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Résumé

Ici, nous démontrons un protocole permettant d’utiliser la tomographie par émission de positons (TEP) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol (18F-FES) comme outil pour visualiser l’expression de ERα dans les xénogreffes mammaires ERα positives.

Résumé

Pour démontrer comment des xénogreffes de cancer du sein positives aux récepteurs d’œstrogènes alpha (ERα) peuvent être visualisées chez des souris nues BALB/c à l’aide de la tomographie par émission de positons (TEP) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol (18F-FES), des souris nude BALB/c ovariectomisées ont reçu une injection de cellules cancéreuses du sein ERα-positives (MCF-7, 3 × 10,6 cellules ; épaule [n = 10] ou 4e coussinet adipeux mammaire inguinal [n = 10]) ou de cellules cancéreuses du sein ERα négatives (MDA-MB-231, 1 × 106 cellules ; coussinet adipeux mammaire [n = 5]). Les souris hébergeant des cellules MCF-7 ont reçu des injections sous-cutanées de 20 μg de 17β-œstradiol (20 μg/20 μL ; huile de maïs :éthanol, 9:1) dans la nuque 2 jours avant l’injection cellulaire, suivies d’injections quotidiennes cinq fois par semaine pendant 5 semaines. Les volumes tumoraux ont été mesurés selon la formule : (L*W2)/2 (L ; longueur, W ; largeur). Une fois que les volumes tumoraux ont atteint environ 100 mm3, les injections de 17β-œstradiol ont été arrêtées 2 jours avant que les souris ne reçoivent 18F-FES pour l’imagerie TEP afin d’éviter la liaison compétitive avec ERα. Après l’administration de 18F-FES par la veine latérale de la queue, une TEP/IRM a été réalisée pendant 15 min à 1 h à 1,5 h après l’injection. 18L’absorption de la F-FES n’a pas été observée chez les souris porteuses de tumeurs MDA-MB-231 ERα-négatives. 18L’absorption de F-FES était plus prononcée chez les souris porteuses de tumeurs MCF-7 dans l’épaule. Dans les tumeurs MCF-7 cultivées dans le coussinet adipeux mammaire inguinal, l’absorption de 18F-FES était moins visible, car le profil d’excrétion intestinale de 18F-FES obscurcissait la radioactivité détectable dans ces tumeurs. Pour utiliser la TEP de 18F-FES comme outil de visualisation de l’expression de ERα dans les xénogreffes mammaires ERα-positives, nous démontrons que la visibilité de l’absorption de 18F-FES est claire dans les tumeurs situées loin de la région abdominale des souris, comme dans l’épaule.

Introduction

Les cancers du sein (BC) peuvent être stratifiés en différents sous-types moléculaires1. Les tumeurs du sein classées dans le sous-type luminal surexpriment le récepteur des œstrogènes alpha (ERα). En tant que tel, ce sous-type de BC est également appelé ERα-positif (ERα+). Heureusement, les personnes diagnostiquées avec ERα+ BC ont le taux de survie à 10 ans le plus élevé, associé à de faibles taux de métastases à distance 2,3. En raison de l’expression de ERα, ces patients ont accès à un ensemble d’options d’hormonothérapie, y compris des modulateurs sélectifs des récepteurs d’œstrogènes (SERM), des médicaments anti-œstrogènes et des inhibiteurs de l’aromatase4.

Pour évaluer si une patiente atteinte d’un cancer du sein est éligible à l’hormonothérapie, les niveaux d’expression de ERα dans les tumeurs du sein doivent être déterminés 5,6,7. Bien que l’étalon-or des tests soit effectué à l’aide de méthodes d’immunohistochimie (IHC), de nombreux rapports mettent en évidence la question de la reproductibilité et de la fiabilité des résultats obtenus 6,8,9. L’IHC peut donner lieu à une discordance des résultats car la technique est de nature semi-quantitative, où les différences dans le traitement des tissus et l’interprétation ultérieure peuvent conduire à une variabilité6. Pour remédier à ce problème récurrent, des lignes directrices ont été établies en 2010 et mises à jour en 2020 par l’American Society of Clinical Oncology dans le but de réduire la variation inter-observateur10. À l’heure actuelle, le seuil validé cliniquement se situe à ≥1 %, l’expression de ERα même à de très faibles niveaux d’expression démontrant des avantages cliniquement significatifs en utilisant l’endocrinothérapie11.

Dans les cellules souches embryonnaires avancées, l’expression de ERα peut différer entre les métastases et la tumeur primaire. Certaines observations font état d’un écart de 18 % à 55 % dans les niveaux d’expression de ERα entre les lésions métastatiques et la tumeur primaire, ce qui souligne l’importance de déterminer le statut ERα des métastases de BC12. Pour y remédier, les lignes directrices soulignent l’importance de confirmer le statut des récepteurs hormonaux dans les lésions métastatiques afin d’élaborer des plans de traitement éclairés13,14. Cependant, la faisabilité de cette méthode est discutable, en particulier avec les méthodes IHC, étant donné que des métastases peuvent exister dans des endroits difficiles à prélever.

Les méthodes d’imagerie moléculaire sont devenues des outils essentiels pour la détection et la visualisation des lésions tumorales chez les patients atteints de cancer. En particulier, l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) nécessite l’utilisation de traceurs ou, plus précisément, de produits radiopharmaceutiques, qui sont conçus pour exploiter certaines caractéristiques des tumeurs dans le but de visualiser ces lésions de manière non invasive. Le traceur TEP le plus couramment utilisé en oncologie est le 18-fluorodésoxyglucose (18F-FDG)15. Dans cette étude, nous explorons l’utilisation d’une forme radiomarquée d’œstradiol, le 18F-fluoroestradiol (18F-FES). L’œstradiol - un ligand de ERα - est une hormone principalement produite par les ovaires chez les femmes16. 18F-FES a récemment reçu l’approbation de la Food and Drug Administration (FDA) et est commercialisé sous le nom de CeriannaTM. Cet agent d’imagerie est conçu pour être utilisé en complément des biopsies chez les patients atteints de BC17 récidivant ou métastatique. L’imagerie TEP du corps entier avec 18F-FES peut être utilisée comme méthode non invasive pour détecter les niveaux de ERα à la fois dans la tumeur primaire et dans les métastases à distance dans les régions où les biopsies sont difficiles à obtenir18. La prédiction des niveaux de ERα à l’aide de l’imagerie TEP 18F-FES est corrélée avec les résultats de l’IHC, et de plus, peu ou pas de détection de ERα à l’aide de l’imagerie TEP 18F-FES est un prédicteur fiable de tumeurs qui sont peu susceptibles de répondre à l’hormonothérapie18. Afin d’assurer l’utilisation appropriée du 18F-SEF en clinique, des lignes directrices ont été formulées par consensus par des experts dans le domaine19. Dans cette étude, nous évaluons l’utilisation de 18F-FES PET dans des modèles précliniques de cancer du sein chez la souris.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’hôpital d’Austin (A2023/05812) et menées conformément au Code australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques.

1. Préparation cellulaire

  1. À l’aide des procédures de culture cellulaire de routine, conserver les cellules MDA-MB-231 et MCF-7 dans le DMEM/F-12 complétées par de la pénicilline/streptomycine et 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans des flacons de culture tissulaire T175. Avant de préparer les cellules pour l’injection, les cellules sont acheminées au moins 3 fois après la réactivation des réserves d’azote liquide. Cultivez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
  2. Propager les cellules de telle sorte que, le jour de la préparation des cellules pour l’injection, il y ait 3 × 106 cellules MCF-7 par injection par souris pour 15 souris (c’est-à-dire au moins 45 ×10 6 cellules MCF-7) et 1 × 106 cellules MDA-MB-231 par injection par souris pour 5 souris (c’est-à-dire au moins 5 × 106 cellules MDA-MB-231).
    REMARQUE : Pour permettre un nombre égal de cellules dans chaque souris, préparez suffisamment de cellules pour cinq injections supplémentaires (par exemple, préparez suffisamment de cellules pour 10 injections pour l’injection de cinq souris).
  3. Le jour de l’injection cellulaire, retirer le milieu de tous les flacons et placer environ 5 mL de trypsine-EDTA (0,25 % de trypsine et 0,05 % d’EDTA) dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,4) sur les cellules pour faciliter le détachement cellulaire.
  4. Une fois que les cellules se sont détachées, placez environ 10 ml de milieu complet dans des flacons pour inhiber l’activité de la trypsine. Remettez les cellules en suspension et transférez la suspension unicellulaire dans un tube de 50 ml. Centrifuger à ~300 × g pendant 2 min pour couper les cellules.
  5. Remettre la pastille en suspension dans un volume approprié de milieu et compter les cellules pour déterminer le nombre total de cellules récoltées.
    REMARQUE : Essayez de compter les solutions d’environ 1 × 106 cellules par ml (50 à 100 cellules par 16 carrés si vous utilisez une chambre de comptage). Pour les cellules qui se développent à 5 × 106 par fiole pleine, récoltez les cellules dans 5 mL de milieu. Pour les lignées cellulaires de densité plus élevée, utiliser 10 ml de milieu par flacon.
  6. Effectuez cette étape sur de la glace dans une armoire stérile à flux laminaire. Une fois ce nombre atteint, centrifugez à nouveau la suspension cellulaire à 300 × g pendant 2 min pour obtenir des cellules en granulés. Remettre la pastille en suspension dans une solution froide de PBS et de matrice de membrane basale glacée de sorte que pour 3 × 106 cellules MCF-7, il y ait 40 μL de PBS et 10 μL de solution de matrice de membrane basale.
  7. Remettre en suspension la pastille de cellule MDA-MB-231 avec les mêmes constituants de sorte que pour 1 × 106 cellules, il y ait 40 μL de PBS et 10 μL de solution matricielle de membrane basale. Transférez le mélange de matrice cellule-PBS-membrane basale du tube de 50 ml dans des tubes plus petits de 1,5 ml avec une pointe de pipette froide et maintenez le mélange de cellules sur de la glace juste avant l’injection de cellules dans des souris.
    REMARQUE : La matrice de la membrane basale utilisée dans cette étude est stockée à -20 °C. La veille de la nécessité d’appliquer la solution matricielle de membrane basale, une aliquote de la solution est placée à 4 °C pour la décongélation pendant la nuit. Le lendemain, il est prêt à l’emploi à des températures froides (sur glace). Lors du pipetage de la solution, assurez-vous que les pointes de pipette utilisées sont froides pour éviter que la solution de matrice de membrane basale ne se solidifie. Il est recommandé de conserver une boîte d’embouts de pipette stériles au réfrigérateur avant le jour de la préparation des cellules pour l’injection. Lors de la remise en suspension de la pastille cellulaire dans une solution glacée de PBS et de matrice de membrane basale, le PBS est ajouté en premier, suivi de la quantité requise de solution de matrice de membrane basale.

2. Injection de cellules chez des souris ovariectomisées

  1. Laissez les souris nues femelles ovariectomisées BALB/c de 6 à 8 semaines s’acclimater à l’animalerie pendant au moins 1 semaine avant l’injection de cellules.
    REMARQUE : Cette étude a eu accès à des souris plus âgées, âgées de 12 à 14 semaines. L’ovariectomie assure de faibles niveaux d’œstradiol endogène et réduit la compétition avec le ligand 18F-FES. Selon le modèle étudié, les souris plus jeunes (p. ex., 4 à 8 semaines) peuvent ne pas avoir besoin de subir une ovariectomie en raison des faibles taux d’œstradiolendogène 20,21.
  2. Induire une anesthésie chez une souris avec 4 % d’isoflurane et d’oxygène à un débit de 4 L/min à l’aide d’une chambre d’induction d’anesthésie. Observez la souris et vérifiez qu’il n’y a pas de perte de réflexe de redressement. Une fois qu’ils ne bougent plus, transférez la souris dans une armoire stérile à flux laminaire, placez le museau dans le masque nasal et maintenez l’anesthésie en ajustant l’isoflurane à 2 % et l’oxygène à un taux de 2 L/min.
    REMARQUE : Anesthésie une souris à la fois pour assurer des soins optimaux.
  3. Pour les injections de coussinet adipeux intramammaire (IMF), tamponnez la peau sur la 4eglande mammaire inguinale avec de l’alcool. Utilisez une seringue de 27 G pré-refroidie (sur de la glace) pour aspirer la suspension de cellules froides et laissez la seringue sur de la glace pour éviter de réchauffer/solidifier la solution de matrice de membrane basale avant l’injection.
  4. À l’aide du pouce et de l’index de la main non dominante, soulevez doucement la 4e glandemammaire et insérez une aiguille de seringue de 27 G avec la main dominante, en veillant à ce que le biseau de l’aiguille soit orienté vers le haut. Injectez lentement 50 μL de la suspension cellulaire contenant le mélange de solution de matrice cellule-PBS-membrane basale dans le coussinet adipeux mammaire.
    REMARQUE : Une bulle doit être ressentie entre les doigts lors de l’injection des cellules. Vérifiez s’il y a des fuites au point d’injection.
  5. Une fois l’injection terminée, éteignez l’isoflurane et gardez le museau de la souris dans le cône nasal pour respirer de l’oxygène et reprendre conscience (cela devrait prendre environ une minute). Replacez la souris dans une cage sur un coussin chauffant pour une récupération optimale.
  6. Pour les injections à l’épaule, utilisez la procédure décrite ci-dessus pour l’injection IMF, la seule différence étant l’emplacement de l’injection cellulaire.
    REMARQUE : Alternativement, l’injection de l’épaule peut être effectuée sans anesthésie (voir l’étape 2.7 ci-dessous).
  7. Pour une injection à l’épaule sans anesthésie, tenez et soulevez la peau par-dessus l’épaule de la souris à l’aide de la main non dominante entre le pouce et l’index, formant une « tente » dans la peau. Injectez lentement 50 μL de suspension cellulaire contenant la solution de matrice de membrane cellule-PBS-socle à l’aide d’une aiguille de seringue de 27 G. Retirez doucement l’aiguille et vérifiez qu’il n’y a pas de fuites.
    REMARQUE : Comme alternative, une seringue Hamilton peut être utilisée pour des injections de petit volume afin d’assurer la précision de l’administration du volume. Entre les injections, de l’éthanol à 80 % v/v est utilisé pour rincer la seringue lors de l’utilisation de différentes lignées cellulaires, et le PBS est utilisé pour rincer et éliminer l’éthanol résiduel de la seringue.

3. Préparation de la solution d’œstradiol

  1. À l’aide d’une balance capable de mesurer avec précision les milligrammes d’une substance, pesez 7 mg de poudre d’œstradiol dans un tube de 1,5 ml.
  2. Ajouter 700 μL d’éthanol à 100 % dans 7 mg de poudre d’œstradiol. Placez le tube de 1,5 mL sur un agitateur doux pendant environ 1 h à température ambiante (RT) ou jusqu’à ce que la poudre d’œstradiol soit complètement dissoute.
  3. Répartissez la solution dans dix tubes de 1,5 mL contenant chacun une solution d’éthanol-œstradiol de 70 μL. Placez les tubes à -20 °C pour une utilisation future.
    REMARQUE : Les stocks d’œstradiol-éthanol peuvent être conservés à -20 °C pendant environ 2 semaines.

4. Injection sous-cutanée d’une solution d’œstradiol

  1. Le jour où une injection d’œstradiol est nécessaire, préparez le mélange suivant frais. Combinez 630 μL d’huile de maïs comme véhicule dans le tube de 1,5 mL contenant 70 μL de la solution d’éthanol-œstradiol. Vortex la solution jusqu’à ce qu’elle soit homogène, en veillant à ce que l’éthanol ne se sépare pas et forme une couche au sommet de l’huile du véhicule.
    REMARQUE : Cela donne 700 μL d’une solution d’huile de maïs/éthanol de 20 μg/20 μL, 9:1. Chaque souris reçoit 20 μL de cette solution. Préparez toujours une solution supplémentaire, car l’huile contenue dans le mélange a tendance à adhérer à l’extérieur de la seringue et sur les côtés d’un tube de 1,5 mL en raison de sa viscosité (par exemple, pour 20 souris, bien que 400 μL suffisent, faire presque le double de la quantité (700 μL) offre suffisamment de place pour l’erreur).
  2. À l’aide d’une aiguille de 29 G attachée à une seringue à insuline, prélevez lentement 20 μL de solution d’œstradiol.
    REMARQUE : Étant donné que la solution contient 9 parties d’huile pour 1 partie d’œstradiol-éthanol, le mélange prendra du temps à être aspiré dans la seringue.
  3. Les souris à injecter avec une solution d’œstradiol sont celles qui hébergent des tumeurs qui expriment ERα et, par conséquent, dépendent de l’œstrogène pour se développer (MCF-7 dans cette étude). Les souris hébergeant des tumeurs qui n’expriment pas ERα (MDA-MB-231 dans cette étude) ne reçoivent pas de solution d’œstradiol. Positionnez doucement la souris à injecter devant, de préférence sur une serviette, pour éviter de blesser ses membres tout en la retenant.
  4. À l’aide de la main non dominante, retenez la souris en tenant la partie supérieure de sa queue entre l’annulaire et l’auriculaire. Utilisez le pouce et l’index pour soulever la peau lâche près du cou de la souris afin de former une « tente » dans la peau pour l’injection sous-cutanée de la solution d’œstradiol.
  5. Tout en gardant la souris dans cette retenue, utilisez la main dominante pour injecter la solution d’œstradiol à la souris. Avec le biseau de l’aiguille vers le haut, poussez l’aiguille sous la « tente » de la peau jusqu’à ce que moins de la moitié de l’aiguille soit visible.
    REMARQUE : Au fur et à mesure que la solution est injectée, la peau doit visiblement gonfler.
  6. Pour éviter tout reflux de la solution, maintenez l’aiguille sous la peau pendant quelques secondes. En cas de refoulement, séchez doucement la zone avec un mouchoir en papier pour éliminer la solution résiduelle.
    REMARQUE : Dans certaines expériences, l’œstradiol combiné à l’huile de sésame a été utilisé pour administrer l’hormone. L’utilisation de l’huile de sésame comme véhicule entraîne une inflammation locale sous la peau aux sites d’injection d’œstradiol. En tant que telle, l’huile de maïs a été choisie comme véhicule pour des expériences ultérieures, dans lesquelles les signes d’inflammation aux sites d’injection d’œstradiol étaient absents ou minimes22. Voir la discussion pour plus de détails.
  7. Après avoir retiré l’aiguille, tamponnez doucement le site d’injection avec un antiseptique topique à l’aide d’un coton-tige. Il s’agit de prévenir l’inflammation à la surface au site d’injection due à l’insertion/retrait de l’aiguille à travers la peau de la souris.
  8. Injectez des injections sous-cutanées d’œstradiol chez les souris porteuses de tumeurs qui expriment ERα (MCF-7) 3 jours avant l’injection cellulaire, puis 5 fois par semaine pendant 5 semaines (Figure 1). Arrêtez les injections d’œstradiol 2 jours avant le jour de l’imagerie pour éviter la liaison compétitive avec la sonde 18F-FES à sa cible, ERα.
    REMARQUE : Dans cette étude, des souris porteuses de tumeurs MCF-7 ont reçu une injection d’œstradiol quotidiennement du lundi au vendredi. Si elles devaient être imagées la semaine suivante, un mercredi, les injections d’œstradiol se poursuivaient le samedi et le dimanche. L’œstradiol n’a pas été administré lundi et mardi avant que les souris ne soient imagées mercredi.

5. 18EF-FES TEP et imagerie IRM de souris ovariectomisées

ATTENTION : Utilisez un équipement de protection lors de la manipulation de la radioactivité. Suivre toutes les procédures réglementaires applicables lors de la manipulation de la radioactivité.

  1. Pesez la souris et notez son poids.
  2. Pour cette étude, 18F-FES a été synthétisé et formulé à un grade cliniquede 23 (obtenu du Département d’imagerie et de thérapie moléculaires, Austin Health) pour une utilisation dans des modèles animaux. Diluer 18F-FES (demi-vie radioactive de 109 min) dans une solution saline d’éthanol à 10 % p/v à une concentration d’injection ajustée corrigée de la désintégration d’environ 150-300 μCi/100 μL.
    REMARQUE : Une activité spécifique de 1000 Ci/mmol est suffisante pour l’imagerie TEP in vivo de ERα24, et les 18F-FES reçus avaient une activité spécifique supérieure à cette valeur de base.
  3. Prélevez 100 μL à l’aide d’une seringue à insuline avec une aiguille de 29 G. Utilisez un calibrateur de dose pour mesurer et enregistrer la dose et le temps de radioactivité. Placez la seringue derrière un écran en plomb jusqu’au moment de l’injection.
    REMARQUE : Mesurez la quantité de radioactivité 18F-FES dans chaque dose avec un calibrateur de dose. L’étalonneur de dose doit être étalonné par rapport à un matériau de référence standard, tel que le césium 137, conformément au protocole du fabricant. Il est important d’enregistrer l’heure de la lecture pour déterminer la correction de la décomposition. Assurez-vous que l’heure affichée sur l’étalonneur correspond à l’heure de l’ordinateur utilisé pour l’acquisition de la TEP.
  4. Pour dilater les veines de la queue en vue d’une injection intraveineuse, placez la souris sous un élément chauffant à une distance de 30 cm pendant 2 min. Essuyez la queue avec de l’éthanol à 70 % p/v pour désinfecter la zone avant l’injection.
  5. Administrer 100 μL de 18F-FES (le volume total de la seringue) avec une injection en bolus par la veine latérale de la queue et noter le moment de l’injection. Appuyez sur le site d’injection avec un mouchoir pour empêcher la veine de la queue de saigner.
  6. Mesurez la dose restante dans la seringue et le tissu à l’aide de l’calibrateur de dose et notez la mesure et le temps. Injectez des souris échelonnées par lots de deux pour permettre l’imagerie à l’aide de la multichambre.
    REMARQUE : Une partie de la sonde sera laissée dans la seringue. L’utilisation de seringues à insuline est préférée aux seringues reliées à des aiguilles par des serrures Luer en raison de la diminution du volume de dose piégée dans la seringue ou l’aiguille après l’administration de l’injection. De plus, la radioactivité dans le tissu utilisé pour arrêter tout saignement pouvant survenir après l’injection intraveineuse de la sonde est mesurée. En effet, le reflux du sang absorbé par le tissu peut contenir une partie de la radioactivité de 18F-FES. De plus, le temps nécessaire pour réchauffer les veines latérales de la queue dépendra de variables telles que l’intensité de la source de chaleur et sa proximité avec les souris. Pour les lampes chauffantes standard, la dilatation des veines peut prendre jusqu’à 15 minutes. Les souris doivent être surveillées de près pour détecter les signes de surchauffe et retirées de la source de chauffage entre les injections si nécessaire.
  7. Pour les souris qui sont affectées au sommeil après l’injection, placez la souris injectée dans la chambre d’anesthésie maintenue sous un niveau de maintien d’isoflurane (2 % à 2,5 %) et d’oxygène (2 L/min) pendant 1 h sur un coussin chauffant pour permettre à la sonde d’être distribuée via la circulation systémique de la souris avant la TEP. Laissez les autres souris du groupe se promener librement dans leur cage pendant 1 à 1,5 h jusqu’à la TEP.
  8. Après 1 à 1,5 h, placez la souris dans une chambre d’imagerie sous anesthésie isoflurane au cône nasal. Allumez le chauffage du lit à 32 °C, sélectionnez une configuration à plusieurs chambres et allumez le système de surveillance respiratoire. Placez les deux souris à imager en position couchée. Placez la chambre d’imagerie dans l’appareil de TEP/IRM.
  9. Surveillez la respiration de la souris tout au long de l’acquisition de l’image. Utilisez un tableau de respiration pour vous assurer de 60 à 80 respirations par minute à tout moment pendant l’examen. Si la fréquence respiratoire tombe en dessous ou au-dessus de la plage souhaitée, ajustez la dose d’isoflurane au besoin.
    REMARQUE : La respiration de l’animal peut être surveillée grâce à la présence d’un capteur dans la chambre d’imagerie.
  10. Associez une acquisition TEP statique de 15 minutes à un balayage IRM axial 3D à écho de gradient (GRE). Voir ci-dessous pour les paramètres d’acquisition :
    1. Pour configurer le protocole TEP, ouvrez la fenêtre Radiopharmaceutical Editor dans le logiciel approprié. Précisez l’isotope utilisé, l’activité de la seringue (MBq), le temps d’injection et l’activité appliquée (MBq) et le poids corporel. L’ensemble de ces paramètres est essentiel pour aider à calculer et quantifier l’absorption de la sonde dans le tissu d’intérêt.
    2. Pour vous assurer que la souris est correctement positionnée pour l’imagerie, utilisez une séquence 2D Scout (avant et arrière) pour déterminer le champ de vision de la TEP. Procéder à une acquisition TEP statique de 15 minutes en utilisant une fenêtre d’énergie de 400-600 keV, mode de coïncidence de 1-5, 5 ns. Effectuez une IRM axiale GRE3D pendant environ 27 minutes par la suite.
  11. Reconstruisez les images acquises à l’aide d’un logiciel approprié.
    1. Effectuez une reconstruction statique de l’image TEP/IRM et utilisez le planificateur géométrique pour modifier la zone de reconstruction afin de vous assurer qu’elle couvre l’intégralité de la souris, garantissant ainsi un temps de reconstruction optimal.
    2. Dans la fenêtre Identification des résultats , basculez les corrections aléatoires, la correction d’atténuation (AC) + diffusion, la plage de position sur Activé. Définissez le temps de référence de décroissance sur ADMIN. Réglez le seuil corps-air à 30 % et basez la correction de l’atténuation sur la carte du matériau.
  12. Utiliser un logiciel pertinent pour la séparation d’images multichambres, le co-enregistrement et pour dessiner des régions d’intérêt (ROI). Pour le co-enregistrement, réalignez l’IRM pour l’adapter à la TEP et reconstruisez l’image TEP.
  13. Pour séparer les images multichambres, cliquez sur Traitement d’images > Segmentation > séparateur d’hôtel. Activez le mode scientifique et ajustez les paramètres de seuil et de volume selon vos besoins jusqu’à ce que 2 objets soient trouvés.
  14. Entrez la dose au moment de l’injection après avoir pris en compte toute dose résiduelle restante dans la seringue pour convertir les données TEP en unité de pourcentage de dose injectée par gramme ( %ID/g) ou entrez en outre le poids du sujet pour convertir les données TEP en unité de valeur d’absorption standardisée (SUV). Pour effectuer cette conversion, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’ensemble de données PET et localisez le champ %ID/g dans l’onglet Informations de base . Entrez le %ID/g enregistré précédemment.
  15. Pour dessiner des retours sur investissement sur les sections tumorales, cliquez sur l’onglet Mesures sur le côté gauche de la fenêtre du programme. Dessinez le retour sur investissement avec le polygone ou l’outil à main levée . Dessinez soigneusement autour de la circonférence de la tumeur, en vous assurant que l’action est effectuée pendant que l’image TEP est dans la fenêtre active (vérifiez à l’aide de Fn-A). Le résultat donne une valeur du retour sur investissement sous la forme %ID/g.
    REMARQUE : L’analyse du retour sur investissement donne une bonne estimation du %ID/g. Une caméra bien calibrée doit donner une précision de ±5 % par rapport aux données de biodistribution ex vivo .

6. Prélèvement et fixation de tissu tumoral pour l’immunohistochimie

  1. Au point final expérimental, euthanasier la souris en utilisant l’inhalation létale d’isoflurane à 4 % à 5 % ou l’inhalation excessive de CO2.
  2. À l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler, créez soigneusement une petite incision près de la surface de la tumeur et réséquez le tissu tumoral. Si la peau est attachée au tissu tumoral, utilisez une lame de scalpel pour séparer doucement la peau de la tumeur.
  3. Placez le tissu tumoral dans un flacon de 5 ml contenant environ 3 ml de formol neutre tamponné à 10 %. Assurez-vous que l’ensemble du tissu est recouvert de solution pour faciliter la fixation du tissu. Gardez le tissu immergé dans du formol pendant 24 h.
  4. Le lendemain, transférez le tissu tumoral fixé dans un flacon de 5 ml contenant 70 % d’éthanol. Étiquetez une cassette tissulaire spécifique pour le tissu tumoral en préparation de l’enrobage de paraffine.
  5. Placez le tissu tumoral dans une cassette de tissus et stockez-le dans une solution d’éthanol à 70 % jusqu’à l’incorporation de paraffine.
    REMARQUE : Dans cette étude, l’incorporation de paraffine a été menée par des anatomopathologistes d’Austin Health.

7. Immunohistochimie pour la détection du récepteur des œstrogènes alpha (ERα)

  1. À l’aide d’un microtome, coupez des sections de 4 m d’épaisseur du tissu tumoral nécessaire à la coloration, en suivant les procédures standard.
  2. Placez les lames de microscope en verre avec des sections tumorales coupées dans une grille à lames et placez la grille dans un four à 37 °C pour sécher pendant la nuit et pour s’assurer que les tissus adhèrent aux lames avant la coloration.
  3. Le lendemain matin, placez la grille avec les lames contenant les sections tumorales coupées dans un four à 60 °C pendant 30 min pour faciliter le processus de déparaffinage.
    REMARQUE : Les lames de verre doivent être orientées vers le haut pendant la cuisson. Cela garantit l’adhérence des tissus, et toute cire qui fond fond sur sa propre lame plutôt que sur les lames adjacentes.
  4. Pour réhydrater les sections, immergez les sections cuites dans du xylène deux fois, 5 min chacune (2x 5 min) 100 % d’éthanol pendant 2x 5 min, puis 70 % d’éthanol pendant 1x 5 min. Lavez les lames à l’eau distillée pendant 5 min.
  5. Pour la récupération de l’antigène, immergez les lames dans un récipient contenant 1 tampon EDTA, pH 8, pendant 25 à 30 min dans un bain-marie à 100 °C. Retirez les lames du bain-marie et laissez-les reposer à RT pendant au moins 1 h. Une fois les lames refroidies, lavez-les à l’eau courante du robinet pendant 2 min, puis au TBST (TBS avec 0,01 % de Tween20) pendant 2x 5 min.
  6. À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, tracez un cercle autour des sections des diapositives.
  7. Tremper les peroxydases endogènes en plaçant environ 100 μL de solutionH2O2 à 3 % (diluée dans de l’eau distillée) sur des sections pendant 10 minutes à RT. Laver les lames à l’eau courante du robinet pendant 2 min, puis TBST pendant 2 x 5 min.
  8. Blocs avec environ 100 μL/section de tampon bloquant (albumine sérique bovine (BSA) à 5 % dans le TBST) pendant 30 min à RT.
  9. Égouttez le tampon de blocage en vaporisant doucement l’excès de solution dans le plateau d’incubation. Ajouter environ 100 μL d’anticorps primaire (anti-ERα humain élevé chez le lapin) dans des sections à une dilution de 1:300 (ou à une dilution optimale prédéterminée spécifique à l’anticorps utilisé). Préparer les dilutions d’anticorps dans 1 % de BSA TBST et placer les lames à incuber avec l’anticorps à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Le plateau d’incubation doit être rempli d’eau au fond pour s’assurer que les sections ne sèchent pas pendant la nuit.
  10. Le lendemain matin, lavez les lames avec du TBST pendant 3 x 5 min. Ajoutez environ 100 μL d’anticorps secondaire anti-lapin sur les sections et laissez agir pendant 45 min à RT. Lavez les lames avec du TBST pendant 3 x 5 min.
  11. Dans une hotte, ajoutez environ 100 μL de réactif 3,3'-diaminobenzidine (DAB) sur les sections et maintenez la solution pendant environ 3 minutes par section. Inhibez la réaction DAB en lavant les lames avec de l’eau courante du robinet pendant 10 min.
  12. Contre-teinturez les lames avec de l’hématoxyline pendant 1 min et rincez à l’eau courante du robinet pendant 2 min. Immergez les lames dans l’eau de Scott pendant 1 min, puis rincez-les à l’eau courante du robinet pendant encore 2 min.
  13. Pour déshydrater les sections, immergez-les dans de l’éthanol à 70 % pendant 2 min, de l’éthanol à 100 % pendant 2 x 2 min, puis du xylène pendant 2 x 2 min.
  14. Dans une hotte, montez soigneusement les sections dans du polystyrène xylène phtalate de dibutyle (DPX) et placez une lamelle sur les sections, en veillant à ce que les bulles ne soient pas piégées sur le tissu d’intérêt. Laissez les lames sécher toute la nuit dans la hotte.
  15. Le lendemain, utilisez un scanner de lames pour capturer des images et visualiser la coloration.

Résultats

Pour déterminer l’emplacement pour lequel les tumeurs ERα positives peuvent être clairement visualisées à l’aide de 18F-FES PET, trois cohortes de souris ovariectomisées ont été utilisées dans cette étude (Figure 1). Deux groupes de souris ont reçu une injection de cellules MCF-7 - une lignée cellulaire de cancer du sein ERα positive - soit IMF, soit dans l’épaule. En tant que témoin négatif, une autre cohorte de souris a re?...

Discussion

Ici, nous décrivons l’utilité de la TEP/IRM 18F-FES dans la détection des tumeurs mammaires caractérisées par l’expression de ERα. À titre d’exemple, nous démontrons qu’un endroit où les tumeurs ERα positives peuvent être visualisées est dans l’épaule des souris - ces tumeurs peuvent être clairement identifiées par l’absorption de 18F-SEF, par rapport aux tumeurs situées dans le 4e coussinet adipeux mammaire inguinal (

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Breast Cancer Foundation (IIRS-22-071). Nous reconnaissons le programme de soutien à l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de l’État de Victoria. Cette recherche a également été entreprise à l’aide du Solid Target Laboratory, un partenariat ANSTO-Austin-LICR, également soutenu par le National Imaging Facility et le gouvernement de Victoria. Les auteurs remercient l’Institut de recherche sur le cancer Olivia Newton-John (ONJCRI) pour l’aide scientifique et technique fournie par le National Imaging Facility, une capacité de la Stratégie nationale d’infrastructure de recherche collaborative (NCRIS) de La Trobe-ONJCRI. Les figures 1 et 3 ont été réalisées avec BioRender.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5% Trypsin (10x)Gibco15090-046
27 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringeTerumoSS*05M2713KAFor cell injections
29 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringeTerumoSS*05M2913KAFor estradiol injections
30% H2O2Chem-SupplyHA154Diluted to a 3% working solution with distilled water
Corn oilSigmaC8267
DAB Substrate KitAbcamab64238
Dako anti-rabbit-HRP, 110 mLAligent-DakoK4003Secondary antibody used for IHC
DMEM/F-12 MediumGibco11320033
Dose calibratorCapintec5130-3216
Estradiol SigmaE2758
Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAbCell Signalling Technology#8644Primary antibody used for IHC
FBSBovogenSFBS
Heat element (Infra Red Lamp)Amcal12400For tail vein dilation
MatrigelCorning356225
MultiCell 4 Channel Monitoring kit for triple- or quadruple-mouse imaging chamberMedisoPR-MC900200For monitoring of mouse respiration
NanoScan PET/MRI 3T SystemMedisoPR-RD000000For PET/MRI acquistion
PBS (1x)Gibco14190-144
TBSTThermoFisher#28360Wash buffer for IHC
Three mice imaging chamberMedisoPR-MC407300For PET/MRI acquistion

Références

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