Utilizzo della PET 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiolo per visualizzare l'espressione del recettore degli estrogeni α negli xenotrapianti di carcinoma mammario umano in topi femmina ovariectomizzati

Riepilogo

Qui, dimostriamo un protocollo per utilizzare la tomografia a emissione di positroni (PET) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiolo (¹⁸F-FES) come strumento per visualizzare l'espressione di ERα in xenotrapianti mammari ERα-positivi.

Abstract

Per dimostrare come gli xenotrapianti di carcinoma mammario positivi al recettore degli estrogeni alfa (ERα) possano essere visualizzati in topi nudi BALB/c utilizzando la tomografia a emissione di positroni (PET) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiolo (¹⁸F-FES), i topi nudi BALB/c ovariectomizzati sono stati iniettati con cellule di carcinoma mammario ERα-positive (MCF-7, 3 × 10⁶ cellule; spalla [n = 10] o 4^° cuscinetto adiposo mammario inguinale [n = 10]) o cellule di carcinoma mammario ERα-negativo (MDA-MB-231, 1 × 10⁶ celle; cuscinetto adiposo mammario [n = 5]). I topi che ospitavano cellule MCF-7 hanno ricevuto iniezioni sottocutanee di 20 μg di 17β-estradiolo (20 μg/20 μL; olio di mais: etanolo, 9:1) nella nuca 2 giorni prima dell'iniezione cellulare, seguite da iniezioni giornaliere cinque volte alla settimana per 5 settimane. I volumi tumorali sono stati misurati secondo la formula: (L*W²)/2 (L; lunghezza, W; larghezza). Una volta che i volumi tumorali hanno raggiunto circa 100 mm³, le iniezioni di 17β-estradiolo sono state interrotte 2 giorni prima che i topi ricevessero ¹⁸F-FES per l'imaging PET per evitare il legame competitivo con ERα. Dopo la somministrazione di ¹⁸F-FES attraverso la vena di coda laterale, la PET/MRI è stata eseguita per 15 minuti da 1 ora a 1,5 ore dopo l'iniezione. ¹⁸L'assorbimento di F-FES non è stato osservato nei topi ERα-negativi, MDA-MB-231 portatori di tumore. ¹⁸L'assorbimento di F-FES è stato più pronunciato nei topi che ospitano tumori MCF-7 nella spalla. Nei tumori MCF-7 cresciuti nel cuscinetto adiposo mammario inguinale, l'assorbimento di ¹⁸F-FES era meno visibile, poiché il pattern di escrezione intestinale di ¹⁸F-FES oscurava la radioattività rilevabile in questi tumori. Per utilizzare ¹⁸F-FES PET come strumento per visualizzare l'espressione di ERα in xenotrapianti mammari ERα-positivi, dimostriamo che la visibilità della captazione di ¹⁸F-FES è chiara nei tumori situati lontano dalla regione addominale dei topi, come nella spalla.

Introduzione

I tumori della mammella (BC) possono essere stratificati in diversi sottotipi molecolari¹. I tumori della mammella classificati come sottotipo luminale sovraesprimono il recettore alfa degli estrogeni (ERα). In quanto tale, questo sottotipo di BC è anche indicato come ERα-positivo (ERα⁺). Fortunatamente, quelli con diagnosi di ERα⁺ BC sperimentano la più alta sopravvivenza a 10 anni unita a bassi tassi di metastasi a distanza ^2,3. A causa dell'espressione di ERα, tali pazienti hanno accesso a una serie di opzioni di terapia ormonale, tra cui modulatori selettivi del recettore degli estrogeni (SERM), farmaci anti-estrogeni e inibitori dell'aromatasi⁴.

Per valutare se una paziente con carcinoma mammario è idonea alla terapia ormonale, è necessario determinare i livelli di espressione di ERα all'interno dei tumori al seno ^5,6,7. Sebbene il gold standard dei test sia condotto utilizzando metodi di immunoistochimica (IHC), molti rapporti evidenziano il problema sia della riproducibilità che dell'affidabilità dei risultati ottenuti ^6,8,9. L'IHC può dare origine a discordanza dei risultati poiché la tecnica è di natura semi-quantitativa, dove le differenze nella lavorazione dei tessuti e nella successiva interpretazione possono portare alla variabilità⁶. Per correggere questo problema ricorrente, nel 2010 sono state stabilite delle linee guida e aggiornate nel 2020 dall'American Society of Clinical Oncology con l'intenzione di ridurre la variazione interosservatore¹⁰. Attualmente, il cut-off clinicamente validato si attesta al ≥1%, con l'espressione di ERα anche a livelli di espressione molto piccoli che dimostrano benefici clinicamente significativi utilizzando la terapia endocrina¹¹.

Nel BC avanzato, l'espressione di ERα può differire tra le metastasi e il tumore primario. Alcune osservazioni riportano una discrepanza del 18%-55% nei livelli di espressione di ERα tra le lesioni metastatiche e il tumore primitivo, sottolineando l'importanza di determinare lo stato di ERα delle metastasi BC¹². Per affrontare questo problema, le linee guida evidenziano l'importanza di confermare lo stato del recettore ormonale nelle lesioni metastatiche per elaborare piani di trattamento informati^13,14. Tuttavia, la fattibilità di ciò è discutibile, in particolare attraverso i metodi IHC, considerando che le metastasi possono esistere in luoghi da cui è difficile prelevare biopsie.

I metodi di imaging molecolare sono diventati strumenti essenziali per il rilevamento e la visualizzazione delle lesioni tumorali nei pazienti oncologici. In particolare, l'imaging con tomografia a emissione di positroni (PET) richiede l'uso di traccianti o, più specificamente, di radiofarmaci, che sono progettati per sfruttare alcune caratteristiche dei tumori con l'intento di visualizzare queste lesioni in modo non invasivo. Il tracciante PET più comune utilizzato in oncologia è il ¹⁸F-fluorodesossiglucosio (¹⁸F-FDG)¹⁵. In questo studio, esploriamo l'uso di una forma radiomarcata di estradiolo, ^{il 18}F-fluoroestradiolo (¹⁸F-FES). L'estradiolo - un ligando per l'ERα - è un ormone prodotto prevalentemente dalle ovaie nelle femmine¹⁶. ¹⁸L'F-FES ha ricevuto una recente approvazione dalla Food and Drug Administration (FDA) ed è commercializzato con il nome di Cerianna^TM. Questo agente di imaging è progettato per essere utilizzato in aggiunta alle biopsie in pazienti con BC¹⁷ ricorrente o metastatico. L'imaging PET di tutto il corpo con ¹⁸F-FES può essere utilizzato come metodo non invasivo per rilevare i livelli di ERα sia nel tumore primario che nelle metastasi a distanza in regioni da cui è difficile ottenere biopsie¹⁸. La previsione dei livelli di ERα utilizzando ^{l'imaging PET 18}F-FES è correlata ai risultati IHC e, inoltre, un rilevamento minimo o nullo di ERα utilizzando ^{l'imaging PET 18}F-FES è un predittore affidabile di tumori che difficilmente rispondono alla terapia ormonale¹⁸. Per garantire l'uso appropriato di ¹⁸F-FES in clinica, le linee guida sono state formulate attraverso il consenso di esperti del settore¹⁹. In questo studio, valutiamo l'uso di ¹⁸F-FES PET in modelli preclinici di cancro al seno nei topi.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Austin Hospital Animal Ethics Committee (A2023/05812) e condotti in conformità con il Codice australiano per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici.

1. Preparazione delle cellule

1. Utilizzando le procedure di routine di coltura cellulare, mantenere le cellule MDA-MB-231 e MCF-7 in DMEM/F-12 integrate con penicillina/streptomicina e il 10% di siero fetale bovino (FBS) in fiasche di coltura tissutale T175. Prima di preparare le cellule per l'iniezione, far passare le cellule almeno 3 volte dopo la rianimazione dalle riserve di azoto liquido. Far crescere le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Propagare le cellule in modo tale che il giorno della preparazione delle cellule per l'iniezione, ci siano 3 × 10⁶ cellule MCF-7 per iniezione per topo per 15 topi (cioè almeno 45 × 10⁶ cellule MCF-7) e 1 ×^{10 6} cellule MDA-MB-231 per iniezione per topo per 5 topi (cioè almeno 5 × 10⁶ cellule MDA-MB-231).
   NOTA: Per consentire un numero uguale di cellule in ciascun topo, preparare un numero sufficiente di cellule per cinque iniezioni extra (ad esempio, preparare abbastanza cellule per 10 iniezioni per iniettare cinque topi).
3. Il giorno dell'iniezione cellulare, rimuovere il terreno da tutti i flaconi e posizionare circa 5 mL di tripsina-EDTA (0,25% tripsina e 0,05% EDTA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4) sulle cellule per facilitare il distacco delle cellule.
4. Una volta che le cellule si sono staccate, posizionare circa 10 mL di terreno completo in fiasche per inibire l'attività della tripsina. Risospendere le cellule e trasferire la sospensione a cellula singola in una provetta da 50 mL. Centrifugare a ~300 × g per 2 minuti fino a formare celle a pellet.
5. Risospendere il pellet di cellule in un volume appropriato di terreno e contare le cellule per determinare il numero totale di cellule raccolte.
   NOTA: Cercare di contare soluzioni di circa 1 × 10⁶ cellule per mL (50-100 cellule per 16 quadrati se si utilizza una camera di conteggio). Per le cellule che crescono a 5 × 10⁶ per matraccio pieno, raccogliere le cellule in 5 ml di terreno. Per linee cellulari con densità più elevata, utilizzare 10 mL di terreno per pallone.
6. Eseguire questo passaggio sul ghiaccio in una cappa a flusso laminare sterile. Una volta raggiunto questo numero, centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 300 × g per 2 minuti fino a formare celle a pellet. Risospendere il pellet in PBS freddo e in una soluzione di matrice di membrana basale ghiacciata in modo tale che per 3 × 10^{celle 6} MCF-7 ci siano 40 μL di PBS e 10 μL di soluzione di matrice di membrana basale.
7. Risospendere il pellet di cellule MDA-MB-231 con gli stessi costituenti in modo tale che per 1 × 10⁶ celle, ci siano 40 μL di PBS e 10 μL di soluzione di matrice a membrana basale. Trasferire la miscela di matrice di membrana cellula-PBS-basale dalla provetta da 50 mL in provette più piccole da 1,5 mL con una punta di pipetta fredda e mantenere la miscela cellulare sul ghiaccio appena prima dell'iniezione di cellule nei topi.
   NOTA: La matrice della membrana basale utilizzata in questo studio è conservata a -20 °C. Il giorno prima che sia necessaria la soluzione della matrice a membrana basale, un'aliquota della soluzione viene posta a 4 °C per lo scongelamento notturno. Il giorno successivo, è pronto per l'uso a basse temperature (su ghiaccio). Quando si pipetta la soluzione, assicurarsi che i puntali delle pipette utilizzati siano freddi per evitare che la soluzione della matrice della membrana basale si solidifichi. È buona norma conservare una scatola di puntali per pipette sterili in frigorifero prima del giorno della preparazione delle cellule per l'iniezione. Quando si risospensione il pellet cellulare in PBS ghiacciato e in una soluzione di matrice a membrana basale, viene aggiunto prima il PBS, seguito dalla quantità richiesta di soluzione di matrice a membrana basale.

2. Iniezione di cellule in topi ovariectomizzati

1. Consentire a topi nudi femmina ovariectomizzati BALB/c di 6-8 settimane di acclimatarsi presso la struttura di stabulazione per almeno 1 settimana prima dell'iniezione cellulare.
   NOTA: Questo studio ha avuto accesso a topi più anziani, di 12-14 settimane. L'ovariectomia garantisce bassi livelli di estradiolo endogeno e riduce la competizione con il ligando ¹⁸F-FES. A seconda del modello studiato, i topi più giovani (ad esempio, 4-8 settimane) potrebbero non aver bisogno di sottoporsi a ovariectomia a causa dei livelli più bassi di estradiolo endogeno^20,21.
2. Indurre l'anestesia in un topo con isoflurano al 4% e ossigeno a una velocità di 4 L/min utilizzando una camera di induzione dell'anestesia. Osservare il mouse e verificare la perdita del riflesso raddrizzante. Una volta che non si muovono più, trasferire il topo in una cabina a flusso laminare sterile, posizionare il muso nella maschera nasale e mantenere l'anestesia regolando l'isoflurano al 2% e l'ossigeno a una velocità di 2 L/min.
   NOTA: Anestetizzare un topo alla volta per garantire una cura ottimale.
3. Per le iniezioni di cuscinetto adiposo intramammario (IMF), tamponare la pelle sopra la^4a ghiandola mammaria inguinale con alcol. Utilizzare una siringa da 27 G pre-raffreddata (su ghiaccio) per aspirare la sospensione a celle fredde e lasciare la siringa sul ghiaccio per evitare il riscaldamento/solidificazione della soluzione della matrice della membrana basale prima dell'iniezione.
4. Utilizzando il pollice e l'indice della mano non dominante, sollevare delicatamente la 4a ghiandola^mammaria e inserire un ago da siringa da 27 G con la mano dominante, assicurandosi che lo smusso dell'ago sia rivolto verso l'alto. Iniettare lentamente 50 μl della sospensione cellulare contenente la miscela di soluzione cellula-PBS-matrice della membrana basale nel cuscinetto adiposo mammario.
   NOTA: Una bolla deve essere avvertita tra le dita durante l'iniezione delle cellule. Verificare la presenza di eventuali perdite nel sito di iniezione.
5. Una volta completata l'iniezione, spegnere l'isoflurano e tenere il muso del topo nel cono del naso per respirare ossigeno e riprendere conoscenza (questo dovrebbe richiedere circa un minuto). Rimetti il mouse in una gabbia su un termoforo per un recupero ottimale.
6. Per le iniezioni alla spalla, utilizzare la procedura sopra descritta per l'iniezione IMF, l'unica differenza è la posizione dell'iniezione cellulare.
   NOTA: In alternativa, l'iniezione alla spalla può essere completata senza anestesia (vedere il passaggio 2.7 di seguito).
7. Per l'iniezione della spalla senza anestesia, tenere e sollevare la pelle sopra la spalla del topo usando la mano non dominante tra il pollice e l'indice, formando una "tenda" nella pelle. Iniettare lentamente 50 μl di sospensione cellulare contenente la soluzione di matrice di membrana cellule-PBS-basale utilizzando un ago siringa da 27 G. Estrarre delicatamente l'ago e verificare la presenza di perdite.
   NOTA: In alternativa, una siringa Hamilton può essere utilizzata per iniezioni di piccoli volumi per garantire l'accuratezza dell'erogazione del volume. Tra un'iniezione e l'altra, l'etanolo all'80% v/v viene utilizzato per risciacquare la siringa quando si utilizzano diverse linee cellulari e il PBS viene utilizzato per sciacquare e rimuovere l'etanolo residuo dalla siringa.

3. Preparazione della soluzione di estradiolo

1. Utilizzando una bilancia in grado di misurare con precisione i milligrammi di una sostanza, pesare 7 mg di polvere di estradiolo in una provetta da 1,5 ml.
2. Aggiungere 700 μl di etanolo al 100% in 7 mg di polvere di estradiolo. Posizionare la provetta da 1,5 ml su un agitatore delicato per circa 1 ora a temperatura ambiente (RT) o fino a quando la polvere di estradiolo non si è completamente dissolta.
3. Aliquotare la soluzione in dieci provette da 1,5 mL, ciascuna contenente 70 μL di soluzione di etanolo-estradiolo. Posizionare le provette a -20 °C per un uso futuro.
   NOTA: Le scorte di estradiolo-etanolo possono essere mantenute a -20 °C per circa 2 settimane.

4. Iniezione sottocutanea di soluzione di estradiolo

1. Il giorno in cui è necessaria un'iniezione di estradiolo, preparare la seguente miscela fresca. Unire 630 μL di olio di mais come veicolo nella provetta da 1,5 mL contenente 70 μL di soluzione etanolo-estradiolo. Agitare la soluzione fino a renderla omogenea, assicurandosi che l'etanolo non si separi e formi uno strato nella parte superiore dell'olio del veicolo.
   NOTA: Questo produce 700 μL di una soluzione 9:1 da 20 μg/20 μL di olio di mais:etanolo. Ogni topo riceve 20 μl di questa soluzione. Preparare sempre una soluzione extra poiché l'olio nella miscela tende ad aderire all'esterno della siringa e ai lati di una provetta da 1,5 ml a causa della sua viscosità (ad esempio, per 20 topi, anche se 400 μl sarebbero sufficienti, fare quasi il doppio della quantità (700 μl) offre spazio sufficiente per l'errore).
2. Utilizzando un ago da 29 G collegato a una siringa da insulina, aspirare lentamente 20 μL di soluzione di estradiolo.
   NOTA: Poiché la soluzione contiene 9 parti di olio e 1 parte di estradiolo-etanolo, la miscela impiegherà del tempo per essere aspirata nella siringa.
3. I topi a cui iniettare una soluzione di estradiolo sono quelli che ospitano tumori che esprimono ERα e, quindi, si affidano agli estrogeni per crescere (MCF-7 in questo studio). I topi che ospitano tumori che non esprimono ERα (MDA-MB-231 in questo studio) non ricevono una soluzione di estradiolo. Posizionare delicatamente il mouse da iniettare davanti, preferibilmente su un asciugamano, per evitare di ferirsi agli arti durante la trattenuta.
4. Usando la mano non dominante, trattieni il topo tenendo la parte superiore della coda tra l'anulare e il mignolo. Utilizzare il pollice e l'indice per sollevare la pelle flaccida vicino al collo del topo per formare una "tenda" nella pelle per l'iniezione sottocutanea della soluzione di estradiolo.
5. Mantenendo il topo in questa contenzione, usare la mano dominante per iniettare al topo la soluzione di estradiolo. Con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto, spingere l'ago sotto la "tenda" della pelle fino a quando non è visibile meno della metà dell'ago.
   NOTA: Quando la soluzione viene iniettata, la pelle dovrebbe fuoriuscire visibilmente.
6. Per evitare qualsiasi riflusso della soluzione, tenere l'ago sotto la pelle per alcuni secondi. In caso di riflusso, asciugare delicatamente l'area con un fazzoletto per rimuovere la soluzione residua.
   NOTA: In alcuni esperimenti, l'estradiolo combinato con l'olio di sesamo è stato utilizzato per somministrare l'ormone. L'uso dell'olio di sesamo come veicolo porta a un'infiammazione locale sotto la pelle nei siti di iniezione dell'estradiolo. Pertanto, l'olio di mais è stato scelto come veicolo per esperimenti successivi, in cui i segni di infiammazione nei siti di iniezione dell'estradiolo erano assenti o minimi²². Per ulteriori dettagli, vedere la discussione.
7. Dopo aver rimosso l'ago, tamponare delicatamente il sito di iniezione con un antisettico topico utilizzando un batuffolo di cotone. Questo per prevenire l'infiammazione sulla superficie nel sito di iniezione dovuta all'inserimento/rimozione dell'ago attraverso la pelle del topo.
8. Iniettare i topi che ospitano tumori che esprimono ERα (MCF-7) con iniezioni di estradiolo per via sottocutanea 3 giorni prima dell'iniezione cellulare, seguite da 5 volte a settimana per 5 settimane (Figura 1). Interrompere le iniezioni di estradiolo 2 giorni prima del giorno dell'imaging per evitare il legame competitivo con la sonda ¹⁸F-FES al suo bersaglio, ERα.
   NOTA: In questo studio, i topi che ospitavano tumori MCF-7 sono stati iniettati con estradiolo ogni giorno dal lunedì al venerdì. Se dovessero essere esaminati la settimana successiva, di mercoledì, le iniezioni di estradiolo continuavano il sabato e la domenica. L'estradiolo non è stato somministrato lunedì e martedì prima che i topi venissero sottoposti a imaging mercoledì.

5. ¹⁸F-FES PET e risonanza magnetica di topi ovariectomizzati

ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione quando si maneggia la radioattività. Seguire tutte le procedure normative applicabili quando si maneggia la radioattività.

1. Pesa il mouse e registra il suo peso.
2. Per questo studio, ¹⁸F-FES è stato sintetizzato e formulato a un grado clinico²³ (ottenuto dal Dipartimento di Imaging e Terapia Molecolare, Austin Health) per l'uso in modelli animali. Diluire ¹⁸F-FES (emivita radioattiva di 109 min) in una soluzione salina di etanolo al 10% p/v a una concentrazione di iniezione corretta per il decadimento regolata di circa 150-300 μCi/100 μL.
   NOTA: Un'attività specifica di 1000 Ci/mmol è sufficiente per l'imaging PET in vivo di ERα²⁴ e i ¹⁸F-FES ricevuti avevano un'attività specifica superiore a questo valore basale.
3. Aspirare 100 μl con una siringa da insulina con un ago da 29 G. Utilizzare un calibratore di dose per misurare e registrare la dose e il tempo di radioattività. Posizionare la siringa dietro una protezione di piombo fino al momento dell'iniezione.
   NOTA: Misurare la quantità di ^{radioattività 18}F-FES in ciascuna dose con un calibratore di dose. Il calibratore di dose deve essere calibrato rispetto a un materiale di riferimento standard, come il cesio-137, secondo il protocollo del produttore. Il tempo della lettura è importante da registrare per determinare la correzione del decadimento. Assicurarsi che l'ora mostrata sul calibratore corrisponda all'ora sul computer utilizzato per l'acquisizione PET.
4. Per dilatare le vene della coda per l'iniezione endovenosa, posizionare il mouse sotto un elemento riscaldante a una distanza di 30 cm per 2 minuti. Pulire la coda con etanolo al 70% p/v per disinfettare l'area prima dell'iniezione.
5. Somministrare 100 μl di ¹⁸F-FES (l'intero volume nella siringa) con un'iniezione in bolo attraverso la vena caudale laterale e registrare il tempo di iniezione. Premere il sito di iniezione con un fazzoletto per fermare il sanguinamento della vena caudale.
6. Misurare la dose rimanente nella siringa e il tessuto utilizzando il calibratore di dose e registrare la misurazione e il tempo. Iniettare topi sfalsati in lotti di due per consentire l'imaging utilizzando la multicamera.
   NOTA: Nella siringa rimarrà una sonda del po'. L'uso di siringhe da insulina è preferito rispetto alle siringhe collegate agli aghi tramite luer lock a causa della diminuzione del volume di dose intrappolato nella siringa/ago dopo la somministrazione dell'iniezione. Inoltre, viene misurata la radioattività nel tessuto che viene utilizzata per fermare qualsiasi sanguinamento che può verificarsi dopo l'iniezione endovenosa della sonda. Questo perché il riflusso di sangue assorbito dal tessuto può contenere una certa radioattività da ¹⁸F-FES. Inoltre, il tempo impiegato per riscaldare le vene laterali della coda dipenderà da variabili come l'intensità della fonte di calore e la sua vicinanza ai topi. Per le lampade termiche standard, potrebbero essere necessari fino a 15 minuti prima che le vene si dilatano. I topi devono essere attentamente monitorati per rilevare eventuali segni di surriscaldamento e, se necessario, rimossi dalla fonte di riscaldamento tra un'iniezione e l'altra.
7. Per i topi che sono assegnati al sonno dopo l'iniezione, posizionare il topo iniettato nella camera di anestesia mantenuta sotto un livello di mantenimento di isoflurano (2%-2,5%) e ossigeno (2 L/min) per 1 ora su un termoforo per consentire la distribuzione della sonda attraverso la circolazione sistemica del topo prima della scansione PET. Lasciare che gli altri topi del gruppo camminino liberamente nella loro gabbia per 1-1,5 ore fino alla scansione PET.
8. Dopo 1-1,5 ore, posizionare il topo in una camera di imaging in anestesia con isoflurano a cono di naso. Accendere il riscaldatore del letto a 32 °C, selezionare una configurazione multicamera e accendere il sistema di monitoraggio respiratorio. Posizionare i due mouse da riprendere in posizione prona. Posizionare la camera di imaging nella macchina PET/MRI.
9. Monitora la respirazione del mouse durante l'acquisizione dell'immagine. Utilizzare una tabella respiratoria per garantire 60-80 respiri al minuto in qualsiasi momento durante la scansione. Se la frequenza respiratoria scende al di sotto o al di sopra dell'intervallo desiderato, regolare la dose di isoflurano secondo necessità.
   NOTA: La respirazione dell'animale può essere monitorata grazie alla presenza di un sensore nella camera di imaging.
10. Abbina un'acquisizione PET statica di 15 minuti con una risonanza magnetica assiale 3D con eco a gradiente (GRE). Vedi sotto per i parametri di acquisizione:
    1. Per impostare il protocollo PET, aprire la finestra Editor Radiofarmaci nel relativo software. Specificare l'isotopo utilizzato, l'attività della siringa (MBq), il tempo di iniezione e l'attività applicata (MBq) e il peso corporeo. Tutti questi parametri sono essenziali per aiutare a calcolare e quantificare l'assorbimento della sonda nel tessuto di interesse.
    2. Per assicurarsi che il mouse sia posizionato correttamente per l'imaging, utilizzare una sequenza 2D Scout (fronte e retro) per determinare il campo visivo PET. Procedere ad un'acquisizione statica PET di 15 minuti utilizzando una finestra di energia di 400-600 keV, modalità di coincidenza di 1-5,5 ns. Eseguire una risonanza magnetica assiale GRE3D per circa 27 minuti.
11. Ricostruire le immagini acquisite utilizzando i relativi software.
    1. Esegui la ricostruzione statica dell'immagine PET/MRI e utilizza il pianificatore geometrico per modificare l'area di ricostruzione per assicurarti che copra l'intero topo, garantendo un tempo di ricostruzione ottimale.
    2. Nella finestra Identificazione risultati , impostare le correzioni casuali, la correzione dell'attenuazione (CA) + dispersione, l'intervallo di posizione su On. Impostare il tempo di riferimento del decadimento su ADMIN. Impostare la soglia dell'aria corporea al 30% e basare la correzione dell'attenuazione sulla mappa dei materiali.
12. Utilizzare il software pertinente per la separazione di immagini multicamera, la co-registrazione e per disegnare le regioni di interesse (ROI). Per la co-registrazione, riallineare la risonanza magnetica per adattarla alla PET e ricostruire l'immagine PET.
13. Per separare le immagini multicamera, fare clic su Elaborazione > segmentazione delle immagini > Separatore alberghiero. Attiva la modalità scientifica e regola i parametri di soglia e volume secondo necessità fino a trovare 2 oggetti.
14. Inserire la dose al momento dell'iniezione dopo aver tenuto conto dell'eventuale dose residua rimasta nella siringa per convertire i dati PET nell'unità di dose percentuale iniettata per grammo (%ID/g) o inserire inoltre il peso del soggetto per convertire i dati PET nell'unità del valore di assorbimento standardizzato (SUV). Esegui questa conversione facendo clic con il pulsante destro del mouse sul set di dati PET e individuando il campo %ID/g nella scheda Informazioni di base . Immettere il %ID/g registrato in precedenza.
15. Per disegnare le ROI sulle sezioni del tumore, fare clic sulla scheda Misurazioni sul lato sinistro della finestra del programma. Disegna il ROI con lo strumento poligono o a mano libera . Disegna con cura intorno alla circonferenza del tumore, assicurandoti che l'azione venga eseguita mentre l'immagine PET è nella finestra attiva (controlla usando Fn-A). Il risultato fornisce un valore del ROI come %ID/g.
    NOTA: L'analisi del ROI fornisce una buona stima della %ID/g. Una telecamera ben calibrata dovrebbe fornire una precisione del ±5% rispetto ai dati di biodistribuzione ex vivo .

6. Prelievo e fissaggio del tessuto tumorale per l'immunoistochimica

1. Al punto finale sperimentale, sopprimere il topo utilizzando l'inalazione letale di isoflurano al 4%-5% o l'inalazione eccessiva di CO₂.
2. Usando forbici e pinzette chirurgiche, crea con cura una piccola incisione vicino alla superficie del tumore e reseca il tessuto tumorale. Se la pelle è attaccata al tessuto tumorale, utilizzare una lama di bisturi per separare delicatamente la pelle dal tumore.
3. Mettere il tessuto tumorale in un flaconcino da 5 mL contenente circa 3 mL di formalina tamponata neutra al 10%. Assicurarsi che l'intero tessuto sia coperto di soluzione per facilitare la fissazione dei tessuti. Tenere il fazzoletto immerso in formalina per 24 ore.
4. Il giorno seguente, trasferire il tessuto tumorale fissato in una fiala da 5 ml contenente il 70% di etanolo. Etichettare una cassetta di tessuto specifica per il tessuto tumorale in preparazione per l'inclusione della paraffina.
5. Posizionare il tessuto tumorale in una cassetta di fazzoletti e conservarlo in una soluzione di etanolo al 70% fino all'inclusione della paraffina.
   NOTA: In questo studio, l'inclusione della paraffina è stata condotta da anatomi patologi di Austin Health.

7. Immunoistochimica per la rilevazione del recettore degli estrogeni alfa (ERα)

1. Utilizzando un microtomo, tagliare sezioni spesse 4 μm del tessuto tumorale necessario per la colorazione, seguendo le procedure standard.
2. Posizionare i vetrini del microscopio con sezioni tumorali tagliate in un rack per vetrini e posizionare il rack in un forno a 37 °C per asciugare durante la notte e per garantire che i tessuti aderiscano ai vetrini prima della colorazione.
3. La mattina successiva, posizionare la griglia con i vetrini contenenti le sezioni tumorali tagliate in un forno a 60 °C per 30 minuti per facilitare il processo di deceratura.
   NOTA: Le guide di vetro devono essere rivolte verso l'alto durante la cottura. Ciò garantisce l'aderenza dei tessuti e l'eventuale cera che si scioglie si scioglie sul proprio vetrino piuttosto che sui vetrini adiacenti.
4. Per reidratare le sezioni, immergere le sezioni cotte nello xilene due volte, 5 minuti ciascuna (2x 5 min) etanolo al 100% per 2x 5 minuti e poi etanolo al 70% per 1x 5 minuti. Lavare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti.
5. Per il recupero dell'antigene, immergere i vetrini in un contenitore di 1 tampone EDTA, pH 8, per 25-30 minuti in un bagno d'acqua a 100 °C. Rimuovere i vetrini dal bagnomaria e lasciarli riposare a RT per almeno 1 ora. Una volta che i vetrini si sono raffreddati, lavarli in acqua corrente per 2 minuti e poi TBST (TBS con 0,01% Tween20) per 2x 5 minuti.
6. Usando un pennarello barriera idrofobico, disegna un cerchio attorno alle sezioni dei vetrini.
7. Estinguere le perossidasi endogene posizionando circa 100 μl di soluzione al 3% di H₂O₂ (diluita in acqua distillata) su sezioni per 10 minuti a RT. Lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per 2 minuti e poi TBST per 2x 5 minuti.
8. Bloccare le sezioni con circa 100 μL/sezione di tampone bloccante (5% di albumina sierica bovina (BSA) in TBST) per 30 minuti a RT.
9. Scolare il tampone bloccante versando delicatamente la soluzione in eccesso nel vassoio di incubazione. Aggiungere circa 100 μl di anticorpo primario (anti-ERα umano allevato nel coniglio) alle sezioni con una diluizione di 1:300 (o alla diluizione ottimale predeterminata specifica per l'anticorpo utilizzato). Preparare le diluizioni degli anticorpi in BSA TBST all'1% e posizionare i vetrini per incubare con l'anticorpo a 4 °C per una notte.
   NOTA: Il vassoio di incubazione deve essere riempito d'acqua sul fondo per garantire che le sezioni non si asciughino durante la notte.
10. La mattina successiva, lavare i vetrini con TBST per 3x 5 minuti. Aggiungere circa 100 μL di anticorpo secondario anti-coniglio sulle sezioni e lasciare in posa per 45 minuti a RT. Lavare i vetrini con TBST per 3 x 5 minuti.
11. In una cappa aspirante, aggiungere circa 100 μl di reagente 3,3'-diaminobenzidina (DAB) sulle sezioni e mantenere la soluzione per circa 3 minuti per sezione. Inibire la reazione DAB lavando i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 10 minuti.
12. Controcolorare i vetrini con ematossilina per 1 minuto e sciacquare con acqua corrente del rubinetto per 2 minuti. Immergere gli scivoli nell'acqua di Scott per 1 minuto, quindi sciacquare con acqua corrente del rubinetto per altri 2 minuti.
13. Per disidratare le sezioni, immergere le sezioni in etanolo al 70% per 2 minuti, etanolo al 100% per 2x 2 minuti e poi xilene per 2x 2 minuti.
14. In una cappa aspirante, montare con cura le sezioni in polistirene xilene dibutilftalato (DPX) e posizionare un vetrino coprioggetti sulle sezioni, assicurandosi che le bolle non rimangano intrappolate sul tessuto di interesse. Lasciare asciugare i vetrini per una notte nella cappa aspirante.
15. Il giorno seguente, utilizzare uno scanner per vetrini per acquisire immagini e visualizzare la colorazione.

Risultati

Per determinare la posizione per la quale i tumori ERα positivi possono essere chiaramente visualizzati utilizzando ¹⁸F-FES PET, in questo studio sono state utilizzate tre coorti di topi ovariectomizzati (Figura 1). Due gruppi di topi sono stati iniettati con cellule MCF-7 - una linea cellulare di carcinoma mammario ERα positivo - IMF o nella spalla. Come controllo negativo, un'altra coorte di topi è stata iniettata con cellule MDA-MB-231, una ...

Discussione

Qui, descriviamo l'utilità di ¹⁸F-FES PET/MRI nel rilevamento di tumori mammari caratterizzati dall'espressione di ERα. Ad esempio, dimostriamo che una posizione in cui è possibile visualizzare i tumori ERα positivi è nella spalla dei topi: questi tumori possono essere chiaramente identificati dalla captazione di ¹⁸F-FES, rispetto ai tumori situati all'interno del 4° cuscinetto adiposo mammario inguinale (Figura 4).

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046
27 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringe	Terumo	SS*05M2713KA	For cell injections
29 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringe	Terumo	SS*05M2913KA	For estradiol injections
30% H2O2	Chem-Supply	HA154	Diluted to a 3% working solution with distilled water
Corn oil	Sigma	C8267
DAB Substrate Kit	Abcam	ab64238
Dako anti-rabbit-HRP, 110 mL	Aligent-Dako	K4003	Secondary antibody used for IHC
DMEM/F-12 Medium	Gibco	11320033
Dose calibrator	Capintec	5130-3216
Estradiol	Sigma	E2758
Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	#8644	Primary antibody used for IHC
FBS	Bovogen	SFBS
Heat element (Infra Red Lamp)	Amcal	12400	For tail vein dilation
Matrigel	Corning	356225
MultiCell 4 Channel Monitoring kit for triple- or quadruple-mouse imaging chamber	Mediso	PR-MC900200	For monitoring of mouse respiration
NanoScan PET/MRI 3T System	Mediso	PR-RD000000	For PET/MRI acquistion
PBS (1x)	Gibco	14190-144
TBST	ThermoFisher	#28360	Wash buffer for IHC
Three mice imaging chamber	Mediso	PR-MC407300	For PET/MRI acquistion