マウス脳からの毒素のリンパ管除去の刺激のための睡眠の脳波制御下での光生体調節

要約

この研究は、自然な深い睡眠中に老化した麻酔を受けていないBALB/c雄マウスの脳からの毒素(例えば、可溶性アミロイドベータ)の刺激リンパ除去のための脳波制御下での経頭蓋光生体調節の非侵襲的でポータブルな技術を示しています。

要約

髄膜リンパ管(MLV)は、脳からの毒素の除去に重要な役割を果たします。MLV機能を刺激する革新的な技術の開発は、アルツハイマー病やパーキンソン病、脳腫瘍、外傷性脳損傷、頭蓋内出血など、MLV異常に関連するさまざまな脳疾患の治療の進行において有望な方向です。睡眠は、脳のドレナージプロセスが最も活発な自然な状態です。したがって、睡眠中の脳のドレナージとMLVの刺激は、最も顕著な治療効果をもたらす可能性があります。しかし、そのような商用技術は現状では存在しません。

この研究は、老化したBALB/cマウスの脳からの毒素(可溶性アミロイドベータ(Aβ)など)の除去を光刺激するように設計された睡眠の脳波(EEG)制御下での経頭蓋光生体調節(tPBM)の新しいポータブル技術を提示します。この技術は、麻酔なしで家庭用ケージの自然な状態で使用でき、マウスの運動活動を維持します。これらのデータは、MLV機能と脳のドレナージプロセスの加齢に伴う変化を補正し、代謝物や毒素から脳組織を効果的に浄化するための、非侵襲的で臨床的に有望な光技術の開発に新たな展望を開きます。この技術は、睡眠中の脳の機能に関する前臨床研究と、睡眠関連脳疾患の臨床的に適切な治療法の開発の両方を目的としています。

概要

髄膜リンパ管(MLV)は、脳組織からの毒素および代謝産物の除去に重要な役割を果たします^1,2,3。腫瘍、外傷性脳損傷、出血、神経変性過程など、さまざまな脳疾患におけるMLVの損傷は、MLV機能の低下を伴い、これらの病状の進行につながります1,2,3,4,5,6 .したがって、MLVを刺激する方法の開発は、脳疾患の治療のための効果的な技術の出現に新たな地平を切り開きます。最近、MLVを刺激し、脳から血液やAβなどの毒素を除去するための効果的な経頭蓋光生体調節(tPBM)のための非侵襲的技術が提案されている5,7,8,9,10,11,12。深い睡眠が脳内のリンパドレナージプロセスの活性化の自然な要因であることに注意するのは興味深いことです^13,14。この事実に基づいて、睡眠中のMLVのtPBMは、覚醒時よりも効果的な治療効果を有する可能性があると仮定することは論理的である9,11,12,15。しかし、現在、睡眠中のtPBMの商用技術はありません¹⁶。また、tPBMの治療効果を調べるための動物実験は、脳に正確に光を届けるために必要な麻酔下で行われます。しかし、麻酔は脳のドレナージに大きく影響し、研究結果の質を低下させます¹⁷。

Aβは正常な神経活動の代謝産物である¹⁸。培養ラット皮質ニューロンで確立されたため、Aβはそれらから細胞外空間(Aβの場合は2-4分子/ニューロン/s)に高速度で放出されます¹⁹。細胞外および血管周囲腔に位置するAβの溶解型は、ニューロンおよびシナプスに対して最も毒性が高いという証拠がある²⁰。可溶性Aβは、1〜2.5時間の間にヒトの脳から急速に除去される²¹。MLVは、加齢とともに減少^する可溶性Aβを脳^1,7から除去するためのトンネルであり、老化した脳^1,22にAβが蓄積する。脳内のAβレベルの細胞外異常は、老化における認知能力と相関し、アルツハイマー病(AD)の発症と関連しているという証拠があります^23,24。したがって、老化したげっ歯類と古いげっ歯類は、AD^25,26 を含むアミロイドーシスの研究のためのトランスジェニック モデルの代替手段と見なされます。

この研究は、脳から末梢リンパ系(深部頸部リンパ節、dcLN)へのAβのリンパクリアランスを刺激するために、さまざまな年齢の異なる年齢の無麻酔雄BALB/cマウスの深部または非急速眼球運動(NREM)睡眠の脳波(EEG)制御下での独自の移植可能なtPBM技術を示しています。

プロトコル

すべての手続きは、「実験動物の世話と使用に関するガイド」、科学的目的で使用される動物の保護に関する指令2010/63/EU、およびサラトフ州立大学の生命倫理委員会によって承認されたロシア連邦科学高等教育省のガイドライン(1984年11月13日から第742号)に従って行われました(プロトコルNo.7、 22.09.2022).

1.ハードウェアの組み立て

1. 厚さ1.5mmのホイルtextoliteを1.5 mm x 2 mmの寸法にカットします。この部品は、発光ダイオード(LED)プリント回路基板(PCB)と呼ばれます(図1C)。
2. 図1に示すように、LEDをPCBにはんだ付けします。
3. 2本の撚り線銅線をLEDのピンにはんだ付けし、スリーブで覆います。
4. フレームの3Dモデルを印刷します(図1A)。LED(図1B)と磁石(図1D)をフレームに配置します。ワッシャー(図1E)をマウスのヘッドに取り付けます。
5. 回路(図2)を組み立てるには、次の手順に従います。
   1. まず、抵抗を接続します(図2;R1)をArduinoのLEDアノードと5Vポートの間に置きます。
   2. 次に、LEDカソードを金属酸化膜半導体電界効果トランジスタ(MOSFET)に接続します(図2;Q1)ドレイン。次に、MOSFETソースをグランドに接続します。
   3. プルダウン抵抗を接続します(図2;R2)をMOSFETゲートとグランドの間に置きます。最後に、MOSFETゲートをArduinoのピン3に接続します。
6. 液晶ディスプレイ(LCD)キーパッドシールドをArduinoに接続します。
7. ケースの3Dモデル、カバープレート、ボタンをプリントアウトします。 図3に示すように、LCDキーパッドシールド、MOSFET、およびLEDコネクタを備えたArduinoボードをケースに挿入します。

2. ソフトウェアガイド(図4)

1. Arduinoスケッチ(.inoファイル)をダウンロードし、Arduino統合開発環境(IDE)(Supplementary Coding File 1)で開きます。
2. 正しい通信(COM)ポートを選択し、ファームウェアをフラッシュします。
3. インターフェイスには 2 つの列があります。 「左 」ボタンと 「右 」ボタンを使用して、これらの列間を移動します。選択インジケータは列の左側にあります。
4. 画面の左側の列は、パルス幅変調(PWM)デューティサイクル選択フィールドです。 上 ボタンと 下 ボタンを使用して、デューティサイクルを調整します。17分間のセッションで、対応する2%/4%/6%のPWMデューティサイクルでPBMの10/20/30 Dj / cm² 線量を達成します。
5. 画面の右側の列は [RUN/Off ] フィールドです。この列を選択するには、キーパッドの 右 ボタンを押してから 、選択を押します。プロセスの実行中は、アクティビティインジケーターが点滅し、 RUN ボタンのテキストが OFFに変わります。
   手記。マウスは、脳波電極の埋め込み、蛍光Aβの注入のための慢性カテーテルの右側脳室への埋め込み、PBM用のプレートの留置など、10日間にわたる実験のために準備されます。

3. 脳波記録システムの埋め込み(図5)

1. マウスの体重を量り、ゾレチル100とキシラナイトの混合物(それぞれ100 mg / kg、10 mg / kg)で大腿部に筋肉内注射して麻酔します。.
2. 後足の離脱反射とテールピンチ反応が止まったら、マウスを加熱パッドの上の定位固定装置フレームに置きます(図5A)。
3. 手術中の眼球の乾燥を防ぐために、まぶたに眼科用軟膏を塗布します。必要に応じてこの手順を繰り返します。
4. 鼻骨から後頭骨までの部分の頭部をシェービングマシンで剃り、露出した皮膚を先にアルコールで滅菌します。
5. まっすぐな解剖ハサミを使用して、頭皮を切り取り、マイクロ鉗子で保持し、筋膜から頭蓋骨をきれいにし、綿棒で乾かします。必要に応じて、止血剤を使用してください。
6. 直径1.3 mmのドリルを使用して、座標に沿って両側の側頭骨に2つの穴を開けます:最初のネジのペアはAP = -1 mm、2番目のネジのペアはAP = -3 mmです。
7. リード線付きのEEGネジをアルコールに5分間入れます。その後、EEGネジを生理食塩水に入れます。
8. 電極付きの銀メッキネジ4本を穴に1mmの深さまで挿入します(図5B)。
9. 歯科用アクリルを使用して頭蓋骨の表面にネジを固定し、そこから伸びる電極が動物の鼻に向かってくるようにします(図5C)。歯科用アクリルを15分間硬化させます。
10. 歯科用アクリルを使用して、脳波記録センサーを動物の鼻に取り付けます。歯科用アクリルを30分間硬化させます(図5D)。
11. EMG電極を湾曲したピンセットを使用して眼輪筋の背面に配置し、歯科用アクリルで固定します。歯科用アクリルを15分間硬化させます(図5E)。
12. EEG電極をセンサーの銀メッキのくぼみに接続し、はんだ付けステーションを使用してはんだ付けします。その後、歯科用アクリルを使用してEEG電極を固定します(図5F)。
13. 手術後、マウスを温熱パッドに置き、動物が麻酔から完全に回復するまで体温を維持します。
14. その後、手術後10日間、マウスをイブプロフェン(200mLの水に40mg / kg)を含む餌と水を自由にアクセスできる個別の家庭用ケージに入れます。

4. PBM用プレートの埋め込み

1. マウスの体重を量り、Zoletil 100 とキシラナイト (それぞれ 100 mg/kg; 10 mg/kg) の混合物で、脳波記録システムの移植後 7 日後に大腿部に筋肉内注射して麻酔します。
2. 後足の引きこもり反射と尻尾の挟み込み反応が止まったら、マウスを定位固定します。
3. 手術中の眼球の乾燥を防ぐために、まぶたに眼科用軟膏を塗布します。必要に応じてこの手順を繰り返します。
4. 直径5mmの金属板を頭蓋骨の後頭骨に歯科用アクリルとデュモン鉗子を使用して固定します。歯科用アクリルを15分間硬化させます(図6)。

5. 慢性カテーテルの作製

1. インスリン針に斜めの端の側面から2cmのセグメントに印を付けます。
2. インスリン針を斜めの先端の側面からマークされたセグメントまでニードルホルダーに固定します。.
3. 2cm-PE-10ポリエチレンカテーテルを針の残りの全長にわたって配置します。
4. カテーテルに生理食塩水を入れ、プラスチックキャップで覆って密封します。

6. 右側脳室への慢性カテーテルの埋め込み

1. PBM用プレートを埋め込んだ後、ドリルを使用して、座標AP=-0.5mmおよびML=1.2mmに直径1.5mmのトレパネーション穴を開けます。
2. PE-10ポリエチレンカテーテルを定位ホルダーに入れ、マウスの頭蓋骨(DV=2mm)に挿入します。その後、歯科用アクリルを使用して固定します。歯科用アクリルを15分間硬化させます(図7)。
3. 手術後、マウスを温熱パッドに置き、動物が麻酔から完全に回復するまで体温を維持します。
4. その後、手術後10日間、マウスをイブプロフェン(200mLの水に40mg / kg)を含む餌と水を自由にアクセスできる個別の家庭用ケージに入れます。

7. ノンレム睡眠の脳波制御下でのtPBM

1. 市販のEEG記録システムをマウスのヘッドのコネクタに接続し、PWMデューティサイクルの要件値を設定します。
2. EEG信号を監視し、デルタリズム活動を待ちます。ノンレム睡眠が見られる場合は、PBMプロセスを開始し、ノンレム睡眠が急速眼球運動(REM)睡眠または覚醒に移行する場合はプロセスを停止します。用量は、必要な値に達するまで、相互作用ごとに増加します。
3. 必要なPBM用量が得られたら、セッションは終了します。

8. マウス脳からのAβのリンパ管除去の共焦点イメージング

1. 10cmカテーテルをインスリン針に接続します。
2. 29 G針付きのハミルトンシリンジを使用して、5 μLの容量の蛍光ベータアミロイド(FAβ)をカテーテルに注入します。.カテーテルをハミルトンシリンジに残しておきます。.
3. マウスの手を固定し、カテーテルを針で埋め込み型慢性カテーテルに接続します。
4. カテーテルをマイクロインジェクターに接続します。その後、マウスを個々のボックスに入れます。
5. マイクロインジェクターメニューで0.1 μL/minの注入速度を選択し、Startボタンを押してください。
6. FAβを右側脳室に注入します。
7. FAβ投与後、アルゴリズムに従ってLEDを使用して61分間PBMを作成します:17分間-光、5分間-61分間一時停止します。
8. PBMの後、尾を介して脳血管を標識するためのトレーサーを静脈内注射します。
9. 注射後、CO₂ 安楽死チャンバーを使用してマウスを安楽死させます。
10. 鋭利でまっすぐなハサミを使用して、気管に沿って皮膚に小さな横切開を行い、まっすぐで鋭利でないピンセットで皮膚を保持します。
11. まっすぐなハサミを使用して、首の全長に沿って縦方向に切開します。
12. 湾曲したピンセットを使用して、唾液腺を取り込み、結合組織から慎重に分離します。切開部の開いた部分に創傷リトラクターを置き、周囲の組織を押し戻すように固定します。
13. 首の両側から2本の湾曲したピンセットを使用して、気管と中乳突筋の間の領域を調べます。
14. 両側に深部頸部リンパ節(dcLN)が検出されたら、先端が鈍いストレートピンセットを使用してdcLNを取り外し、結合組織から切り取ります。
15. 生理食塩水を入れたシャーレにdcLNを入れ、水平方向のカバーガラス(25mm×50mm×0.17mm)で覆います。
16. 市販の共焦点顕微鏡を使用して、dcLN全体の画像を取得します。

9. 脳組織ライセート中のAβの解析

1. アッセイ用のサンプルを調製します。
   1. CO₂ 安楽死チャンバーを使用してマウスを安楽死させます。
   2. マウスの首を切り落とし、頭から皮膚を取り除き、頭蓋骨から筋肉を取り除きます。
   3. 大後頭孔から耳道まで、鋭利でまっすぐなハサミで2つの切開を行います。
   4. ストレートピンセットを使用して、頭蓋骨の腹側部分、後頭骨、および中耳腔を形成する骨を分離します。
   5. ピンセットを使用して、頭頂骨と前頭骨から脳を分離します。
   6. まっすぐなハサミを使用して、上顎を取り除き、嗅球を切り取ります。
   7. 脳を生理学的溶液に入れます。
   8. リン酸緩衝生理食塩水で脳をすすぎ、余分な血液を完全に取り除き、均質化する前に体重を量ります。
   9. 1.5 mm KH₂PO₄、8 mm Na₂HPO₄、3 mm KCl、137 mm NaCl、および0.1% Tween20、10 mM EDTAを含む溶解バッファーpH 7.2を調製し、新たに調製したプロテアーゼ阻害混合物を調製します。
   10. 新鮮な溶解バッファー(200〜500 mgの組織サンプルに対して1 mLの溶解バッファー)で脳をホモジナイズし、氷上のガラスホモジナイザーを使用します。
   11. 得られた懸濁液を超音波細胞攪乱器で溶液が清澄になるまで超音波処理します。
   12. ホモジネートを10,000 × g で5分間遠心分離します。
   13. シングルチャンネルの機械式ピペット(100-1000 μL)を使用して上清を回収し、すぐにアッセイするか、分注して≤-20°Cで保存します。
2. 次の材料を準備します:450nm±10nmフィルターを備えたマイクロプレートリーダー。微量遠心チューブ;高精度で使い捨てのチップを備えたシングルまたはマルチチャンネルピペット。マイクロプレートを吸い取るための吸収性紙;洗浄液の容器;0.01 mol/L (または 1x) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS);脱イオン水または蒸留水。
3. 試薬を準備します。
   1. キットの成分とサンプルを室温(RT;18-25°C)に戻してから使用してください。
   2. 標準液を 1.0 mL の標準希釈液で再構成し、室温で 10 分間保持し、泡立たないように静かに振とうします。標準原液は300 pg/mLです。0.6 mLの標準希釈液を含む5本のチューブを調製し、3回希釈シリーズを作成します。
   3. 希釈した標準試料の5点(300 pg/mL、100 pg/mL、33.33 pg/mL、11.11 pg/mL、3.70 pg/mL)をセットし、最後のチューブに標準希釈液(0 pg/mL)のみをブランクとしてセットします。
   4. 検出試薬Aと検出試薬Bのストック溶液は、使用前に迅速にスピンダウンしてください。アッセイ希釈液AおよびBで100倍に希釈し、作業濃度を調製します。
   5. 20 mLの濃縮洗浄液(30倍)を580 mLの脱イオン水または蒸留水で希釈して、600 mLの洗浄液(1倍)を作ります。
   6. 滅菌したチップで必要な量の溶液を吸引し、残留溶液を再びバイアルに捨てないでください。.
4. アッセイを実施します。
   1. 希釈した標準試料、ブランク、およびサンプルのウェルを決定します。
   2. 標準ポイント用に5つのウェルとブランク用に1つのウェルを準備します。
      1. 標準希釈液、ブランク希釈液、サンプル希釈液をそれぞれ50 μLずつ対応するウェルに加えます。次に、50 μLの検出試薬Aを各ウェルに直ちに加えます。
      2. プレートを軽く振って(マイクロプレートシェイカーを推奨)、プレートシーラーで覆います。プレートを37°Cで1時間インキュベートします。検出試薬Aが曇って見えることがあります。溶液をRTに温め、均一になるまで穏やかに混合します。
   3. 溶液を吸引し、噴出ボトル、マルチチャンネルピペット、マニホールドディスペンサー、または自動洗浄機を使用して、350 μLの1x洗浄液で各ウェルを洗浄します。プレートを1〜2分間邪魔しないままにします。プレートを吸収紙にはめ込み、すべてのウェルから残りの液体を完全に取り除きます。この手順を3回繰り返します。
   4. 最後の洗浄後、残りの洗浄バッファーを吸引またはデカントします。プレートを反転させ、吸収性紙に対して撫でることにより、洗浄液を完全に除去します。
   5. 各ウェルに100 μLの検出試薬Bワーキング溶液を加え、プレートシーラーで覆った後、プレートを37°Cで30分間インキュベートします。
   6. 吸引/洗浄手順を合計5分間繰り返します。
   7. 各ウェルに90μLの基質溶液を加え、新しいプレートシーラーでプレートを覆います。光から保護した状態で37°C(30分を超えないように)で10〜20分間インキュベートします。基質溶液を追加すると、液体が青色に変わります。
   8. 各ウェルに50 μLの停止溶液を加えて、反応を終了します。ストップソリューションを追加すると、液体が黄色に変わります。プレートの側面を軽くたたいて液体を混ぜます。色の変化が一貫していない場合は、プレートを軽くたたいて、完全に混合するようにします。
   9. プレートの底の水と指紋を完全に除去し、液体表面に気泡が形成されないようにしてください。その後、すぐに450 nmのマイクロプレートリーダーでプレートを読み取ります。
5. 結果を計算します。
   1. 各標準試料、コントロール、およびサンプルの重複読み取り値の平均を決定します。Y軸にAβ1-42濃度の対数、X軸に吸光度で標準曲線をプロットします。
   2. ポイントを通る最適な曲線を描画します。これは、回帰分析によって決定できます。
   3. 希釈したサンプルを使用した場合は、標準曲線から得られた濃度に希釈係数を掛けます。
      注:ELISAについては、この研究ではAβ 1-42を測定するためのキットを使用しました。

結果

最初のステップでは、この研究は、覚醒した成人(生後2〜3か月、26〜29 g)の男性BALB / cマウスの脳からの蛍光Aβのリンパ管除去を刺激するための有効な光量(1050 nm LED)を確立することに焦点を当てています。光線量は、脳からのさまざまな色素と赤血球の除去に対するtPBMの影響に関する以前の研究に基づいて^、10 J/cm²、20 J^{/cm 2}、および30 J/cm 2にランダムに選択さ?...

ディスカッション

MLVは、特にMLV機能が低下している高齢者において、脳のドレナージを調節し、脳からの細胞の破片や老廃物を除去するための革新的な技術の開発のための重要なターゲットです^1,22。恒常性状態では、深い睡眠は脳組織の浄化の自然な活性化と関連しています^13,14。したがって、深い睡眠中のMLVの刺激は、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Tween20	Helicon,  Russia	SB-G2009-100ML
Catheter	Scientific Commodities Inc., USA	PE-10, 0.28 mm ID × 0.61 mm OD
CO2 chamber	Binder, Germany	CB-S 170
Confocal microscop	Nikon, Japan	A1R MP
Dental acrylic	Zermack, Poland-Russia	Villacryl S, V130V4Z05
Drill	Foredom, Russia	SR W-0016
Dumont forceps	Stoelting, USA	52100-07
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Switzerland	29 G needle
Ibuprofen	Sintez OJSC, Russia	N/A	Analgesic drug
Insulin needle	INSUPEN, Italy	31 G, 0.25 mm x 6 mm
Levomekol antibacterial ointment	Nizhpharm	D06C	For external use at a dose of 40 mg/g, 1 time per day
Micro forceps	Stoelting, USA	52102-02P
Microcentrifuge	Gyrozen, South Korea	GZ-1312
Microinjector	Stoelting, USA	53311
Non-sharp tweezer	Stoelting, USA	52108-83P
PINNACLE system	Pinnacle Technology, USA	8400-K3-SL	System for recording EEG (2 channels) and EMG (1 channel) of mice
Shaving machine	Braun	Series 3310s
Single and multi-channel pipettes	Eppendorf, Austria	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Sodium chloride	Kraspharma, Russia	N/A
Soldering station	AOYUE, China	N/A
Stereotaxic frame	Stoelting, USA	51500
Straight dissecting scissors	Stoelting, USA	52132-10P
Tetracycline	JSC Tatkhimfarmpreparaty, Russia	N/A	Eye ointment
Tweezer	Stoelting, USA	52100-03
Ultrasonic cell disrupter	Biobase, China	USD-500
Wound retractor	Stoelting, USA	52125
Xylanit	Nita-Farm, Russia	N/A	Muscle relaxant
Zoletil 100	Virbac Sante Animale, France	N/A	General anesthesia