Photobiomodulation sous contrôles électroencéphalographiques du sommeil pour la stimulation de l’élimination lymphatique des toxines du cerveau de souris

Résumé

Cette étude présente la technologie non invasive et portable de photobiomodulation transcrânienne sous contrôle électroencéphalographique pour la stimulation lymphatique élimination des toxines (par exemple, la bêta-amyloïde soluble) du cerveau de souris mâles BALB/c âgées et non anesthésiées pendant le sommeil profond naturel.

Résumé

Les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) jouent un rôle important dans l’élimination des toxines du cerveau. Le développement de technologies innovantes pour la stimulation des fonctions du MLV est une direction prometteuse dans le progrès du traitement de diverses maladies cérébrales associées à des anomalies du MLV, notamment les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, les tumeurs cérébrales, les lésions cérébrales traumatiques et les hémorragies intracrâniennes. Le sommeil est un état naturel lorsque les processus de drainage du cerveau sont les plus actifs. Par conséquent, la stimulation du drainage cérébral et des MLV pendant le sommeil peut avoir les effets thérapeutiques les plus prononcés. Cependant, de telles technologies commerciales n’existent pas à l’heure actuelle.

Cette étude présente une nouvelle technologie portable de photobiomodulation transcrânienne (tPBM) sous contrôle électroencéphalographique (EEG) du sommeil, conçue pour photostimuler l’élimination des toxines (par exemple, la bêta-amyloïde soluble (Aβ)) du cerveau de souris BALB/c âgées, avec la possibilité de comparer l’efficacité thérapeutique de différentes ressources optiques. La technologie peut être utilisée dans l’état naturel d’une cage domestique sans anesthésie, en maintenant l’activité motrice des souris. Ces données ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de phototechnologies non invasives et cliniquement prometteuses pour la correction des modifications liées à l’âge des fonctions MLV et des processus de drainage du cerveau, ainsi que pour le nettoyage efficace des tissus cérébraux des métabolites et des toxines. Cette technologie est destinée à la fois aux études précliniques des fonctions du cerveau endormi et au développement de traitements cliniquement pertinents pour les maladies cérébrales liées au sommeil.

Introduction

Les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) jouent un rôle important dans l’élimination des toxines et des métabolites des tissus cérébraux ^1,2,3. Les dommages causés par les MLV dans diverses maladies cérébrales, y compris les tumeurs, les lésions cérébrales traumatiques, les hémorragies et les processus neurodégénératifs, s’accompagnent d’une diminution des fonctions MLV conduisant à la progression de ces pathologies 1,2,3,4,5,6 . Par conséquent, le développement de méthodes de stimulation des MLV ouvre de nouveaux horizons dans l’émergence de technologies efficaces pour le traitement des maladies du cerveau. Récemment, une technologie non invasive de photobiomodulation transcrânienne efficace (tPBM) a été proposée pour stimuler les MLV et éliminer les toxines telles que le sang et l’Aβ du cerveau 5,7,8,9,10,11,12. Il est intéressant de noter que le sommeil profond est un facteur naturel pour l’activation des processus de drainage lymphatique dans le cerveau^13,14. Sur la base de ce fait, il est logique de supposer que le tPBM des MLV pendant le sommeil peut avoir des effets thérapeutiques plus efficaces que pendant l’éveil 9,11,12,15. Cependant, il n’existe actuellement aucune technologie commerciale pour le tPBM pendant le sommeil¹⁶. De plus, des expériences sur des animaux pour étudier les effets thérapeutiques du tPBM sont effectuées sous anesthésie, qui est nécessaire pour fournir avec précision de la lumière au cerveau. Cependant, l’anesthésie affecte considérablement le drainage du cerveau, ce qui réduit la qualité des résultats de recherche¹⁷.

Aβ est un produit métabolique de l’activité neuronale normale¹⁸. Comme il a été établi dans les neurones corticaux de rat en culture, Aβ est libéré à des taux élevés dans l’espace extracellulaire (2-4 molécules/neurones/s pour Aβ)¹⁹. Il existe des preuves que la forme dissoute de Aβ, située dans les espaces extracellulaires et périvasculaires, est la plus toxique pour les neurones et les synapses²⁰. L’Aβ soluble est rapidement éliminé du cerveau humain en 1 à 2,5 h²¹. Les MLV sont les tunnels d’élimination de l’Aβ soluble du cerveau ^1,7 qui diminue avec l’âge, conduisant à l’accumulation d’Aβ dans le cerveau âgé ^1,22. Il existe des preuves que les anomalies extracellulaires des niveaux d’Aβ dans le cerveau sont corrélées avec les performances cognitives au cours du vieillissement et sont associées au développement de la maladie d’Alzheimer (MA)^23,24. Par conséquent, les rongeurs âgés et âgés sont considérés comme des alternatives aux modèles transgéniques pour l’étude de l’amylose, y compris AD^25,26.

Cette étude présente une technologie tPBM originale et portable sous contrôle électroencéphalographique (EEG) du sommeil profond ou à mouvements oculaires non rapides (NREM) chez des souris BALB/c mâles non anesthésiées d’âges différents pour stimuler la clairance lymphatique de Aβ du cerveau vers le système lymphatique périphérique (les ganglions lymphatiques cervicaux profonds, dcLNs).

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire », à la Directive 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, et aux directives du Ministère des Sciences et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie (Nº 742 du 13.11.1984), qui ont été approuvées par la Commission de bioéthique de l’Université d’État de Saratov (Protocole n° 7, 22.09.2022).

1. Assemblage du matériel

1. Coupez un morceau de textolite en aluminium de 1,5 mm d’épaisseur aux dimensions de 1,5 mm x 2 mm. Cette pièce sera appelée carte de circuit imprimé (PCB) à diode électroluminescente (LED) (Figure 1C).
2. Soudez une LED à un circuit imprimé, comme illustré à la Figure 1.
3. Soudez deux fils de cuivre toronnés aux broches d’une LED, puis couvrez-les d’un manchon.
4. Imprimez le modèle 3D du cadre (Figure 1A) ; placez une LED (Figure 1B) et des aimants (Figure 1D) sur le cadre ; placez une rondelle (Figure 1E) sur la tête de la souris.
5. Pour assembler le circuit (Figure 2), procédez comme suit.
   1. Tout d’abord, connectez la résistance (Figure 2 ; R1) entre une anode LED et un port 5 V sur l’Arduino.
   2. Ensuite, connectez une cathode LED au transistor à effet de champ (MOSFET) à semi-conducteur à oxyde métallique (Figure 2 ; Q1) Égoutter. Ensuite, connectez la source MOSFET à la terre.
   3. Connectez la résistance de traction (Figure 2 ; R2) entre la porte du MOSFET et le sol. Enfin, connectez la porte MOSFET à la broche 3 de l’Arduino.
6. Connectez un écran à cristaux liquides (LCD) à l’Arduino.
7. Imprimez les modèles 3D du boîtier, de la plaque de recouvrement et des boutons. Insérez la carte Arduino avec le clavier LCD, le MOSFET et le connecteur LED dans le boîtier, comme illustré à la Figure 3.

2. Guide du logiciel (Figure 4)

1. Téléchargez l’esquisse Arduino (fichier .ino) et ouvrez-la via l’environnement de développement intégré (IDE) Arduino (Supplementary Coding File 1).
2. Sélectionnez le port de communication (COM) approprié et flashez le micrologiciel.
3. L’interface comprend deux colonnes. Utilisez les boutons Gauche et Droite pour naviguer entre ces colonnes. L’indicateur de sélection est situé à gauche de la colonne.
4. La colonne de gauche à l’écran est le champ de sélection du rapport cyclique par modulation de largeur d’impulsion (PWM). Utilisez les boutons Haut et Bas pour régler le cycle de service. Atteignez la dose de PBM de 10/20/30 Dj/cm² avec un rapport cyclique PWM correspondant de 2 %/4 %/6 % en une session de 17 minutes.
5. La colonne de droite de l’écran est le champ RUN/Off. Pour sélectionner cette colonne, appuyez sur le bouton droit du clavier, puis appuyez sur Sélectionner. Lorsque le processus est en cours d’exécution, l’indicateur d’activité clignote et le texte du bouton RUN passe à OFF.
   NOTE. Les souris sont préparées pour les expériences sur une période de 10 jours, y compris l’implantation d’électrodes EEG, l’implantation d’un cathéter chronique dans le ventricule latéral droit pour l’injection d’Aβ fluorescent et la mise en place d’une plaque pour la PBM.

3. Implantation d’un système d’enregistrement EEG (Figure 5)

1. Pesez la souris et anesthésiez-la avec un mélange de Zoletil 100 et de Xylanite (100 mg/kg ; 10 mg/kg, respectivement) par injection intramusculaire dans la cuisse.
2. Lorsque les réflexes de retrait du pied arrière et la réponse de pincement de la queue cessent, placez la souris dans un cadre stéréotaxique au-dessus d’un coussin chauffant (Figure 5A).
3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les paupières pour éviter le dessèchement des globes oculaires pendant la chirurgie. Répétez cette procédure chaque fois que nécessaire.
4. Rasez la tête dans la zone allant des os nasaux aux os occipitaux à l’aide d’une machine à raser et stérilisez d’abord la peau exposée avec de l’alcool.
5. À l’aide de ciseaux de dissection droits, coupez le cuir chevelu, maintenez-le avec une micro-pince, nettoyez le crâne du fascia et séchez-le avec des cotons-tiges. Si nécessaire, utilisez les agents hémostatiques.
6. À l’aide d’une perceuse d’un diamètre de 1,3 mm, faites 2 trous dans les os temporaux de chaque côté le long des coordonnées : PA = -1 mm pour la première paire de vis et AP = -3 mm pour la deuxième paire de vis.
7. Placez les vis EEG avec les fils conducteurs dans de l’alcool pendant 5 min. Ensuite, placez les vis EEG dans la solution saline.
8. Insérez quatre vis plaquées argent avec électrodes dans les trous à une profondeur de 1 mm (Figure 5B).
9. Fixez les vis à la surface du crâne à l’aide d’acrylique dentaire de manière à ce que les électrodes qui s’étendent à partir d’elles soient situées vers le nez de l’animal (Figure 5C). Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 15 min.
10. Fixez un capteur d’enregistrement EEG sur le nez de l’animal à l’aide d’acrylique dentaire. Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 30 min (Figure 5D).
11. Placez les électrodes EMG à l’arrière du muscle orbicularis oculi à l’aide d’une pince à épiler incurvée et fixez-les avec l’acrylique dentaire. Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 15 minutes (Figure 5E).
12. Connectez les électrodes EEG à l’évidement plaqué argent du capteur et soudez-les à l’aide d’une station de soudage. Ensuite, fixez les électrodes EEG à l’aide de l’acrylique dentaire (Figure 5F).
13. Après l’opération, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle jusqu’à ce que l’animal se remette complètement de l’anesthésie.
14. Ensuite, placez la souris dans une cage domestique individuelle avec un accès libre à de la nourriture et de l’eau avec de l’ibuprofène (40 mg/kg dans 200 ml d’eau) pour l’analgésie après la chirurgie pendant 10 jours.

4. Implantation d’une plaque pour PBM

1. Pesez la souris et anesthésiez-la avec un mélange de Zoletil 100 et de Xylanite (100 mg/kg ; 10 mg/kg, respectivement) par injection intramusculaire dans la cuisse 7 jours après l’implantation du système d’enregistrement EEG.
2. Lorsque les réflexes de retrait du pied arrière et la réponse de pincement de la queue cessent, fixez la souris dans un système stéréotaxique.
3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les paupières pour éviter le dessèchement des globes oculaires pendant la chirurgie. Répétez cette procédure chaque fois que nécessaire.
4. Fixez une plaque métallique d’un diamètre de 5 mm sur l’os occipital du crâne à l’aide d’acrylique dentaire et d’une pince Dumont. Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 15 minutes (Figure 6).

5. Préparation d’un cathéter chronique

1. Marquez sur l’aiguille à insuline un segment à 2 cm du côté de l’extrémité biseautée.
2. Fixez l’aiguille à insuline dans le porte-aiguille du côté de l’embout biseauté au segment marqué.
3. Placez un cathéter en polyéthylène PE-10 de 2 cm sur toute la longueur restante de l’aiguille.
4. Remplissez le cathéter d’une solution saline et couvrez-le d’un capuchon en plastique pour le sceller.

6. Implantation d’un cathéter chronique dans le ventricule latéral droit

1. Après implantation de la plaque pour PBM, faites un trou de trépanation aux coordonnées AP = -0,5 mm et ML = 1,2 mm, avec un diamètre de 1,5 mm, à l’aide d’une perceuse.
2. Placez le cathéter en polyéthylène PE-10 dans un support stéréotaxique et insérez-le dans le crâne de la souris (DV = 2 mm). Ensuite, fixez-le à l’aide de l’acrylique dentaire. Laissez l’acrylique dentaire durcir pendant 15 minutes (Figure 7).
3. Après l’opération, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle jusqu’à ce que l’animal se remette complètement de l’anesthésie.
4. Ensuite, placez la souris dans une cage domestique individuelle avec un accès libre à de la nourriture et de l’eau avec de l’ibuprofène (40 mg/kg dans 200 ml d’eau) pour l’analgésie après la chirurgie pendant 10 jours.

7. tPBM sous contrôle EEG du sommeil NREM

1. Connectez n’importe quel système d’enregistrement EEG commercial au connecteur situé sur la tête de la souris et définissez la valeur requise du cycle de service PWM.
2. Surveillez le signal EEG et attendez l’activité du rythme delta. Si vous observez un sommeil NREM, lancez le processus PBM et arrêtez-le si le sommeil NREM passe au sommeil paradoxal ou à l’éveil. La dose augmente à chaque interaction jusqu’à ce qu’elle atteigne la valeur requise.
3. Lorsque la dose requise de PBM est obtenue, la séance est terminée.

8. Imagerie confocale de l’élimination lymphatique de Aβ du cerveau de souris

1. Connectez un cathéter de 10 cm à une aiguille à insuline.
2. À l’aide d’une seringue Hamilton munie d’une aiguille de 29 G, préparer une perfusion de bêta-amyloïde fluorescente (FAβ) d’un volume de 5 μL dans le cathéter. Laissez le cathéter sur une seringue Hamilton.
3. Fixez la main de la souris et connectez le cathéter à l’aide d’une aiguille au cathéter chronique implanté.
4. Connectez le cathéter à un micro-injecteur. Ensuite, placez la souris dans une boîte individuelle ;
5. Sélectionnez le taux d’injection 0,1 μL/min dans le menu des micro-injecteurs et appuyez sur le bouton Démarrer.
6. Injecter du FAβ dans le ventricule latéral droit.
7. Après l’administration de FAβ, effectuer le PBM à l’aide d’une LED pendant 61 min en suivant l’algorithme : 17 min - lumière et 5 min - pause sur 61 min.
8. Après la PBM, injecter par voie intraveineuse tout traceur pour marquer les vaisseaux cérébraux via la queue.
9. Après l’injection, euthanasiez les souris à l’aide de la chambre d’euthanasie au CO₂ .
10. À l’aide de ciseaux droits et tranchants, faites une petite incision transversale dans la peau le long de la trachée, en tenant la peau avec une pince à épiler droite non tranchante.
11. Faites une incision longitudinale sur toute la longueur du cou à l’aide de ciseaux droits.
12. À l’aide d’une pince à épiler incurvée, prenez les glandes salivaires et séparez-les soigneusement du tissu conjonctif. Placez un écarteur de plaie sur la partie ouverte de l’incision et fixez-le de manière à repousser les tissus environnants.
13. Examinez la zone située entre la trachée et le muscle cléido-mastoïdien à l’aide de deux pinces à épiler incurvées des deux côtés du cou.
14. Lorsque le ganglion lymphatique cervical profond (dcLN) est détecté de chaque côté, enlevez les dcLN à l’aide d’une pince à épiler droite aux extrémités émoussées et coupez-le du tissu conjonctif.
15. Placez les dcLNs dans une boîte de Pétri avec une solution saline et couvrez-les d’un verre de couverture orienté horizontalement (25 mm × 50 mm × 0,17 mm).
16. Utilisez n’importe quel microscope confocal commercial pour obtenir des images de dcLNs entiers.

9. Analyse de l’Aβ dans les lysats des tissus cérébraux

1. Préparez les échantillons pour le dosage.
   1. Euthanasiez des souris à l’aide de la chambre d’euthanasie au CO₂ .
   2. Décapitez la souris, retirez la peau de sa tête et retirez les muscles du crâne.
   3. Faites deux incisions avec des ciseaux pointus et droits du grand foramen occipital au conduit auditif.
   4. À l’aide d’une pince à épiler droite, séparez la partie ventrale du crâne, l’os occipital et les os formant les cavités de l’oreille moyenne.
   5. À l’aide d’une pince à épiler, séparez le cerveau des os pariétals et frontaux.
   6. À l’aide de ciseaux droits, retirez la mâchoire supérieure et coupez les bulbes olfactifs.
   7. Placez le cerveau dans la solution physiologique.
   8. Rincez le cerveau dans une solution saline froide tamponnée au phosphate pour éliminer soigneusement l’excès de sang et pesez avant l’homogénéisation.
   9. Préparez un tampon de lyse pH 7,2 contenant 1,5 mm KH₂PO₄, 8 mm Na₂HPO₄, 3 mm KCl, 137 mm NaCl et 0,1 % de Tween20, 10 mM EDTA avec un mélange inhibiteur de protéase fraîchement préparé.
   10. Homogénéiser le cerveau dans un tampon de lyse frais (1 mL de tampon de lyse pour un échantillon de tissu de 200 à 500 mg) avec un homogénéisateur en verre sur de la glace.
   11. Sonicer une suspension résultante avec un perturbateur cellulaire à ultrasons jusqu’à ce que la solution soit clarifiée.
   12. Centrifuger les homogénats à 10 000 × g pendant 5 min.
   13. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette mécanique monocanal (100-1000 μL) et doser immédiatement ou aliquote et stocker à ≤-20 °C.
2. Préparez les matériaux suivants : lecteur de microplaques avec filtre de 450 nm ± 10 nm ; tubes de microcentrifugation ; pipettes monocanaux ou multicanaux avec pointes de haute précision et jetables ; papier absorbant pour éponger la microplaque ; récipient pour solution de lavage ; 0,01 mol/L (ou 1x) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ; et l’eau déminéralisée ou distillée.
3. Préparez les réactifs.
   1. Amenez les composants du kit et les échantillons à température ambiante (RT ; 18-25 °C) avant utilisation.
   2. Reconstituez l’étalon avec 1,0 mL de diluant standard, conservez-le pendant 10 min à RT et agitez-le doucement (pour ne pas mousser). La solution mère standard est de 300 pg/mL. Préparez 5 tubes contenant un volume de 0,6 mL de diluant standard et faites une série de dilutions triples.
   3. Mettre en place 5 points (300 pg/mL, 100 pg/mL, 33,33 pg/mL, 11,11 pg/mL et 3,70 pg/mL) de l’étalon dilué, et les derniers tubes avec comme blanc contenant uniquement le diluant standard (0 pg/mL).
   4. Essorez rapidement les solutions mères du réactif de détection A et du réactif de détection B avant de les utiliser. Diluez-les 100 fois avec les diluants d’essai A et B pour préparer la concentration de travail.
   5. Diluer 20 mL de la solution de lavage concentrée (30x) avec 580 mL d’eau désionisée ou distillée pour obtenir 600 mL de solution de lavage (1x).
   6. Aspirez la dose nécessaire de la solution avec des embouts stérilisés et ne versez pas à nouveau la solution résiduelle dans le flacon.
4. Effectuez le test.
   1. Déterminer les puits pour un étalon dilué, un blanc et un échantillon.
   2. Préparez 5 puits pour les points standard et un puits pour les blancs.
      1. Ajouter 50 μL de dilutions standard, blanches et d’échantillon dans les puits correspondants, respectivement. Ensuite, ajoutez immédiatement 50 μL de réactif de détection A dans chaque puits.
      2. Secouez doucement la plaque (un agitateur de microplaques est recommandé) et couvrez-la d’un scelleur de plaques. Incuber la plaque à 37 °C pendant 1 h. Le réactif de détection A peut sembler trouble. Réchauffez la solution à RT et mélangez doucement jusqu’à ce qu’elle apparaisse uniforme.
   3. Aspirez la solution et lavez chaque puits avec 350 μL de 1x solution de lavage à l’aide d’un flacon pulvérisateur, d’une pipette multicanaux, d’un distributeur de collecteur ou d’un lave-auto. Laissez l’assiette tranquille pendant 1 à 2 min. Enclenchez la plaque sur du papier absorbant pour éliminer complètement le liquide restant de tous les puits. Répétez cette procédure 3 fois.
   4. Après le dernier lavage, aspirez ou décantez tout tampon de lavage restant. Assurez-vous d’éliminer complètement la solution de lavage en inversant la plaque et en l’épongeant contre du papier absorbant.
   5. Ajouter 100 μL de solution de travail du réactif de détection B dans chaque puits et incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C après l’avoir recouverte avec la scelleuse de plaques.
   6. Répétez les étapes d’aspiration/lavage pendant un total de 5 min.
   7. Ajoutez 90 μL de solution de substrat dans chaque puits et recouvrez la plaque d’un nouveau scelleur de plaques. Incuber pendant 10-20 min à 37 °C (ne pas dépasser 30 min) à l’abri de la lumière. Après avoir ajouté la solution de substrat, le liquide deviendra bleu.
   8. Ajouter 50 μL d’une solution d’arrêt dans chaque puits pour terminer la réaction. L’ajout de la solution d’arrêt rendra le liquide jaune. Tapotez la plaque sur le côté pour mélanger le liquide. Si le changement de couleur est incohérent, tapotez doucement la plaque pour assurer un mélange complet.
   9. Assurez-vous de l’élimination complète de l’eau et des empreintes digitales sur le fond de la plaque et de l’absence de formation de bulles sur la surface du liquide. Ensuite, lisez immédiatement la plaque dans un lecteur de microplaques à 450 nm.
5. Calculez les résultats.
   1. Déterminez la moyenne des relevés en double pour chaque étalon, témoin et échantillon. Tracez une courbe standard avec le log de la concentration Aβ 1-42 sur l’axe des y et de l’absorbance sur l’axe des x.
   2. Tracez une courbe de meilleur ajustement à travers les points, qui peut être déterminée par analyse de régression.
   3. Si des échantillons dilués ont été utilisés, multipliez la concentration obtenue à partir de la courbe standard par le facteur de dilution.
      REMARQUE : Pour l’étude ELISA, un kit de dosage de Aβ 1-42 a été utilisé dans cette étude.

Résultats

Dans un premier temps, l’étude s’est concentrée sur l’établissement de la dose lumineuse efficace (une LED de 1050 nm) pour la stimulation de l’élimination lymphatique de l’Aβ fluorescent du cerveau vers les dcLNs chez des souris BALB/c mâles adultes éveillées (2-3 mois, 26-29 g). Les doses de lumière ont été sélectionnées au hasard comme 10 J/cm^2, 20 J/cm² et 30 J/cm² sur la base de nos études précédentes sur les effets du tPBM sur l’élimination de...

Discussion

Les MLV sont une cible importante pour le développement de technologies innovantes pour la modulation du drainage cérébral et l’élimination des débris et des déchets cellulaires du cerveau, en particulier chez les sujets âgés dont la fonction MLV décline ^1,22. Dans un état homéostatique, le sommeil profond est associé à l’activation naturelle du nettoyage des tissus cérébraux^13,14. Par ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Tween20	Helicon,  Russia	SB-G2009-100ML
Catheter	Scientific Commodities Inc., USA	PE-10, 0.28 mm ID × 0.61 mm OD
CO2 chamber	Binder, Germany	CB-S 170
Confocal microscop	Nikon, Japan	A1R MP
Dental acrylic	Zermack, Poland-Russia	Villacryl S, V130V4Z05
Drill	Foredom, Russia	SR W-0016
Dumont forceps	Stoelting, USA	52100-07
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	206334
Hamilton	Hamilton Bonaduz AG, Switzerland	29 G needle
Ibuprofen	Sintez OJSC, Russia	N/A	Analgesic drug
Insulin needle	INSUPEN, Italy	31 G, 0.25 mm x 6 mm
Levomekol antibacterial ointment	Nizhpharm	D06C	For external use at a dose of 40 mg/g, 1 time per day
Micro forceps	Stoelting, USA	52102-02P
Microcentrifuge	Gyrozen, South Korea	GZ-1312
Microinjector	Stoelting, USA	53311
Non-sharp tweezer	Stoelting, USA	52108-83P
PINNACLE system	Pinnacle Technology, USA	8400-K3-SL	System for recording EEG (2 channels) and EMG (1 channel) of mice
Shaving machine	Braun	Series 3310s
Single and multi-channel pipettes	Eppendorf, Austria	Epp 3120 000.020, Epp 3122 000.019
Sodium chloride	Kraspharma, Russia	N/A
Soldering station	AOYUE, China	N/A
Stereotaxic frame	Stoelting, USA	51500
Straight dissecting scissors	Stoelting, USA	52132-10P
Tetracycline	JSC Tatkhimfarmpreparaty, Russia	N/A	Eye ointment
Tweezer	Stoelting, USA	52100-03
Ultrasonic cell disrupter	Biobase, China	USD-500
Wound retractor	Stoelting, USA	52125
Xylanit	Nita-Farm, Russia	N/A	Muscle relaxant
Zoletil 100	Virbac Sante Animale, France	N/A	General anesthesia