der Stopplösung wird die Flüssigkeit gelb. Klopfen Sie auf die Seite, um die Flüssigkeit zu mischen. Wenn die Farbänderung ungleichmäßig ist, klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten.
   9. Stellen Sie sicher, dass Wasser und Fingerabdrücke auf der Unterseite der Platte vollständig entfernt werden und keine Blasenbildung auf der Flüssigkeitsoberfläche entsteht. Lesen Sie dann die Platte sofort in einem Mikroplatten-Reader bei 450 nm ab.
5. Berechnen Sie die Ergebnisse.
   1. Ermitteln Sie den Durchschnitt der doppelten Messwerte für jeden Standard, jede Kontrolle und jede Stichprobe. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit dem logarithmischen Bestand der Konzentration von Aβ 1-42 auf der y-Achse und der Absorption auf der x-Achse.
   2. Zeichnen Sie eine Kurve mit der besten Anpassung durch die Punkte, die durch Regressionsanalyse bestimmt werden kann.
   3. Wenn verdünnte Proben verwendet wurden, multiplizieren Sie die aus der Standardkurve erhaltene Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor.
      HINWEIS: Für ELISA wurde in dieser Studie ein Kit zur Bestimmung von Aβ 1-42 verwendet.

Ergebnisse

Im ersten Schritt konzentrierte sich die Studie auf die Etablierung der effektiven Lichtdosis (eine 1050 nm LED) zur Stimulation der lymphatischen Entfernung von fluoreszierendem Aβ aus dem Gehirn an dcLNs bei wachen erwachsenen (2-3 Monate alten, 26-29 g) männlichen BALB/c-Mäusen. Die Lichtdosen wurden zufällig als 10 J/cm², 20 J/cm² und 30 J/cm² ausgewählt^, basierend auf unseren früheren Studien zu tPBM-Effekten auf die Entfernung verschiedener Farbstoffe und der roten ...

Diskussion

MLVs sind ein wichtiges Ziel für die Entwicklung innovativer Technologien zur Modulation der Drainage des Gehirns und zur Entfernung von Zelltrümmern und Abfallstoffen aus dem Gehirn, insbesondere bei älteren Probanden, deren MLV-Funktion abnimmt ^1,22. In einem homöostatischen Zustand ist der Tiefschlaf mit der natürlichen Aktivierung der Reinigung des Gehirngewebes verbunden^13,14. Daher ist zu erwar...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Tween20	Helicon,  Russia	SB-G2009-100ML
Catheter	Scientific Commodities Inc., USA	PE-10, 0.28 mm ID × 0.61 mm OD
CO2 chamber	Binder, Germany	CB-S 170
Confocal microscop	Nikon, Japan	A1R MP
Dental acrylic	Zermack, Poland-Russia	Villacryl S, V130V4Z05
Drill	Foredom, Russia	SR W-0016
Dumont forceps	Stoelting, USA	52100-07
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Switzerland	29 G needle
Ibuprofen	Sintez OJSC, Russia	N/A	Analgesic drug
Insulin needle	INSUPEN, Italy	31 G, 0.25 mm x 6 mm
Levomekol antibacterial ointment	Nizhpharm	D06C	For external use at a dose of 40 mg/g, 1 time per day
Micro forceps	Stoelting, USA	52102-02P
Microcentrifuge	Gyrozen, South Korea	GZ-1312
Microinjector	Stoelting, USA	53311
Non-sharp tweezer	Stoelting, USA	52108-83P
PINNACLE system	Pinnacle Technology, USA	8400-K3-SL	System for recording EEG (2 channels) and EMG (1 channel) of mice
Shaving machine	Braun	Series 3310s
Single and multi-channel pipettes	Eppendorf, Austria	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Sodium chloride	Kraspharma, Russia	N/A
Soldering station	AOYUE, China	N/A
Stereotaxic frame	Stoelting, USA	51500
Straight dissecting scissors	Stoelting, USA	52132-10P
Tetracycline	JSC Tatkhimfarmpreparaty, Russia	N/A	Eye ointment
Tweezer	Stoelting, USA	52100-03
Ultrasonic cell disrupter	Biobase, China	USD-500
Wound retractor	Stoelting, USA	52125
Xylanit	Nita-Farm, Russia	N/A	Muscle relaxant
Zoletil 100	Virbac Sante Animale, France	N/A	General anesthesia