Verwendung von 16α-[18F]-Fluor-17β-Estradiol PET zur Visualisierung der Östrogenrezeptor-α Expression in menschlichen Brustkrebs-Xenotransplantaten bei weiblichen ovariektomierten Mäusen

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Verwendung der 16α-[18F]-Fluor-17β-Estradiol (¹⁸F-FES) Positronenemissionstomographie (PET) als Werkzeug zur Visualisierung der ERα-Expression in ERα-positiven Brust-Xenotransplantaten.

Zusammenfassung

Um zu zeigen, wie Östrogenrezeptor-alpha (ERα)-positive Brustkrebs-Xenotransplantate in BALB/c-Nacktmäusen mittels 16α-[18F]-Fluor-17β-Östradiol (¹⁸F-FES) Positronenemissionstomographie (PET) sichtbar gemacht werden können, wurden ovariektomierten BALB/c-Nacktmäusen ERα-positive Brustkrebszellen (MCF-7, 3 × 10⁶ Zellen; Schulter [n = 10] oder 4. leistendes Brustfettpolster [n = 10]) oder ERα-negative Brustkrebszellen (MDA-MB-231, 1 × 10⁶ Zellen; Brustfettpolster [n = 5]). Mäuse, die MCF-7-Zellen beherbergten, erhielten 2 Tage vor der Zellinjektion subkutane Injektionen von 20 μg 17β-Östradiol (20 μg/20 μl; Maisöl: Ethanol, 9:1) in den Nacken, gefolgt von täglichen Injektionen fünfmal pro Woche für 5 Wochen. Die Messung des Tumorvolumens erfolgte nach der Formel: (L*W²)/2 (L; Länge, W; Breite). Sobald das Tumorvolumen etwa 100 mm³ erreichte, wurden die 17β-Östradiol-Injektionen 2 Tage vor der Behandlung von ¹⁸F-FES für die PET-Bildgebung gestoppt, um eine kompetitive Bindung an ERα zu vermeiden. Nach Verabreichung von ¹⁸F-FES über die Vena tail lateralis wurde eine PET/MRT für 15 Minuten von 1 h bis 1,5 h nach der Injektion durchgeführt. ¹⁸Bei ERα-negativen, MDA-MB-231 tumortragenden Mäusen wurde keine F-FES-Aufnahme beobachtet. ¹⁸Die F-FES-Aufnahme war bei Mäusen mit MCF-7-Tumoren in der Schulter am ausgeprägtesten. In MCF-7-Tumoren, die in das leistenale Brustfettpolster gezüchtet wurden, war die Aufnahme von ¹⁸F-FES weniger sichtbar, da das intestinale Ausscheidungsmuster von ¹⁸F-FES die in diesen Tumoren nachweisbare Radioaktivität verdeckte. Um ¹⁸F-FES PET als Werkzeug zur Visualisierung der ERα-Expression in ERα-positiven Brust-Xenotransplantaten zu verwenden, zeigen wir, dass die Sichtbarkeit der ¹⁸F-FES-Aufnahme in Tumoren, die sich abseits der Bauchregion von Mäusen befinden, wie z.B. in der Schulter, deutlich ist.

Einleitung

Brustkrebs (BC) kann in verschiedene molekulare Subtypen eingeteilt werden¹. Brusttumoren, die als luminaler Subtyp klassifiziert werden, exprimieren den Östrogenrezeptor alpha (ERα). Daher wird dieser Subtyp des BC auch als ERα-positiv (ERα⁺) bezeichnet. Glücklicherweise haben diejenigen, bei denen ERα⁺ BC diagnostiziert wurde, das höchste 10-Jahres-Überleben in Verbindung mit niedrigen Raten von Fernmetastasen ^2,3. Aufgrund der ERα-Expression haben solche Patienten Zugang zu einer Reihe von Hormontherapieoptionen, einschließlich selektiver Östrogenrezeptormodulatoren (SERMs), Antiöstrogenmedikamenten und Aromatasehemmern⁴.

Um zu beurteilen, ob eine Brustkrebspatientin für eine Hormontherapie in Frage kommt, müssen die Expressionsniveaus von ERα in Brusttumoren bestimmt werden ^5,6,7. Während der Goldstandard für Tests mit immunhistochemischen (IHC) Methoden durchgeführt wird, heben viele Berichte das Problem sowohl der Reproduzierbarkeit als auch der Zuverlässigkeit der erzielten Ergebnisse hervor ^6,8,9. IHC kann zu Diskordanz des Ergebnisses führen, da es sich um eine semiquantitative Technik handelt, bei der Unterschiede in der Gewebeverarbeitung und der anschließenden Interpretation zu Variabilität führen können⁶. Um dieses wiederkehrende Problem zu beheben, wurden 2010 Richtlinien festgelegt, die 2020 von der American Society of Clinical Oncology aktualisiert wurden, um die Variation zwischen den Beobachtern zu reduzieren¹⁰. Derzeit liegt der klinisch validierte Cut-off-Wert bei ≥1%, wobei die ERα-Expression selbst bei sehr kleinen Expressionsniveaus einen klinisch bedeutsamen Nutzen mit endokriner Therapie zeigt¹¹.

Bei fortgeschrittener BC kann sich die ERα-Expression zwischen Metastasen und Primärtumor unterscheiden. Einige Beobachtungen berichten von einer Diskrepanz von 18 % bis 55 % in der ERα-Expression zwischen metastasierten Läsionen und dem Primärtumor, was darauf hinweist, wie wichtig es ist, den ERα-Status von BC-Metastasen zu bestimmen¹². Um dies anzugehen, betonen die Leitlinien, wie wichtig es ist, den Hormonrezeptorstatus bei metastasierten Läsionen zu bestätigen, um fundierte Behandlungspläne zu erstellen^13,14. Die Machbarkeit ist jedoch fraglich, insbesondere durch IHC-Methoden, wenn man bedenkt, dass Metastasen an Stellen vorhanden sein können, von denen nur schwer Biopsien entnommen werden können.

Molekulare Bildgebungsverfahren haben sich zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die Erkennung und Visualisierung von Tumorläsionen bei Krebspatienten entwickelt. Insbesondere die Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung erfordert die Verwendung von Tracern oder genauer gesagt von Radiopharmazeutika, die dazu bestimmt sind, bestimmte Merkmale von Tumoren auszunutzen, um diese Läsionen nicht-invasiv sichtbar zu machen. Der in der Onkologie am häufigsten verwendete PET-Tracer ist ¹⁸F-Fluordesoxyglucose (¹⁸F-FDG)¹⁵. In dieser Studie untersuchen wir die Verwendung einer radioaktiv markierten Form von Östradiol, ¹⁸F-Fluorestradiol (¹⁸F-FES). Östradiol - ein Ligand für ERα - ist ein Hormon, das bei Frauen überwiegend von den Eierstöcken produziert^{wird 16}. ¹⁸F-FES hat kürzlich die Zulassung von der Food and Drug Administration (FDA) erhalten und wird unter dem Namen Cerianna^TM vermarktet. Dieses bildgebende Mittel wurde entwickelt, um als Ergänzung zu Biopsien bei Patienten mit rezidivierendem oder metastasiertem BC¹⁷ verwendet zu werden. Die Ganzkörper-PET-Bildgebung mit ¹⁸F-FES kann als nicht-invasive Methode zum Nachweis von ERα-Spiegeln sowohl im Primärtumor als auch in Fernmetastasen in Regionen eingesetzt werden, aus denen Biopsien schwer zu gewinnen sind¹⁸. Die Vorhersage der ERα-Spiegel mittels ¹⁸F-FES PET-Bildgebung korreliert mit den IHC-Ergebnissen, und darüber hinaus ist ein geringer bis gar kein Nachweis von ERα mittels ¹⁸F-FES PET-Bildgebung ein zuverlässiger Prädiktor für Tumore, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie auf eine Hormontherapie ansprechen¹⁸. Um den sachgerechten Einsatz von ¹⁸F-FES in der Klinik zu gewährleisten, wurden im Konsens von Experten auf diesem Gebiet Leitlinien formuliert¹⁹. In dieser Studie untersuchen wir die Verwendung von ¹⁸F-FES PET in präklinischen Modellen von Brustkrebs bei Mäusen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission des Austin Hospital (A2023/05812) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke durchgeführt.

1. Vorbereitung der Zellen

1. Halten Sie MDA-MB-231- und MCF-7-Zellen in DMEM/F-12, die mit Penicillin/Streptomycin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in T175-Gewebekulturflaschen ergänzt wurden, unter Verwendung routinemäßiger Zellkulturverfahren aufrecht. Vor der Vorbereitung der Zellen für die Injektion die Passagezellen mindestens 3x nach der Wiederbelebung aus den Flüssigstickstoffspeichern durchführen. Züchten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
2. Vermehren Sie die Zellen so, dass am Tag der Vorbereitung der Zellen für die Injektion 3 × 10⁶ MCF-7-Zellen pro Injektion pro Maus für 15 Mäuse (d. h. mindestens 45 × 10⁶ MCF-7-Zellen) und 1 × 10⁶ MDA-MB-231 Zellen pro Injektion pro Maus für 5 Mäuse (d. h. mindestens 5 × 10⁶ MDA-MB-231-Zellen) vorhanden sind.
   HINWEIS: Um eine gleiche Anzahl von Zellen in jeder Maus zuzulassen, bereiten Sie genügend Zellen für fünf zusätzliche Injektionen vor (bereiten Sie z. B. genügend Zellen für 10 Injektionen für die Injektion von fünf Mäusen vor).
3. Am Tag der Zellinjektion entfernen Sie das Medium aus allen Kolben und geben Sie etwa 5 ml Trypsin-EDTA (0,25 % Trypsin und 0,05 % EDTA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) auf die Zellen, um die Zellablösung zu erleichtern.
4. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, werden etwa 10 ml des vollständigen Mediums in Kolben gegeben, um die Trypsinaktivität zu hemmen. Resuspendieren Sie die Zellen und überführen Sie die einzellige Suspension in ein 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei ~300 × g für 2 min die Pelletzellen.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Medienvolumen und zählen Sie die Zellen, um die Gesamtzahl der geernteten Zellen zu bestimmen.
   HINWEIS: Versuchen Sie, Lösungen von etwa 1 × 10⁶ Zellen pro ml zu zählen (50-100 Zellen pro 16 Quadrate, wenn eine Zählkammer verwendet wird). Bei Zellen, die bei 5 × 10⁶ pro Vollkolben wachsen, sind die Zellen in 5 ml Medium zu ernten. Für Zelllinien mit höherer Dichte verwenden Sie 10 ml Medium pro Kolben.
6. Führen Sie diesen Schritt auf Eis in einem sterilen Laminar-Flow-Schrank durch. Sobald diese Zahl erreicht ist, zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut bei 300 × g für 2 min, um Zellen zu pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet in kalter PBS- und eiskalter Basalmembran-Matrixlösung, so dass pro 3 ×^{10 6} MCF-7-Zellen 40 μl PBS und 10 μl Basalmembran-Matrixlösung vorhanden sind.
7. Resuspendieren Sie das MDA-MB-231-Zellpellet mit den gleichen Bestandteilen, so dass pro 1 × 10⁶ Zellen 40 μl PBS und 10 μl Basalmembran-Matrixlösung vorhanden sind. Übertragen Sie die Zell-PBS-Basalmembran-Matrix-Mischung aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer kalten Pipettenspitze in kleinere 1,5-ml-Röhrchen und halten Sie die Zellmischung kurz vor der Zellinjektion in Mäuse auf Eis.
   HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete Basalmembranmatrix wird bei -20 °C gelagert. Am Tag bevor die Basalmembran-Matrix-Lösung benötigt wird, wird ein Aliquot der Lösung bei 4 °C zum Auftauen über Nacht gegeben. Am nächsten Tag ist es bei kalten Temperaturen (auf Eis) einsatzbereit. Achten Sie beim Pipettieren der Lösung darauf, dass die verwendeten Pipettenspitzen kalt sind, um zu verhindern, dass sich die Basalmembranmatrixlösung verfestigt. Es empfiehlt sich, eine Schachtel mit sterilen Pipettenspitzen vor dem Tag der Zellvorbereitung für die Injektion im Kühlschrank aufzubewahren. Bei der Resuspendierung des Zellpellets in eiskaltem PBS und Basalmembran-Matrixlösung wird zuerst PBS zugegeben, gefolgt von der erforderlichen Menge Basalmembran-Matrixlösung.

2. Zellinjektion in ovariektomierte Mäuse

1. Lassen Sie 6-8 Wochen alte weibliche ovariektomierte BALB/c-Nacktmäuse mindestens 1 Woche lang in der Tierhaltungseinrichtung akklimatisieren, bevor Sie die Zellen injizieren.
   HINWEIS: Diese Studie hatte Zugang zu älteren, 12-14 Wochen alten Mäusen. Die Ovariektomie sorgt für einen niedrigen endogenen Östradiolspiegel und reduziert die Konkurrenz mit dem ¹⁸F-FES-Liganden. Abhängig vom untersuchten Modell müssen sich jüngere Mäuse (z. B. 4-8 Wochen) aufgrund des niedrigeren endogenen Östradiolspiegels möglicherweise keiner Ovariektomie unterziehen^20,21.
2. Induzieren Sie eine Anästhesie bei einer Maus mit 4 % Isofluran und Sauerstoff mit einer Geschwindigkeit von 4 l/min unter Verwendung einer Anästhesie-Induktionskammer. Beobachten Sie die Maus und prüfen Sie, ob der Aufrichtreflex verloren geht. Sobald sie sich nicht mehr bewegen, bringen Sie die Maus in einen sterilen Laminar-Flow-Schrank, setzen Sie die Schnauze in die Nasenmaske ein und halten Sie die Narkose aufrecht, indem Sie das Isofluran auf 2 % und den Sauerstoffgehalt auf eine Rate von 2 l/min einstellen.
   HINWEIS: Betäuben Sie jeweils eine Maus, um eine optimale Pflege zu gewährleisten.
3. Bei intramammären Fettpolster-Injektionen (IMF) tupfen Sie die Haut über die 4^. Leistendrüse der Brust mit Alkohol ab. Verwenden Sie eine vorgekühlte (auf Eis) 27-G-Spritze, um die Kaltzellensuspension aufzuziehen, und lassen Sie die Spritze auf Eis, um eine Erwärmung/Verfestigung der Basalmembranmatrixlösung vor der Injektion zu verhindern.
4. Heben Sie mit Daumen und Zeigefinger der nicht-dominanten Hand vorsichtig die 4^. Brustdrüse an und führen Sie mit der dominanten Hand eine 27-G-Spritzennadel ein, wobei Sie darauf achten, dass die Abschrägung der Nadel nach oben zeigt. Injizieren Sie langsam 50 μl der Zellsuspension, die das Zell-PBS-Basalmembranmatrix-Lösungsgemisch enthält, in das Brustfettpolster.
   HINWEIS: Beim Injizieren der Zellen sollte eine Blase zwischen den Fingern zu spüren sein. Überprüfen Sie, ob die Injektionsstelle undicht ist.
5. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, schalten Sie das Isofluran aus und halten Sie die Schnauze der Maus im Nasenkegel, um Sauerstoff einzuatmen und das Bewusstsein wiederzuerlangen (dies sollte etwa eine Minute dauern). Legen Sie die Maus wieder in einen Käfig auf einem Wärmekissen, um eine optimale Erholung zu gewährleisten.
6. Verwenden Sie für Schulterinjektionen das oben beschriebene Verfahren für die IMF-Injektion, der einzige Unterschied besteht in der Lokalisation der Zellinjektion.
   HINWEIS: Alternativ kann die Schulterinjektion ohne Anästhesie durchgeführt werden (siehe Schritt 2.7 unten).
7. Für die Schulterinjektion ohne Anästhesie halten und heben Sie die Haut mit der nicht dominanten Hand zwischen Daumen und Zeigefinger über die Schulter der Maus, so dass ein "Zelt" in der Haut entsteht. Injizieren Sie langsam 50 μl Zellsuspension, die die Zell-PBS-Basalmembran-Matrixlösung enthält, mit einer 27-G-Spritzennadel. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück und prüfen Sie, ob sie undicht ist.
   HINWEIS: Alternativ kann eine Hamilton-Spritze für kleinvolumige Injektionen verwendet werden, um die Genauigkeit der Volumenabgabe zu gewährleisten. Zwischen den Injektionen wird 80 % v/v Ethanol verwendet, um die Spritze zu spülen, wenn verschiedene Zelllinien verwendet werden, und PBS wird verwendet, um Ethanolreste aus der Spritze zu spülen und zu entfernen.

3. Herstellung der Östradiollösung

1. Wiegen Sie mit einer Waage, die Milligramm einer Substanz genau messen kann, 7 mg Östradiolpulver in ein 1,5-ml-Röhrchen ab.
2. 700 μl 100%iges Ethanol in 7 mg Östradiolpulver geben. Legen Sie das 1,5-ml-Röhrchen für ca. 1 h bei Raumtemperatur (RT) auf einen sanften Schüttler oder bis sich das Östradiolpulver vollständig aufgelöst hat.
3. Aliquotieren Sie die Lösung auf zehn 1,5-ml-Röhrchen, die jeweils 70 μl Ethanol-Östradiol-Lösung enthalten. Stellen Sie die Röhrchen für die zukünftige Verwendung bei -20 °C auf.
   HINWEIS: Estradiol-Ethanol-Vorräte können ca. 2 Wochen bei -20 °C gelagert werden.

4. Subkutane Injektion von Östradiollösung

1. An dem Tag, an dem eine Östradiol-Injektion erforderlich ist, stellen Sie die folgende Mischung frisch auf. Kombinieren Sie 630 μl Maisöl als Vehikel in das 1,5-ml-Röhrchen mit 70 μl der Ethanol-Östradiol-Lösung. Reiben Sie die Lösung, bis sie homogen ist, und stellen Sie sicher, dass sich das Ethanol nicht abtrennt und eine Schicht an der Oberseite des Fahrzeugöls bildet.
   HINWEIS: Dies ergibt 700 μl einer 20 μg/20 μl Maisöl:Ethanol, 9:1-Lösung. Jede Maus erhält 20 μl dieser Lösung. Stellen Sie immer eine zusätzliche Lösung her, da das Öl in der Mischung aufgrund seiner Viskosität dazu neigt, an der Außenseite der Spritze und an den Seiten eines 1,5-ml-Röhrchens zu haften (z. B. für 20 Mäuse, obwohl 400 μl ausreichen würden, bietet eine fast doppelte Menge (700 μl) genügend Spielraum für Fehler).
2. Mit einer 29-g-Nadel, die an einer Insulinspritze befestigt ist, langsam 20 μl Östradiollösung aufziehen.
   HINWEIS: Da die Lösung 9 Teile Öl auf 1 Teil Östradiol-Ethanol enthält, dauert es einige Zeit, bis das Gemisch in die Spritze eingezogen ist.
3. Mäuse, denen Östradiollösung injiziert werden soll, sind solche, die Tumore beherbergen, die ERα exprimieren und daher auf Östrogen angewiesen sind, um zu wachsen (MCF-7 in dieser Studie). Mäuse mit Tumoren, die kein ERα (MDA-MB-231 in dieser Studie) exprimieren, erhalten keine Östradiollösung. Positionieren Sie die zu injizierende Maus vorsichtig vorne, vorzugsweise auf einem Handtuch, um zu vermeiden, dass sich die Gliedmaßen beim Festhalten verletzen.
4. Halten Sie die Maus mit der nicht dominanten Hand fest, indem Sie den oberen Teil ihres Schwanzes zwischen Ringfinger und kleinem Finger halten. Heben Sie mit Daumen und Zeigefinger die lose Haut in der Nähe des Maushalses an, um ein "Zelt" in der Haut für die subkutane Injektion der Östradiollösung zu bilden.
5. Während Sie die Maus in dieser Fessel halten, injizieren Sie der Maus mit der dominanten Hand die Östradiollösung. Schieben Sie die Nadel mit der Fase nach oben unter das "Zelt" der Haut, bis weniger als die Hälfte der Nadel sichtbar ist.
   HINWEIS: Wenn die Lösung injiziert wird, sollte sich die Haut sichtbar aufblähen.
6. Um einen Rückfluss der Lösung zu verhindern, halten Sie die Nadel einige Sekunden lang unter der Haut. Wenn ein Rückfluss auftritt, tupfen Sie den Bereich vorsichtig mit einem Taschentuch trocken, um die restliche Lösung zu entfernen.
   HINWEIS: In einigen Experimenten wurde Östradiol in Kombination mit Sesamöl verwendet, um das Hormon zu verabreichen. Die Verwendung von Sesamöl als Vehikel führt zu lokalen Entzündungen unter der Haut an den Stellen der Östradiolinjektion. Daher wurde Maisöl als Vehikel für nachfolgende Experimente gewählt, in denen Anzeichen einer Entzündung an den Stellen der Östradiolinjektion nicht oder nur minimal waren²². Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion.
7. Nachdem Sie die Nadel entfernt haben, tupfen Sie die Injektionsstelle vorsichtig mit einem Wattestäbchen mit einem topischen Antiseptikum ab. Dies dient dazu, Entzündungen an der Oberfläche an der Injektionsstelle aufgrund des Einführens/Entfernens der Nadel durch die Haut der Maus zu verhindern.
8. Injektion von Östradiol-Injektionen an Mäuse, die Tumore beherbergen, die ERα (MCF-7) exprimieren, subkutan 3 Tage vor der Zellinjektion, gefolgt von 5 Mal pro Woche für 5 Wochen (Abbildung 1). Stoppen Sie die Östradiol-Injektionen 2 Tage vor dem Tag der Bildgebung, um eine kompetitive Bindung mit der ¹⁸F-FES-Sonde an ihr Ziel, ERα, zu vermeiden.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde Mäusen mit MCF-7-Tumoren täglich von Montag bis Freitag Östradiol injiziert. Wenn sie in der folgenden Woche an einem Mittwoch abgebildet werden sollten, wurden die Östradiolinjektionen am Samstag und Sonntag fortgesetzt. Östradiol wurde am Montag und Dienstag nicht verabreicht, bevor die Mäuse am Mittwoch abgebildet wurden.

5. ¹⁸F-FES, PET- und MRT-Bildgebung von ovariektomierten Mäusen

ACHTUNG: Verwenden Sie beim Umgang mit Radioaktivität Schutzausrüstung. Befolgen Sie alle geltenden behördlichen Verfahren beim Umgang mit Radioaktivität.

1. Wiegen Sie die Maus und notieren Sie ihr Gewicht.
2. Für diese Studie wurde ¹⁸F-FES synthetisiert und in einem klinischen Grad²³ (bezogen von der Abteilung für molekulare Bildgebung und Therapie, Austin Health) für die Verwendung in Tiermodellen formuliert. ¹⁸F-FES (109 min radioaktive Halbwertszeit) in 10 % w/v Ethanol-Kochsalzlösung bei einer angepassten zerfallskorrigierten Injektionskonzentration von ca. 150-300 μCi/100 μl verdünnen.
   HINWEIS: Eine spezifische Aktivität von 1000 Ci/mmol ist für die In-vivo-PET-Bildgebung von ERα²⁴ ausreichend, und die ^{erhaltenen 18}F-FES wiesen eine spezifische Aktivität über diesem Ausgangswert auf.
3. Ziehen Sie 100 μl mit einer Insulinspritze mit einer 29 g Nadel. Verwenden Sie einen Dosiskalibrator, um die Radioaktivitätsdosis und -zeit zu messen und aufzuzeichnen. Platzieren Sie die Spritze bis zum Zeitpunkt der Injektion hinter einem Bleischutz.
   HINWEIS: Messen Sie die Menge an ¹⁸F-FES-Radioaktivität in jeder Dosis mit einem Dosiskalibrator. Der Dosiskalibrator sollte gemäß dem Protokoll des Herstellers gegen ein Standardreferenzmaterial wie Cäsium-137 kalibriert werden. Es ist wichtig, den Zeitpunkt des Messwerts aufzuzeichnen, um die Abklingkorrektur zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die auf dem Kalibrator angezeigte Zeit mit der Zeit auf dem Computer übereinstimmt, der für die PET-Erfassung verwendet wird.
4. Um die Schwanzvenen für die intravenöse Injektion zu erweitern, legen Sie die Maus 2 Minuten lang in einem Abstand von 30 cm unter ein Heizelement. Wischen Sie den Schwanz mit 70 % w/v Ethanol ab, um den Bereich vor der Injektion zu desinfizieren.
5. Verabreichen Sie 100 μl ¹⁸F-FES (das gesamte Volumen in der Spritze) mit einer Bolusinjektion über die laterale Schwanzvene und notieren Sie den Zeitpunkt der Injektion. Drücken Sie mit einem Taschentuch auf die Injektionsstelle, um eine Blutung der Schwanzvene zu verhindern.
6. Messen Sie die verbleibende Dosis in der Spritze plus das Gewebe mit dem Dosiskalibrator und notieren Sie die Messung und den Zeitpunkt. Injizieren Sie Mäuse gestaffelt in Zweierchargen, um die Bildgebung mit der Mehrkammer zu ermöglichen.
   HINWEIS: Ein Teil der Sonde verbleibt in der Spritze. Die Verwendung von Insulinspritzen wird gegenüber Spritzen bevorzugt, die über Luer-Locken mit den Nadeln verbunden sind, da das Dosisvolumen, das nach der Verabreichung der Injektion in der Spritze/Nadel eingeschlossen ist, verringert ist. Darüber hinaus wird die Radioaktivität im Gewebe gemessen, die verwendet wird, um Blutungen zu stoppen, die nach intravenöser Injektion der Sonde auftreten können. Dies liegt daran, dass der Rückfluss von Blut, das vom Gewebe absorbiert wird, eine gewisse Radioaktivität von ¹⁸F-FES enthalten kann. Darüber hinaus hängt die Zeit, die benötigt wird, um die seitlichen Schwanzvenen zu erwärmen, von Variablen wie der Intensität der Wärmequelle und der Nähe zu den Mäusen ab. Bei Standard-Wärmelampen kann es bis zu 15 Minuten dauern, bis sich die Venen erweitert haben. Mäuse müssen engmaschig auf Anzeichen von Überhitzung überwacht und bei Bedarf zwischen den Injektionen von der Heizquelle entfernt werden.
7. Bei Mäusen, die nach der Injektion in den Schlaf versetzt werden, legen Sie die injizierte Maus in die Anästhesiekammer, die unter einem Erhaltungsniveau von Isofluran (2 % -2,5 %) und Sauerstoff (2 l/min) für 1 h auf einem Heizkissen gehalten wird, damit die Sonde vor dem PET-Scan über den systemischen Kreislauf der Maus verteilt werden kann. Lassen Sie die anderen Mäuse in der Gruppe 1-1,5 h bis zum PET-Scan frei in ihrem Käfig laufen.
8. Nach 1-1,5 h legen Sie die Maus in eine Bildgebungskammer unter Nasenkonus-Isofluran-Anästhesie. Schalten Sie die Bettheizung auf 32 °C ein, wählen Sie eine Mehrkammerkonfiguration und schalten Sie das Atemüberwachungssystem ein. Platzieren Sie die beiden abzubildenden Mäuse in Bauchlage. Platzieren Sie die Bildgebungskammer in das PET/MRT-Gerät.
9. Überwachen Sie die Atmung der Maus während der gesamten Bildaufnahme. Verwenden Sie eine Atemtabelle, um sicherzustellen, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt des Scans 60-80 Atemzüge pro Minute durchgeführt werden. Wenn die Atemfrequenz den gewünschten Bereich unter- oder überschreitet, passen Sie die Isofluran-Dosis nach Bedarf an.
   HINWEIS: Die Atmung des Tieres kann aufgrund des Vorhandenseins eines Sensors in der Bildgebungskammer überwacht werden.
10. Kombinieren Sie eine statische 15-minütige PET-Aufnahme mit einem axialen 3D-MRT-Scan mit Gradient Echo (GRE). Nachfolgend finden Sie die Erfassungsparameter:
    1. Um das PET-Protokoll einzurichten, öffnen Sie das Fenster Radiopharmaceutical Editor in der entsprechenden Software. Geben Sie das verwendete Isotop, die Spritzenaktivität (MBq), die Injektionszeit und die angewendete Aktivität (MBq) sowie das Körpergewicht an. Alle diese Parameter sind wichtig, um die Aufnahme der Sonde in das interessierende Gewebe zu berechnen und zu quantifizieren.
    2. Um sicherzustellen, dass die Maus für die Bildgebung korrekt positioniert ist, verwenden Sie eine 2D-Scout-Sequenz (Vorder- und Rückseite), um das PET-Sichtfeld zu bestimmen. Fahren Sie mit einer 15-minütigen statischen PET-Erfassung mit einem Energiefenster von 400-600 keV und einem Koinzidenzmodus von 1-5,5 ns fort. Führen Sie anschließend einen GRE3D-Axial-MRT-Scan für ca. 27 Minuten durch.
11. Rekonstruieren Sie die aufgenommenen Bilder mit der entsprechenden Software.
    1. Führen Sie eine statische Rekonstruktion des PET/MRT-Bildes durch und verwenden Sie den geometrischen Planer, um den Rekonstruktionsbereich so zu modifizieren, dass er die gesamte Maus abdeckt und eine optimale Rekonstruktionszeit gewährleistet.
    2. Schalten Sie im Fenster Ergebnisidentifikation die zufälligen Korrekturen, die Dämpfungskorrektur (AC) + Streuung und den Positionsbereich auf Ein. Legen Sie die Abklingreferenzzeit auf ADMIN fest. Legen Sie den Körper-Luft-Schwellenwert auf 30 % fest, und legen Sie die Dämpfungskorrektur auf der Grundlage des Material-Maps fest.
12. Verwenden Sie relevante Software für die Trennung von Mehrkammerbildern, die Co-Registrierung und die Erstellung von Regions of Interest (ROIs). Für die Co-Registrierung richten Sie das MRT neu aus, um es an das PET anzupassen, und rekonstruieren Sie das PET-Bild.
13. Um die Mehrkammerbilder zu trennen, klicken Sie auf Bildverarbeitung > Segmentierung > Hoteltrennzeichen. Schalten Sie den wissenschaftlichen Modus ein und passen Sie die Schwellenwert- und Lautstärkeparameter nach Bedarf an, bis 2 Objekte gefunden werden.
14. Geben Sie die Dosis zum Zeitpunkt der Injektion ein, nachdem Sie die in der Spritze verbliebene Restdosis berücksichtigt haben, um die PET-Daten in die Einheit der prozentual injizierten Dosis pro Gramm (%ID/g) umzurechnen, oder geben Sie zusätzlich das Gewicht des Probanden ein, um die PET-Daten in die Einheit des standardisierten Aufnahmewerts (SUV) umzurechnen. Führen Sie diese Konvertierung durch, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den PET-Datensatz klicken und das Feld %ID/g auf der Registerkarte Basisinformationen suchen. Geben Sie die zuvor aufgezeichnete %ID/g ein.
15. Um ROIs für die Tumorabschnitte zu zeichnen, klicken Sie auf die Registerkarte Messungen auf der linken Seite des Programmfensters. Zeichnen Sie den ROI mit dem Polygon - oder Freihandwerkzeug . Zeichnen Sie vorsichtig um den Umfang des Tumors herum und stellen Sie sicher, dass die Aktion ausgeführt wird, während sich das PET-Bild im aktiven Fenster befindet (überprüfen Sie dies mit Fn-A). Das Ergebnis ergibt einen Wert des ROI als %ID/g.
    HINWEIS: Die ROI-Analyse liefert eine gute Schätzung der %ID/g. Eine gut kalibrierte Kamera sollte eine Genauigkeit von ±5 % im Vergleich zu Ex-vivo-Bioverteilungsdaten bieten.

6. Entnahme und Fixierung von Tumorgewebe für die Immunhistochemie

1. Am experimentellen Endpunkt wird die Maus durch letale Inhalation von Isofluran bei 4 % bis 5 % oder durch Überinhalation von CO₂ eingeschläfert.
2. Setzen Sie mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette vorsichtig einen kleinen Schnitt in der Nähe der Oberfläche des Tumors und resezieren Sie das Tumorgewebe. Ist die Haut am Tumorgewebe befestigt, trennen Sie mit einer Skalpellklinge die Haut sanft vom Tumor.
3. Legen Sie das Tumorgewebe in ein 5-ml-Fläschchen mit ca. 3 ml 10 % neutral gepuffertem Formalin. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gewebe mit Lösung bedeckt ist, um die Gewebefixierung zu erleichtern. Lassen Sie das Gewebe 24 Stunden lang in Formalin getaucht.
4. Am nächsten Tag wird das fixierte Tumorgewebe in ein 5-ml-Fläschchen mit 70 % Ethanol überführt. Markieren Sie eine für das Tumorgewebe spezifische Gewebekassette zur Vorbereitung der Paraffineinbettung.
5. Legen Sie das Tumorgewebe in eine Gewebekassette und lagern Sie es in einer 70%igen Ethanollösung bis zur Paraffineinbettung.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde die Paraffineinbettung von anatomischen Pathologen von Austin Health durchgeführt.

7. Immunhistochemie zum Nachweis des Östrogenrezeptors alpha (ERα)

1. Schneiden Sie mit einem Mikrotom 4 μm dicke Abschnitte des Tumorgewebes, die für die Färbung benötigt werden, nach Standardverfahren.
2. Legen Sie die Glasobjektträger mit den geschnittenen Tumorschnitten in ein Objektträgergestell und stellen Sie das Gestell in einen 37 °C heißen Ofen, um es über Nacht zu trocknen und sicherzustellen, dass das Gewebe vor dem Färben an den Objektträgern haftet.
3. Legen Sie am nächsten Morgen das Gestell mit den Objektträgern mit den geschnittenen Tumorschnitten für 30 min in einen 60 °C heißen Ofen, um den Entparaffinierungsprozess zu erleichtern.
   HINWEIS: Die Objektträger sollten beim Backen nach oben zeigen. Dadurch wird die Haftung des Gewebes gewährleistet, und das schmelzende Wachs schmilzt auf seinem eigenen Objektträger und nicht auf benachbarten Objektträgern.
4. Um die Abschnitte zu rehydrieren, tauchen Sie die gebackenen Abschnitte zweimal in Xylol, jeweils 5 min (2x 5 min), 100% Ethanol für 2x 5 min und dann 70% Ethanol für 1x 5 min. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in destilliertem Wasser.
5. Für die Antigengewinnung tauchen Sie die Objektträger in einem Behälter mit 1x EDTA-Puffer, pH 8, für 25-30 min in ein 100 °C heißes Wasserbad. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Wasserbad und lassen Sie die Objektträger mindestens 1 Stunde lang bei RT ruhen. Sobald die Objektträger abgekühlt sind, waschen Sie sie 2 min unter fließendem Leitungswasser und anschließend TBST (TBS mit 0,01% Tween20) für 2x 5 min.
6. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis um die Abschnitte auf den Objektträgern.
7. Quenden Sie endogene Peroxidasen ab, indem Sie ca. 100 μl 3%ige H₂O₂ -Lösung (verdünnt in destilliertem Wasser) für 10 min bei RT auf die Schnitte geben. Waschen Sie die Objektträger 2 min lang unter fließendem Leitungswasser und anschließend TBST für 2x 5 min.
8. Blockschnitte mit ca. 100 μl/Abschnitt Blockierungspuffer (5 % Rinderserumalbumin (BSA) in TBST) für 30 min bei RT.
9. Lassen Sie den Blockierungspuffer ab, indem Sie die überschüssige Lösung vorsichtig in die Inkubationsschale schnippen. Etwa 100 μl Primärantikörper (humanes Anti-ERα, gezüchtet bei Kaninchen) in Schnitten mit einer Verdünnung von 1:300 (oder in optimaler, vorbestimmter Verdünnung, spezifisch für den verwendeten Antikörper) geben. Die Antikörperverdünnungen werden in 1 % BSA TBST hergestellt und die Objektträger über Nacht mit dem Antikörper bei 4 °C inkubiert.
   HINWEIS: Die Inkubationsschale sollte am Boden mit Wasser gefüllt sein, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht über Nacht trocknen.
10. Am nächsten Morgen die Dias 3x 5 min mit TBST waschen. Geben Sie ca. 100 μl Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper auf die Schnitte und lassen Sie sie 45 Minuten bei RT einwirken. Waschen Sie die Objektträger 3x 5 Minuten lang mit TBST.
11. Geben Sie in einem Abzug ca. 100 μl 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Reagenz auf die Schnitte und lassen Sie die Lösung etwa 3 Minuten pro Schnitt einwirken. Hemmen Sie die DAB-Reaktion, indem Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit fließendem Leitungswasser waschen.
12. Färben Sie die Objektträger 1 Minute lang mit Hämatoxylin und spülen Sie sie 2 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser ab. Tauchen Sie die Objektträger 1 Minute lang in Scott's Wasser und spülen Sie sie dann weitere 2 Minuten unter fließendem Leitungswasser ab.
13. Um die Abschnitte zu dehydrieren, tauchen Sie die Abschnitte 2 min lang in 70 % Ethanol, 2x 2 min in 100 % Ethanol und anschließend 2x 2 min in Xylol.
14. Montieren Sie die Abschnitte in einem Abzug vorsichtig in Dibutylphthalat-Polystyrol-Xylol (DPX) und legen Sie ein Deckglas über die Abschnitte, um sicherzustellen, dass keine Blasen über dem interessierenden Gewebe eingeschlossen werden. Lassen Sie die Rutschen über Nacht im Abzug trocknen.
15. Verwenden Sie am nächsten Tag einen Dia-Scanner, um Bilder aufzunehmen und die Färbung zu visualisieren.

Ergebnisse

Um den Ort zu bestimmen, an dem ERα-positive Tumoren mit ¹⁸F-FES-PET eindeutig sichtbar gemacht werden können, wurden in dieser Studie drei Kohorten von ovariektomierten Mäusen verwendet (Abbildung 1). Zwei Gruppen von Mäusen wurden MCF-7-Zellen - eine ERα-positive Brustkrebszelllinie - entweder IMF oder in die Schulter injiziert. Als Negativkontrolle wurde einer weiteren Kohorte von Mäusen MDA-MB-231-Zellen injiziert, eine häufig verwendet...

Diskussion

In dieser Arbeit beschreiben wir den Nutzen von ¹⁸F-FES PET/MRT bei der Detektion von Brusttumoren, die durch ERα-Expression gekennzeichnet sind. Als Beispiel zeigen wir, dass eine Stelle, an der ERα-positive Tumoren sichtbar gemacht werden können, in der Schulter von Mäusen ist - diese Tumoren können durch die Aufnahme von ¹⁸F-FES eindeutig identifiziert werden, verglichen mit Tumoren, die sich innerhalb des 4^. leistenden Brustfettpolsters befinden ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
27 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringe	Terumo	SS*05M2713KA	For cell injections
29 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringe	Terumo	SS*05M2913KA	For estradiol injections
30% H2O2	Chem-Supply	HA154	Diluted to a 3% working solution with distilled water
Corn oil	Sigma	C8267
DAB Substrate Kit	Abcam	ab64238
Dako anti-rabbit-HRP, 110 mL	Aligent-Dako	K4003	Secondary antibody used for IHC
DMEM/F-12 Medium	Gibco	11320033
Dose calibrator	Capintec	5130-3216
Estradiol	Sigma	E2758
Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	#8644	Primary antibody used for IHC
FBS	Bovogen	SFBS
Heat element (Infra Red Lamp)	Amcal	12400	For tail vein dilation
Matrigel	Corning	356225
MultiCell 4 Channel Monitoring kit for triple- or quadruple-mouse imaging chamber	Mediso	PR-MC900200	For monitoring of mouse respiration
NanoScan PET/MRI 3T System	Mediso	PR-RD000000	For PET/MRI acquistion
PBS (1x)	Gibco	14190-144
TBST	ThermoFisher	#28360	Wash buffer for IHC
Three mice imaging chamber	Mediso	PR-MC407300	For PET/MRI acquistion