使用 16α-[18F]-氟-17β-雌二醇 PET 可视化雌性卵巢切除小鼠人乳腺癌异种移植物中雌激素受体α表达

摘要

在这里，我们展示了一种使用 16α-[18F]-氟-17β-雌二醇 （¹⁸F-FES） 正电子发射断层扫描 （PET） 作为可视化 ERα 阳性乳腺异种移植物中 ERα 表达的方案。

摘要

为了演示如何使用 16α-[18F]-氟-17β-雌二醇 （¹⁸F-FES） 正电子发射断层扫描 （PET） 在 BALB/c 裸鼠中可视化雌激素受体 α （ERα） 阳性乳腺癌异种移植物，卵巢切除的 BALB/c 裸鼠注射 ERα 阳性乳腺癌细胞（MCF-7,3 × 10⁶ 个细胞;肩部 [n = 10] 或^{第 4 个} 腹股沟乳腺脂肪垫 [n = 10]）或 ERα 阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231， 1 × 10⁶ 个细胞;乳腺脂肪垫 [n = 5]）。细胞注射前 2 天，携带 MCF-7 细胞的小鼠在其颈背皮下注射 20 μg 17β-雌二醇（20 μg/20 μL;玉米油：乙醇，9：1），然后每天注射，每周 5 次，持续 5 周。根据公式测量肿瘤体积：（L*W²）/2 （L; 长度， W; 宽度）。一旦肿瘤体积达到约 100 mm³，在小鼠接受 ¹⁸F-FES 进行 PET 成像前 2 天停止 17β-雌二醇注射，以避免与 ERα 竞争性结合。经侧尾静脉施用 ¹⁸次 F-FES 后，在注射后 1 小时至 1.5 小时进行 PET/MRI 15 分钟。 ¹⁸在 ERα 阴性、MDA-MB-231 荷瘤小鼠中未观察到 F-FES 摄取。 ¹⁸F-FES 摄取在肩部携带 MCF-7 肿瘤的小鼠中最为明显。在腹股沟乳腺脂肪垫中生长的 MCF-7 肿瘤中， ¹⁸个 F-FES 的摄取不太明显，因为 ¹⁸个 F-FES 的肠道排泄模式掩盖了在这些肿瘤中可检测到的放射性。为了使用 ¹⁸F-FES PET 作为可视化 ERα 阳性乳腺异种移植物中 ERα 表达的工具，我们证明了 ¹⁸F-FES 摄取的可见性在远离小鼠腹部区域的肿瘤中是明显的，例如在肩部。

引言

乳腺癌 （BC） 可分为不同的分子亚型¹。被归类为管腔亚型的乳腺肿瘤过表达雌激素受体 α （ERα）。因此，BC 的这种亚型也称为 ERα 阳性 （ERα⁺）。幸运的是，那些被诊断为 ERα⁺ BC 的患者的 10 年生存率最高，远处转移率低 ^2,3。由于 ERα 表达，此类患者可以获得一系列激素治疗选择，包括选择性雌激素受体调节剂 （SERM）、抗雌激素药物和芳香化酶抑制剂⁴。

为了评估乳腺癌患者是否有资格接受激素治疗，必须确定乳腺肿瘤内 ERα 的表达水平 ^5,6,7。虽然测试的金标准是使用免疫组织化学 （IHC） 方法进行的，但许多报告强调了所获结果的可重复性和可靠性问题 ^6,8,9。IHC 会导致结果不一致，因为该技术本质上是半定量的，其中组织处理和后续解释的差异会导致变异^{性 6}。为了纠正这个反复出现的问题，美国临床肿瘤学会于 2010 年制定了指南，并于 2020 年更新了指南，旨在减少观察者间差异¹⁰。目前，临床验证的临界值为 ≥1%，即使在非常小的表达水平下，ERα 表达也显示出使用内分泌治疗的临床意义益处¹¹。

在晚期 BC 中，转移瘤和原发肿瘤之间的 ERα 表达可能不同。一些观察结果报告了转移病灶和原发肿瘤之间 ERα 表达水平的 18%-55% 差异，表明确定 BC 转移的 ERα 状态的重要性¹²。为了解决这个问题，指南强调了确认转移性病变中激素受体状态以制定明智的治疗计划的重要性^13,14。然而，考虑到转移可能存在于难以进行活检的地方，这种做法的可行性值得怀疑，特别是通过 IHC 方法。

分子成像方法已成为检测和可视化癌症患者肿瘤病变的重要工具。特别是，正电子发射断层扫描 （PET） 成像需要使用示踪剂，或者更具体地说，需要使用放射性药物，这些示踪剂旨在利用肿瘤的某些特征，以非侵入性方式可视化这些病变。肿瘤学中最常用的 PET 示踪剂是 ¹⁸F-氟脱氧葡萄糖 （¹⁸F-FDG）¹⁵。在这项研究中，我们探讨了放射性标记形式的雌二醇 ¹⁸F-氟雌二醇 （¹⁸F-FES） 的使用。雌二醇 - ERα 的配体 - 是一种主要由女性卵巢产生的激素¹⁶. ¹⁸F-FES 最近获得了美国食品药品监督管理局 （FDA） 的批准，并以 Cerianna^TM 的名义销售。该显像剂旨在用作复发或转移性 BC¹⁷ 患者活检的辅助手段。使用 ¹⁸F-FES 进行全身 PET 成像可用作一种非侵入性方法，用于检测原发肿瘤和难以活检的区域的远处转移中的 ERα 水平¹⁸。使用 ¹⁸F-FES PET 成像预测 ERα 水平与 IHC 结果相关，此外，使用 ¹⁸F-FES PET 成像几乎不检测到 ERα 是不太可能对激素治疗有反应的肿瘤的可靠预测指标¹⁸。为确保在临床上适当使用 ¹⁸F-FES，该领域的专家通过共识制定了指南¹⁹。在这项研究中，我们评估了 ¹⁸F-FES PET 在小鼠乳腺癌临床前模型中的使用。

研究方案

所有动物研究均已获得奥斯汀医院动物伦理委员会 （A2023/05812） 的批准，并按照澳大利亚科学目的照顾和使用动物的规范进行。

1. 细胞制备

1. 使用常规细胞培养程序，将 MDA-MB-231 和 MCF-7 细胞维持在 T175 组织培养瓶中补充有青霉素/链霉素和 10% 胎牛血清 （FBS） 的 DMEM/F-12 中。在准备注射细胞之前，从液氮储存中复苏后至少传代细胞 3 次。在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中培养细胞。
2. 繁殖细胞，使得在准备注射细胞的当天，15只小鼠每只小鼠每次注射有3×10^{6 MCF-7} 细胞（即，至少45×10⁶ 个MCF-7细胞）和1×10⁶ MDA-MB-231细胞，每只小鼠每次注射有5×10 6个MDA-MB-231细胞（即，至少510⁶ 个MDA-MB-231细胞）。
   注意：为了让每只小鼠中具有相同数量的细胞，请准备足够的细胞进行 5 次额外注射（例如，准备足够的细胞进行 10 次注射以注射 5 只小鼠）。
3. 在细胞注射当天，从所有烧瓶中取出培养基，并将大约 5 mL 胰蛋白酶-EDTA（0.25% 胰蛋白酶和 0.05% EDTA）放入 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.4） 中，以促进细胞分离。
4. 细胞分离后，将大约 10 mL 完全培养基放入培养瓶中以抑制胰蛋白酶活性。重悬细胞并将单细胞悬液转移到 50 mL 试管中。以 ~300 × g 离心 2 分钟以沉淀细胞。
5. 将细胞沉淀重悬于适当体积的培养基中，并对细胞进行计数以确定收获的细胞总数。
   注：旨在计数每 mL 约 1 × 10^{个 6} 个细胞的溶液（如果使用计数室，则每 16 个方格 50-100 个细胞）。对于每个满瓶以 5 × 10⁶ 生长的细胞，在 5 mL 培养基中收获细胞。对于密度较高的细胞系，每个培养瓶使用 10 mL 培养基。
6. 在无菌层流柜中的冰上执行此步骤。一旦达到此数量，将细胞悬液再次以 300 × g 离心 2 分钟以沉淀细胞。将沉淀重悬于冷 PBS 和冰冷的基底膜基质溶液中，使得每 3 × 10^个 6 MCF-7 细胞中，有 40 μL PBS 和 10 μL 基底膜基质溶液。
7. 用相同的成分重悬 MDA-MB-231 细胞沉淀，使得每 1 × 10^{个 6} 个细胞中，有 40 μL PBS 和 10 μL 基底膜基质溶液。用冷移液器吸头将细胞-PBS-基底膜基质混合物从 50 mL 试管转移到更小的 1.5 mL 试管中，并在将细胞注射到小鼠体内之前将细胞混合物保持在冰上。
   注意：本研究中使用的基底膜基质储存在 -20 °C。 在需要基底膜基质溶液的前一天，将等分试样的溶液置于 4 °C 下解冻过夜。第二天，它可以在低温下（在冰上）使用。移液溶液时，确保使用的移液器吸头是冷的，以防止基底膜基质溶液凝固。在注射细胞制备日之前，最好将一盒无菌移液器吸头放在冰箱中。当将细胞沉淀重悬于冰冷的 PBS 和基底膜基质溶液中时，首先加入 PBS，然后加入所需量的基底膜基质溶液。

2. 细胞注射到去卵巢小鼠中

1. 允许 6-8 周龄的雌性切除卵巢的 BALB/c 裸鼠在细胞注射前至少 1 周在动物饲养设施中适应环境。
   注意：这项研究使用了 12-14 周龄的老年小鼠。卵巢切除术可确保低水平的内源性雌二醇，并减少与 ¹⁸F-FES 配体的竞争。根据所研究的模型，由于内源性雌二醇水平较低，年轻小鼠（例如，4-8 周）可能不需要进行卵巢切除术^20,21。
2. 使用麻醉诱导室以 4 L/min 的速率在含有 4% 异氟烷和氧气的小鼠中诱导麻醉。观察鼠标并检查扶正反射是否丧失。一旦它们不再移动，将小鼠转移到无菌层流柜中，将鼻子放入鼻罩中，并通过将异氟醚调节至 2% 和氧气调节至 2 L/min 的速率来保持麻醉。
   注意：一次麻醉一只鼠标以确保最佳护理。
3. 对于乳内脂肪垫 （IMF） 注射，用酒精擦拭^{第 4 腹} 股沟乳腺的皮肤。使用预冷（冰上）的 27 G 注射器吸取冷室悬浮液，并将注射器留在冰上，以防止注射前加热/固化基底膜基质溶液。
4. 用非惯用手的拇指和食指轻轻提起^第 4 个乳腺，然后用惯用手插入 27 G 注射器针头，确保针头的斜面朝上。将 50 μL 含有细胞-PBS-基底膜基质溶液混合物的细胞悬液缓慢注入乳腺脂肪垫中。
   注意：注射细胞时，手指之间应感觉到气泡。检查注射部位是否有任何泄漏。
5. 注射完成后，关闭异氟醚，将小鼠的鼻子保持在鼻锥中以吸入氧气并恢复意识（这大约需要一分钟）。将鼠标放回加热垫上的笼子中，以实现最佳恢复效果。
6. 对于肩部注射，请使用上述 IMF 注射概述的程序，唯一的区别是细胞注射的位置。
   注意：或者，可以在没有麻醉的情况下完成肩部注射（参见下面的步骤 2.7）。
7. 对于无麻醉的肩部注射，用拇指和食指之间的非惯用手握住并提起小鼠肩膀上的皮肤，在皮肤上形成一个“帐篷”。使用 27 G 注射器针头缓慢注入 50 μL 含有细胞-PBS-基底膜基质溶液的细胞悬液。轻轻拔出针头并检查是否有泄漏。
   注意：作为替代方案，Hamilton 注射器可用于小容量注射，以确保体积输送的准确性。在两次注射之间，当使用不同的细胞系时，使用 80% v/v 乙醇冲洗注射器，使用 PBS 冲洗和去除注射器中残留的乙醇。

3. 雌二醇溶液的制备

1. 使用可以准确测量物质毫克数的秤，称取 7 mg 雌二醇粉末放入 1.5 mL 试管中。
2. 将 700 μL 100% 乙醇加入 7 mg 雌二醇粉末中。将 1.5 mL 试管在室温 （RT） 下放在温和的摇床上约 1 小时，或直到雌二醇粉末完全溶解。
3. 将溶液分装到 10 个 1.5 mL 试管中，每个试管含有 70 μL 乙醇-雌二醇溶液。将试管置于-20°C以备将来使用。
   注意：雌二醇 - 乙醇原液可在-20°C下保存约2周。

4. 皮下注射雌二醇溶液

1. 在需要注射雌二醇的当天，新鲜配制以下混合物。将 630 μL 玉米油作为载体混合到含有 70 μL 乙醇-雌二醇溶液的 1.5 mL 试管中。涡旋溶液直至均匀，确保乙醇不会分离并在车油顶部形成一层。
   注：可得到 700 μL 的 20 μg/20 μL 玉米油：乙醇，9：1 溶液。每只小鼠接受 20 μL 此溶液。始终制备额外的溶液，因为混合物中的油由于其粘度而容易粘附在注射器外部和 1.5 mL 试管的侧面（例如，对于 20 只小鼠，尽管 400 μL 就足够了，但几乎翻倍的量 （700 μL） 提供了足够的错误空间）。
2. 使用连接到胰岛素注射器的 29 G 针头，缓慢吸取 20 μL 雌二醇溶液。
   注意：由于溶液中含有 9 份油和 1 份雌二醇-乙醇，因此混合物需要时间才能吸入注射器。
3. 注射雌二醇溶液的小鼠是那些携带表达 ERα 的肿瘤的小鼠，因此依赖雌激素生长（本研究中为 MCF-7）。携带不表达 ERα （本研究中为 MDA-MB-231） 的肿瘤的小鼠不接受雌二醇溶液。将要注射的鼠标轻轻放在前面，最好放在毛巾上，以防止在束缚时伤到它的四肢。
4. 使用非惯用手，将鼠标尾巴的上半部分夹在无名指和小指之间，以约束鼠标。用拇指和食指提起小鼠颈部附近松弛的皮肤，在皮肤上形成一个“帐篷”，用于皮下注射雌二醇溶液。
5. 在保持鼠标处于这种约束状态的同时，用惯用手向小鼠注射雌二醇溶液。将针头的斜面朝上，将针头推到皮肤的“帐篷”下，直到看到针头的一半以下。
   注意：注射溶液时，皮肤应明显膨胀。
6. 为防止溶液回流，请将针头放在皮肤下几秒钟。如果发生任何回流，请用纸巾轻轻拍干该区域以去除残留溶液。
   注意：在一些实验中，雌二醇与芝麻油的组合被用来施用激素。使用芝麻油作为载体会导致雌二醇注射部位的皮下局部炎症。因此，选择玉米油作为后续实验的载体，其中雌二醇注射部位的炎症迹象不存在或很少²²。有关更多详细信息，请参阅讨论。
7. 取下针头后，用棉签用局部消毒剂轻轻擦拭注射部位。这是为了防止由于针头穿过小鼠皮肤插入/移除而导致注射部位表面发炎。
8. 在细胞注射前 3 天皮下注射雌二醇注射携带携带 ERα （MCF-7） 的肿瘤的小鼠，然后每周注射 5 次，持续 5 周（图 1）。在成像前 2 天停止雌二醇注射，以避免与 ¹⁸F-FES 探针与其靶标 ERα 的竞争性结合。
   注意：在这项研究中，携带 MCF-7 肿瘤的小鼠从周一至周五每天注射雌二醇。如果要在下周的星期三对他们进行成像，那么雌二醇注射将在周六和周日继续进行。在周三对小鼠进行成像之前，周一和周二未给予雌二醇。

5. 卵巢切除小鼠的 ¹⁸F-FES PET 和 MRI 成像

注意： 处理放射性时，请使用防护设备。处理放射性时，请遵循所有适用的监管程序。

1. 称量鼠标并记录其重量。
2. 在这项研究中，合成了 ¹⁸种 F-FES，并以临床等级²³（从奥斯汀健康分子影像和治疗系获得）配制，用于动物模型。在 10% w/v 乙醇盐水溶液中以约 150-300 μCi/100 μL 的调整衰变校正注射浓度稀释 ¹⁸个 F-FES（109 分钟放射性半衰期）。
   注：1000 Ci/mmol 的比活性足以对 ERα²⁴ 进行体内 PET 成像，并且接收到的 ¹⁸个 F-FES 的比活性高于该基线值。
3. 用带有 29 G 针头的胰岛素注射器吸取 100 μL。使用剂量校准器测量和记录放射性剂量和时间。将注射器放在铅盾后面，直到注射时。
   注意：用剂量校准器测量每个剂量中 ¹⁸个 F-FES 放射性的量。剂量校准品应根据制造商的方案，根据标准参考物质（如铯 137）进行校准。记录读数的时间对于确定衰减校正很重要。确保校准器上显示的时间与用于 PET 采集的计算机上的时间相匹配。
4. 为了扩张尾静脉以进行静脉注射，请将鼠标置于 30 厘米距离的加热元件下 2 分钟。注射前用 70% w/v 乙醇擦拭尾巴以消毒该区域。
5. 通过侧尾静脉推注注射 100 μL ¹⁸F-FES（注射器中的整个体积），并记录注射时间。用纸巾按压注射部位以阻止尾静脉出血。
6. 使用剂量校准器测量注射器和组织中的剩余剂量，并记录测量值和时间。以 2 个为一组交错注射小鼠，以允许使用多腔室进行成像。
   注意：注射器中会留下一些探针。使用胰岛素注射器比通过鲁尔锁连接到针头的注射器更可取，因为注射后注射器/针头中的剂量体积减少。此外，还测量了用于阻止静脉注射探针后可能发生的任何出血的组织中的放射性。这是因为组织吸收的血液回流可能含有来自 ¹⁸F-FES 的一些放射性。此外，加热侧尾静脉所需的时间将取决于热源的强度和它与小鼠的距离等变量。对于标准加热灯，静脉扩张可能需要长达 15 分钟的时间。必须密切监测小鼠是否有过热的迹象，并在需要时在两次注射之间从加热源中取出。
7. 对于注射后分配至睡眠状态的小鼠，将注射的小鼠置于麻醉室中，在异氟醚 （2%-2.5%） 和氧气 （2 L/min） 的维持水平下在加热垫上放置 1 小时，以允许探针在 PET 扫描之前通过小鼠的体循环分布。让组中的其他小鼠在笼子里自由行走 1-1.5 小时，直到 PET 扫描。
8. 1-1.5 小时后，在鼻锥异氟醚麻醉下将小鼠置于成像室中。将床加热器打开至 32 °C，选择多腔室设置并打开呼吸监测系统。将两只要成像的小鼠置于俯卧位。将成像室放入 PET/MRI 机器中。
9. 在整个图像采集过程中监测鼠标的呼吸。使用呼吸图表确保在扫描期间的任何给定时间每分钟呼吸 60-80 次。如果呼吸频率低于或高于所需范围，请根据需要调整异氟醚剂量。
   注意：由于成像室中存在传感器，因此可以监测动物的呼吸。
10. 将静态 15 分钟 PET 采集与梯度回波 （GRE） 3D 轴向 MRI 扫描配对。有关采集参数，请参见下文：
    1. 要设置 PET 方案，请在相关软件中打开 Radiopharmaceutical Editor 窗口。指定正在使用的同位素、注射器活性 （MBq）、注射时间和应用活性 （MBq） 以及体重。所有这些参数对于帮助计算和量化探针在目标组织中的摄取至关重要。
    2. 为确保鼠标正确定位以进行成像，请使用 2D Scout（前后）序列来确定 PET 视野。使用 400-600 keV 的能量窗口，1-5、5 ns 的符合模式进行 15 分钟的静态 PET 采集。在此之后进行大约 27 分钟的 GRE3D 轴向 MRI 扫描。
11. 使用相关软件重建采集的图像。
    1. 对 PET/MRI 图像进行静态重建，并使用几何规划器修改重建区域，以确保它覆盖整个小鼠，确保最佳重建时间。
    2. 在 Results Identification （结果识别） 窗口下，将 random corrections（随机校正）、 衰减校正 （AC） + scatter（衰减校正 （AC） + scatter）、位置范围 （Position range）切换为 On（开）。将 衰减参考时间 设置为 ADMIN。将 body-air 阈值 设置为 30%，并根据材质贴图进行衰减校正。
12. 使用相关软件分离多腔室图像、共配准和绘制感兴趣区域 （ROI）。对于共同配准，重新对齐 MRI 以适合 PET，并重建 PET 图像。
13. 要分离多室图像，请单击 Image Processing > Segmentation > Hotel Separator。打开 Scientific 模式 并根据需要调整阈值和音量参数，直到找到 2 个对象。
14. 在考虑注射器中剩余的任何残留剂量后，输入注射时的剂量，将 PET 数据转换为每克注射剂量百分比 （%ID/g） 的单位，或者另外输入受试者的体重，将 PET 数据转换为标准化摄取值 （SUV） 的单位。通过右键单击 PET 数据集并在 Basic Info 选项卡上找到 %ID/g 字段来执行此转换。输入之前记录的 %ID/g。
15. 要在肿瘤切片上绘制 ROI，请单击程序窗口左侧的 Measurements 选项卡。使用 多边形 或 手绘 工具绘制 ROI。小心地画出肿瘤的圆周，确保在 PET 图像处于活动窗口中时执行该作（使用 Fn-A 检查）。结果给出的 ROI 值为 %ID/g。
    注：ROI 分析对 %ID/g 给出了很好的估计值。与 离体 生物分布数据相比，校准良好的相机应提供 ±5% 的准确率。

6. 采集和固定肿瘤组织用于免疫组化

1. 在实验终点，使用 4%-5% 的异氟醚致死或过量吸入 CO₂ 对小鼠实施安乐死。
2. 使用手术剪刀和镊子，小心地在肿瘤表面附近切开一个小切口，然后切除肿瘤组织。如果皮肤附着在肿瘤组织上，请使用手术刀刀片轻轻地将皮肤与肿瘤分离。
3. 将肿瘤组织放入含有约 3 mL 10% 中性缓冲福尔马林的 5 mL 小瓶中。确保整个组织都被溶液覆盖，以促进组织固定。将组织浸没在福尔马林中 24 小时。
4. 第二天，将固定的肿瘤组织转移到含有 70% 乙醇的 5 mL 小瓶中。标记对肿瘤组织具有特异性的组织盒，以准备石蜡包埋。
5. 将肿瘤组织放入组织盒中，并将其储存在 70% 乙醇溶液中，直至石蜡包埋。
   注意：在这项研究中，石蜡包埋由 Austin Health 的解剖病理学家进行。

7. 免疫组化检测雌激素受体 α （ERα）

1. 使用切片机，按照标准程序切割染色所需的 4 μm 厚的肿瘤组织切片。
2. 将带有切割肿瘤切片的玻璃显微镜载玻片放入载玻片架中，并将架子放入 37 °C 的烘箱中干燥过夜，并确保组织在染色前粘附在载玻片上。
3. 第二天早上，将装有切割肿瘤切片的载玻片的架子放入60°C的烘箱中30分钟，以促进脱蜡过程。
   注意：烘烤时载玻片应朝上。这确保了组织的粘附性，并且任何熔化的蜡都会熔化到自己的玻片上，而不是相邻的玻片上。
4. 要对切片进行再水化，请将烘烤后的切片浸入二甲苯中两次，每次 5 分钟（2x 5 分钟）100% 乙醇 2 x 5 分钟，然后 70% 乙醇 1 x 5 分钟。在蒸馏水中洗涤玻片 5 分钟。
5. 对于抗原修复，将载玻片浸入装有 1x EDTA 缓冲液 （pH 8） 的容器中，在 100 °C 水浴中浸泡 25-30 分钟。从水浴中取出载玻片，让载玻片在 RT 下静置至少 1 小时。玻片冷却后，在流动的自来水中洗涤 2 分钟，然后用 TBST（含 0.01% Tween20 的 TBS）洗涤 2x 5 分钟。
6. 使用疏水屏障笔，在幻灯片上的部分周围画一个圆圈。
7. 在室温下将大约 100 μL 的 3% H₂O₂ 溶液（用蒸馏水稀释）放在切片上 10 分钟，淬灭内源性过氧化物酶。在流动的自来水中洗涤玻片 2 分钟，然后 TBST 2 x 5 分钟。
8. 在 RT 下用大约 100 μL/切片的封闭缓冲液（TBST 中的 5% 牛血清白蛋白 （BSA））封闭切片 30 分钟。
9. 将多余的溶液轻轻弹入孵育盘中，沥干封闭缓冲液。以 1：300 的稀释度（或以对所用抗体具有特异性的最佳预定稀释度）向切片中加入大约 100 μL 一抗（兔子中产生的人抗 ERα）。在 1% BSA TBST 中配制抗体稀释液，并将载玻片与 4 °C 抗体一起孵育过夜。
   注意：孵育盘底部应装满水，以确保切片不会在一夜之间干燥。
10. 第二天早上，用 TBST 洗涤载玻片 3x 5 分钟。在切片上加入大约 100 μL 的抗兔二抗，并在室温下放置 45 分钟。用 TBST 洗涤载玻片 3x 5 分钟。
11. 在通风橱中，向切片上加入约 100 μL 的 3,3'-二氨基联苯胺 （DAB） 试剂，并将溶液在每个切片上保持约 3 分钟。通过用流动的自来水洗涤玻片 10 分钟来抑制 DAB 反应。
12. 用苏木精对载玻片进行复染 1 分钟，然后用流动的自来水冲洗 2 分钟。将玻片浸入 Scott 水中 1 分钟，然后用流动的自来水再冲洗 2 分钟。
13. 要脱水切片，请将切片浸入 70% 乙醇中 2 分钟，100% 乙醇中 2 x 2 分钟，然后二甲苯 2 x 2 分钟。
14. 在通风橱中，小心地将切片安装在邻苯二甲酸二丁酯聚苯乙烯 （DPX） 中，并在切片上盖上盖玻片，确保气泡不会滞留在目标组织上。将载玻片在通风橱中晾干过夜。
15. 第二天，使用玻片扫描仪捕获图像并可视化染色。

结果

为了确定使用 ¹⁸个 F-FES PET 可以清晰显示 ERα 阳性肿瘤的位置，本研究使用了三组去卵巢小鼠（图 1）。两组小鼠注射 MCF-7 细胞 - ERα 阳性乳腺癌细胞系 - IMF 或肩部。作为阴性对照，另一组小鼠注射了 MDA-MB-231 细胞，这是一种常用的不表达 ERα 的三阴性乳腺癌细胞系（图 1）。概述本研究工作流程的图表强调了皮下注射...

讨论

在这里，我们描述了 ¹⁸F-FES PET/MRI 在检测以 ERα 表达为特征的乳腺肿瘤中的效用。例如，我们证明可以可视化 ERα 阳性肿瘤的一个位置是在小鼠的肩部 - 与位于^{第 4 个}腹股沟乳腺脂肪垫内的肿瘤相比，这些肿瘤可以通过 ¹⁸个 F-FES 摄取清楚地识别（图 4）。¹⁸F-FES 摄取在 MDA-MB-231 肿瘤中不可见，证实其缺乏 ERα 表达，使...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
27 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringe	Terumo	SS*05M2713KA	For cell injections
29 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringe	Terumo	SS*05M2913KA	For estradiol injections
30% H2O2	Chem-Supply	HA154	Diluted to a 3% working solution with distilled water
Corn oil	Sigma	C8267
DAB Substrate Kit	Abcam	ab64238
Dako anti-rabbit-HRP, 110 mL	Aligent-Dako	K4003	Secondary antibody used for IHC
DMEM/F-12 Medium	Gibco	11320033
Dose calibrator	Capintec	5130-3216
Estradiol	Sigma	E2758
Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	#8644	Primary antibody used for IHC
FBS	Bovogen	SFBS
Heat element (Infra Red Lamp)	Amcal	12400	For tail vein dilation
Matrigel	Corning	356225
MultiCell 4 Channel Monitoring kit for triple- or quadruple-mouse imaging chamber	Mediso	PR-MC900200	For monitoring of mouse respiration
NanoScan PET/MRI 3T System	Mediso	PR-RD000000	For PET/MRI acquistion
PBS (1x)	Gibco	14190-144
TBST	ThermoFisher	#28360	Wash buffer for IHC
Three mice imaging chamber	Mediso	PR-MC407300	For PET/MRI acquistion