АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы демонстрируем протокол использования 16α-[18F]-фтор-17β-эстрадиола (18F-FES) позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) в качестве инструмента для визуализации экспрессии ERα в ERα-положительных ксенотрансплантатах молочной железы.

Аннотация

Чтобы продемонстрировать, как ксенотрансплантаты рецептора эстрогена альфа (ERα) могут быть визуализированы у обнаженных мышей BALB/c с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) 16α-[18F]-фтор-17β-эстрадиола (18F-FES), овариэктомированным голым мышам BALB/c вводили ERα-положительные клетки рака молочной железы (MCF-7, 3 × 106 клеток; плечо [n = 10] или4-й паховый жировой пакет молочной железы [n = 10]) или ERα-отрицательные клетки рака молочной железы (MDA-MB-231, 1 × 106 ячеек; жировая подушка для молочных желез [n = 5]). Мыши, у которых были клетки MCF-7, получали подкожные инъекции 20 мкг 17β-эстрадиола (20 мкг/20 мкл; кукурузное масло: этанол, 9:1) в затылок за 2 дня до инъекции клеток, а затем ежедневные инъекции пять раз в неделю в течение 5 недель. Объемы опухолей измеряли по формуле: (Д*Ш2)/2 (Д; длина, Ш; ширина). После того, как объем опухоли достигал приблизительно 100мм3, инъекции 17β-эстрадиола прекращали за 2 дня до того, как мыши получали 18F-FES для ПЭТ-визуализации, чтобы избежать конкурентного связывания с ERα. После введения 18F-FES через боковую хвостовую вену ПЭТ/МРТ проводили в течение 15 мин через 1 ч - 1,5 ч после инъекции. 18Поглощение F-FES не наблюдалось у ERα-отрицательных мышей с опухолью MDA-MB-231. 18Поглощение F-FES было наиболее выраженным у мышей с опухолями MCF-7 в плече. В опухолях MCF-7, выращенных в паховом жировом пакете молочной железы, поглощение 18F-FES было менее заметным, так как кишечная экскреция 18F-FES скрывала радиоактивность, обнаруживаемую в этих опухолях. Чтобы использовать 18F-FES PET в качестве инструмента для визуализации экспрессии ERα в ERα-положительных ксенотрансплантатах молочной железы, мы демонстрируем, что видимость поглощения 18F-FES четко прослеживается в опухолях, расположенных вдали от брюшной области мышей, например, в плече.

Введение

Рак молочной железы (РМЖ) может быть стратифицирован на различные молекулярные подтипы1. Опухоли молочной железы, которые классифицируются как люминальный подтип сверхэкспрессии рецептора эстрогена альфа (ERα). Таким образом, этот подтип РМЖ также относят к ERα-положительным (ERα+). К счастью, пациенты с диагнозом ERα+ BC имеют самую высокую 10-летнюю выживаемость в сочетании с низкими показателями отдаленного метастазирования 2,3. Благодаря экспрессии ERα такие пациенты имеют доступ к набору вариантов гормональной терапии, включая селективные модуляторы рецепторов эстрогена (СМРЭ), антиэстрогенные препараты и ингибиторы ароматазы4.

Чтобы оценить, подходит ли пациентка с раком молочной железы для гормональной терапии, необходимо определить уровни экспрессии ERα в опухолях молочной железы 5,6,7. В то время как золотой стандарт тестирования проводится с использованием методов иммуногистохимии (ИГХ), во многих отчетах подчеркивается вопрос как воспроизводимости, так и надежности полученных результатов 6,8,9. ИГХ может привести к рассогласованию результатов, поскольку метод является полуколичественным по своей природе, где различия в обработке тканей и последующей интерпретации могут привести к вариабельности6. Чтобы исправить эту повторяющуюся проблему, в 2010 году были разработаны руководящие принципы, которые были обновлены в 2020 году Американским обществом клинической онкологии с целью сокращения межнаблюдательных вариаций10. В настоящее время клинически подтвержденный пороговый показатель составляет ≥1%, при этом экспрессия ERα даже при очень малых уровнях экспрессии демонстрирует клинически значимые преимущества при использовании эндокриннойтерапии.

При прогрессирующем РМК экспрессия ERα может различаться между метастазами и первичной опухолью. Некоторые наблюдения сообщают о 18-55% расхождениях в уровнях экспрессии ERα между метастатическими поражениями и первичной опухолью, что указывает на важность определения статуса ERα метастазов РМЖ12. Для решения этой проблемы в руководствах подчеркивается важность подтверждения статуса гормональных рецепторов при метастатических поражениях для составления обоснованных планов лечения13,14. Тем не менее, целесообразность этого сомнительна, особенно при использовании методов ИГХ, учитывая, что метастазы могут существовать в местах, из которых трудно взять биопсию.

Методы молекулярной визуализации стали незаменимыми инструментами для обнаружения и визуализации опухолевых поражений у онкологических больных. В частности, визуализация с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) требует использования индикаторов или, в частности, радиофармацевтических препаратов, которые предназначены для использования определенных особенностей опухолей с целью неинвазивной визуализации этих поражений. Наиболее распространенным индикатором ПЭТ, используемым в онкологии, является 18F-фтордезоксиглюкоза (18F-FDG)15. В этом исследовании мы изучаем использование меченой радиоактивной формы эстрадиола, 18F-фторэстрадиола (18F-FES). Эстрадиол - лиганд для ERα - это гормон, преимущественно вырабатываемый яичниками у женщин16. 18F-FES получил недавнее одобрение от Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и продается как CeriannaTM. Это средство визуализации предназначено для использования в качестве дополнения к биопсии у пациентов с рецидивирующим или метастатическим BC17. ПЭТ-визуализация всего тела с 18F-FES может быть использована в качестве неинвазивного метода для определения уровней ERα как в первичной опухоли, так и в отдаленных метастазах в областях, из которых биопсия трудно получить18. Прогнозирование уровней ERα с помощью 18F-FES ПЭТ коррелирует с результатами ИГХ, и, более того, незначительное обнаружение ERα с помощью 18F-FES ПЭТ является надежным предиктором опухолей, которые вряд ли ответят на гормональную терапию18. Для обеспечения надлежащего использования F-FES 18в клинике эксперты в этой области на основе консенсуса сформулировали руководящие принципы19. В этом исследовании мы оцениваем использование 18F-FES PET в доклинических моделях рака молочной железы у мышей.

протокол

Все исследования на животных были одобрены Комитетом по этике животных больницы Остина (A2023/05812) и проведены в соответствии с Австралийским кодексом по уходу за животными и их использованию в научных целях.

1. Подготовка клеток

  1. Используя рутинные процедуры культивирования клеток, поддерживайте клетки MDA-MB-231 и MCF-7 в DMEM/F-12 с добавлением пенициллина/стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в колбах для культуры тканей T175. Перед подготовкой клеток к инъекции пассаж клеток происходит не менее 3 раз после оживления из запасов жидкого азота. Выращивайте клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
  2. Размножают клетки таким образом, чтобы в день подготовки клеток к инъекции на одну мышь приходилось 3 × 106 клеток MCF-7 на одну мышь (т.е. не менее 45 × 106 клеток MCF-7) и 1 × 106 клеток MDA-MB-231 на одну инъекцию на мышь на 5 мышей (т.е. не менее 5 × 106 клеток MDA-MB-231).
    Примечание: Чтобы в каждой мышке было равное количество клеток, подготовьте достаточное количество клеток для пяти дополнительных инъекций (например, подготовьте достаточное количество клеток для 10 инъекций для инъекции пяти мышей).
  3. В день инъекции клеток удалите среду из всех колб и поместите примерно 5 мл трипсина-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,05% ЭДТА) в 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) (pH 7,4) на клетки для облегчения отслойки клеток.
  4. После того, как клетки отделятся, поместите примерно 10 мл полной среды в колбы, чтобы подавить активность трипсина. Ресуспензируйте клетки и перенесите суспензию одиночных клеток в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при ~300 × г в течение 2 мин до пеллетных ячеек.
  5. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме среды и подсчитайте клетки для определения общего количества собранных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь подсчитывать растворы примерно 1 × 106 клеток на мл (50-100 клеток на 16 квадратов при использовании счетной камеры). Для клеток, которые растут со скоростью 5 × 106 на полную колбу, соберите клетки в 5 мл среды. Для клеточных линий с более высокой плотностью используйте 10 мл среды на колбу.
  6. Выполните этот этап на льду в стерильном ламинарном шкафу. Как только это число будет достигнуто, снова центрифугируйте клеточную суспензию при давлении 300 × г в течение 2 мин в пеллетные ячейки. Ресуспендируйте гранулу в холодный PBS и ледяной раствор базальной мембраны таким образом, чтобы на 3 × 106 клеток MCF-7 приходилось 40 μL PBS и 10 μL раствора базальной мембраны.
  7. Ресуспендируйте клеточную гранулу MDA-MB-231 теми же компонентами таким образом, чтобы на 1 × 106 клеток приходилось 40 мкл PBS и 10 мкл раствора матрицы базальной мембраны. Перенесите смесь матрицы клетка-PBS-базальная мембрана из пробирки объемом 50 мл в меньшие пробирки объемом 1,5 мл с помощью холодного наконечника пипетки и держите клеточную смесь на льду непосредственно перед инъекцией клеток мышам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица базальной мембраны, используемая в этом исследовании, хранится при температуре -20 °C. За день до того, как потребуется раствор матрицы базальной мембраны, аликвоту раствора помещают при температуре 4 °C для размораживания в течение ночи. На следующий день он готов к использованию при низких температурах (на льду). При пипетировании раствора убедитесь, что используемые наконечники пипеток холодные, чтобы предотвратить затвердевание раствора матрицы базальной мембраны. Хорошей практикой является хранение коробки со стерильными наконечниками для пипеток в холодильнике до дня подготовки клеток к инъекции. При суспендии клеточной гранулы в ледяном PBS и матричном растворе базальной мембраны сначала добавляется PBS, а затем необходимое количество раствора матрицы базальной мембраны.

2. Инъекция клеток овариэктомированным мышам

  1. Дайте 6-8-недельным самкам обнаженных мышей с овариэктомией BALB/c акклиматизироваться в помещении для содержания животных в течение как минимум 1 недели до инъекции клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании был доступ к более взрослым мышам в возрасте 12-14 недель. Овариоэктомия обеспечивает низкий уровень эндогенного эстрадиола и снижает конкуренцию с лигандом 18F-FES. В зависимости от изучаемой модели, более молодым мышам (например, в возрасте 4-8 недель) может не потребоваться овариэктомия из-за более низких уровней эндогенного эстрадиола20,21.
  2. Индуцировать анестезию у мышей 4% изофлураном и кислородом со скоростью 4 л/мин с помощью индукционной камеры для анестезии. Понаблюдайте за мышью и проверьте на предмет потери рефлекса выпрямления. Как только они перестанут двигаться, перенесите мышь в стерильный шкаф с ламинарным потоком, поместите морду в маску для носа и поддерживайте анестезию, регулируя изофлуран до 2% и кислород до скорости 2 л/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивайте одну мышь за раз, чтобы обеспечить оптимальный уход.
  3. Для инъекций интрамаммарного жирового пакета (IMF) смойте кожу над4-й паховой молочной железой спиртом. Используйте предварительно охлажденный (на льду) шприц 27 г, чтобы набрать суспензию холодной камеры, и оставьте шприц на льду, чтобы предотвратить нагревание/затвердевание раствора матрицы базальной мембраны перед инъекцией.
  4. Большим и указательным пальцами недоминантной руки аккуратно приподнять4-ю молочную железу и ввести иглу шприца 27 G доминирующей рукой, следя за тем, чтобы скос иглы был обращен вверх. Медленно введите 50 мкл клеточной суспензии, содержащей смесь раствора клетка-PBS-базальная мембрана, в жировую подушку молочной железы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время введения клеток между пальцами следует прощупать пузырь. Проверьте наличие утечек в месте инъекции.
  5. Как только инъекция будет завершена, выключите изофлуран и держите морду мыши в носовом конусе, чтобы вдохнуть кислород и прийти в сознание (это должно занять около минуты). Поместите мышь обратно в клетку на грелку для оптимального восстановления.
  6. Для инъекций в плечо используйте описанную выше процедуру, описанную для инъекции IMF, единственное отличие заключается в месте инъекции клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, инъекция в плечо может быть завершена без анестезии (см. шаг 2.7 ниже).
  7. Для инъекции в плечо без анестезии удерживайте и поднимайте кожу над плечом мыши с помощью недоминирующей руки между большим и указательным пальцами, образуя «палатку» в коже. Медленно введите 50 мкл клеточной суспензии, содержащей матричный раствор cell-PBS-базальной мембраны, с помощью иглы шприца 27 G. Аккуратно извлеките иглу и проверьте на наличие протеканий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы шприц Hamilton может использоваться для инъекций небольшого объема, чтобы обеспечить точность подачи объема. Между инъекциями 80% v/v этанола используется для промывания шприца при использовании различных клеточных линий, а PBS используется для промывки и удаления остатков этанола из шприца.

3. Приготовление раствора эстрадиола

  1. С помощью весов, которые могут точно измерить миллиграммы вещества, взвесьте 7 мг порошка эстрадиола в пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Добавьте 700 мкл 100% этанола в 7 мг порошка эстрадиола. Поместите пробирку объемом 1,5 мл в щадящий шейкер примерно на 1 час при комнатной температуре (RT) или до полного растворения порошка эстрадиола.
  3. Распределите раствор по десяти пробиркам объемом 1,5 мл, каждая из которых содержит 70 мкл раствора этанола-эстрадиола. Поместите пробирки при температуре -20 °C для использования в будущем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы эстрадиола-этанола можно хранить при температуре -20 °C в течение примерно 2 недель.

4. Подкожное введение раствора эстрадиола

  1. В день, когда требуется инъекция эстрадиола, восполните следующую смесь в свежем виде. Смешайте 630 мкл кукурузного масла в качестве носителя в 1,5 мл пробирки, содержащей 70 мкл раствора этанола-эстрадиола. Перемешайте раствор до однородности, следя за тем, чтобы этанол не отделялся и не образовывал слой в верхней части автомобильного масла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это дает 700 μL из 20 μг/20 μL кукурузного масла:этанола, раствор 9:1. Каждая мышь получает 20 мкл этого раствора. Всегда принимайте дополнительный раствор, так как масло в смеси имеет тенденцию прилипать к внешней стороне шприца и по бокам пробирки объемом 1,5 мл из-за своей вязкости (например, для 20 мышей, хотя 400 мкл было бы достаточно, почти двойное количество (700 мкл) дает достаточно места для ошибки).
  2. С помощью иглы 29 G, прикрепленной к инсулиновому шприцу, медленно наберите 20 мкл раствора эстрадиола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку раствор содержит 9 частей масла на 1 часть эстрадиола-этанола, смесь потребуется время, чтобы набрать ее в шприц.
  3. Мыши, которым вводится раствор эстрадиола, являются носителями опухолей, экспрессирующих ERα и, следовательно, зависят от эстрогена для роста (MCF-7 в этом исследовании). Мыши с опухолями, которые не экспрессируют ERα (MDA-MB-231 в этом исследовании), не получают раствор эстрадиола. Осторожно расположите мышь для инъекции спереди, желательно на полотенце, чтобы не повредить ее конечности во время фиксации.
  4. Используя недоминирующую руку, удерживайте мышь, удерживая верхнюю часть ее хвоста между безымянным и мизинцем. Большим и указательным пальцами приподнимите дряблую кожу возле шеи мыши, чтобы сформировать в коже «шатер» для подкожного введения раствора эстрадиола.
  5. Удерживая мышь в этом удерживающем устройстве, используйте доминирующую руку для введения мышке раствора эстрадиола. Наклоном иглы вверх протолкните иглу под «шатер» кожи до тех пор, пока не станет видно менее половины иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При введении раствора кожа должна заметно раздуваться.
  6. Чтобы предотвратить обратный поток раствора, держите иглу под кожей в течение нескольких секунд. Если возникает обратный поток, аккуратно промокните участок салфеткой, чтобы удалить остатки раствора.
    Примечание: В некоторых экспериментах для введения гормона использовали эстрадиол в сочетании с кунжутным маслом. Использование кунжутного масла в качестве средства приводит к местному воспалению под кожей в местах инъекций эстрадиола. Таким образом, в качестве носителя для последующих экспериментов было выбрано кукурузное масло, в которых признаки воспаления в местах инъекций эстрадиола отсутствовали или были минимальными. Для получения более подробной информации см. обсуждение.
  7. После извлечения иглы аккуратно промокните место инъекции антисептиком местного действия с помощью ватной палочки. Это необходимо для предотвращения воспаления на поверхности в месте инъекции из-за введения/удаления иглы через кожу мыши.
  8. Мышам с опухолями, экспрессирующими ERα (MCF-7), вводите эстрадиол подкожно за 3 дня до инъекции клеток, а затем 5 раз в неделю в течение 5 недель (рис. 1). Прекратите инъекции эстрадиола за 2 дня до дня визуализации, чтобы избежать конкурентного связывания зонда 18F-FES с его мишенью, ERα.
    Примечание: В этом исследовании мышам с опухолями MCF-7 вводили эстрадиол ежедневно с понедельника по пятницу. Если их визуализировали на следующей неделе в среду, инъекции эстрадиола продолжались в субботу и воскресенье. Эстрадиол не вводили в понедельник и вторник до того, как мыши были сфотографированы в среду.

5. 18F-FES ПЭТ и МРТ мышей, подвергшихся овариэктомии

ВНИМАНИЕ: Используйте защитное снаряжение при работе с радиоактивными веществами. Соблюдайте все применимые нормативные процедуры при работе с радиоактивностью.

  1. Взвесьте мышь и запишите ее вес.
  2. Для этого исследования 18F-FES был синтезирован и сформулирован с клинической степенью23 (получен из Департамента молекулярной визуализации и терапии, Austin Health) для использования на животных моделях. Развести 18F-FES (109 мин радиоактивного периода полураспада) в 10% мас.% растворе этанола и физиологического раствора при скорректированной концентрации впрыска с поправкой на распад приблизительно 150-300 μCi/100 μл.
    Примечание: Удельная активность в 1000 Ки/ммоль достаточна для визуализации in vivo ПЭТ ERα24, а полученные 18F-FES имели удельную активность выше этого исходного значения.
  3. Наберите 100 мкл инсулиновым шприцем с иглой 29 G. Используйте калибратор дозы для измерения и записи дозы и времени радиоактивности. Поместите шприц за свинцовый щиток до момента инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте количество радиоактивности 18F-FES в каждой дозе с помощью калибратора дозы. Калибратор дозы должен быть откалиброван по стандартному эталонному материалу, такому как цезий-137, в соответствии с протоколом производителя. Время считывания важно записывать для определения коррекции распада. Убедитесь, что время, отображаемое на калибраторе, совпадает со временем на компьютере, используемом для сбора данных о ПЭТ.
  4. Чтобы расширить хвостовые вены для внутривенного введения, поместите мышь под нагревательный элемент на расстоянии 30 см на 2 минуты. Протрите хвост 70% w/v этанолом, чтобы продезинфицировать область перед инъекцией.
  5. Введите 100 мкл 18F-FES (весь объем в шприце) с помощью болюсной инъекции через боковую хвостовую вену и запишите время инъекции. Прижмите место инъекции тканью, чтобы остановить кровотечение из хвостовой вены.
  6. Измерьте оставшуюся дозу в шприце и ткани с помощью калибратора дозы и запишите измерение и время. Вводите мышей в шахматном порядке партиями по два человека, чтобы обеспечить визуализацию с использованием многокамерного аппарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В шприце останется немного зонда. Использование инсулиновых шприцев предпочтительнее шприцев, соединенных с иглами через замки Люэра, из-за уменьшения объема дозы, захваченной в шприце/игле после введения инъекции. Кроме того, измеряется радиоактивность в ткани, которая используется для остановки любого кровотечения, которое может возникнуть после внутривенного введения зонда. Это связано с тем, что обратный ток крови, поглощенный тканью, может содержать некоторую радиоактивность 18F-FES. Кроме того, время, необходимое для нагрева боковых хвостовых вен, будет зависеть от таких переменных, как интенсивность источника тепла и то, насколько близко он находится к мышам. Для стандартных тепловых ламп для расширения вен может потребоваться до 15 минут. Мыши должны находиться под тщательным наблюдением на предмет признаков перегрева и при необходимости удаляться из источника нагрева между инъекциями.
  7. Для мышей, которые находятся в состоянии сна после инъекции, поместите введенную мышь в анестезиологическую камеру, поддерживаемую на поддерживающем уровне изофлурана (2%-2,5%) и кислорода (2% л/мин) в течение 1 часа на грелке, чтобы зонд мог быть распределен через системный кровоток мыши до ПЭТ-сканирования. Позвольте другим мышам в группе свободно гулять в своей клетке в течение 1-1,5 ч до проведения ПЭТ-сканирования.
  8. Через 1-1,5 ч поместите мышь в камеру визуализации под наркозом изофлурана носового конуса. Включите обогреватель кровати на 32 °C, выберите многокамерную установку и включите систему мониторинга дыхания. Поместите двух мышей, которых нужно изобразить, в положение лежа. Поместите камеру визуализации в аппарат ПЭТ/МРТ.
  9. Отслеживайте дыхание мыши на протяжении всего процесса получения изображения. Используйте таблицу дыхания, чтобы обеспечить 60-80 вдохов в минуту в любой момент времени во время сканирования. Если частота дыхания падает ниже или выше желаемого диапазона, при необходимости корректируйте дозу изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дыхание животного можно контролировать благодаря наличию датчика в камере визуализации.
  10. Соедините статическое 15-минутное сканирование ПЭТ с 3D-аксиальной МРТ с градиентным эхо (GRE). Ниже приведены параметры захвата:
    1. Чтобы настроить протокол ПЭТ, откройте окно «Редактор радиофармпрепаратов » в соответствующем программном обеспечении. Укажите используемый изотоп, активность шприца (MBq), время инъекции и прикладываемая активность (MBq), а также массу тела. Все эти параметры необходимы для расчета и количественной оценки поглощения зонда в исследуемой ткани.
    2. Чтобы убедиться в правильном положении мыши для визуализации, используйте последовательность 2D Scout (передняя и задняя стороны) для определения поля зрения PET. Перейдите к 15-минутному статическому захвату ПЭТ с использованием энергетического окна 400-600 кэВ, режим совпадения 1-5,5 нс. После этого проведите аксиальную МРТ GRE3D в течение примерно 27 минут.
  11. Реконструируйте полученные изображения с помощью соответствующего программного обеспечения.
    1. Выполните статическую реконструкцию изображения ПЭТ/МРТ и используйте геометрический планировщик для изменения области реконструкции таким образом, чтобы она покрывала всю поверхность мыши, обеспечивая оптимальное время реконструкции.
    2. В окне Определение результатов переключите случайные поправки, поправку на затухание (AC) + рассеяние, диапазон положения в положение Вкл. Установите эталонное время распада на ADMIN. Установите пороговое значение «воздух-тело » на 30% и основывайте поправку на затухание на карте материала.
  12. Используйте соответствующее программное обеспечение для разделения многокамерных изображений, совместной регистрации и рисования областей интереса (ROI). Для совместной регистрации выровняйте МРТ в соответствии с ПЭТ и восстановите изображение ПЭТ.
  13. Чтобы разделить многокамерные изображения, нажмите на кнопку Обработка изображений > Сегментация > Разделитель отелей. Включите научный режим и настройте параметры порога и объема по мере необходимости, пока не будет найдено 2 объекта.
  14. Введите дозу в момент инъекции после учета любой остаточной дозы, оставшейся в шприце, чтобы преобразовать данные ПЭТ в единицу процента введенной дозы на грамм (%ID/г) или дополнительно введите вес субъекта, чтобы преобразовать данные ПЭТ в единицу стандартизированного значения поглощения (SUV). Для этого выполните преобразование, щелкнув правой кнопкой мыши набор данных PET и найдя поле %ID/g на вкладке «Основная информация ». Введите %ID/g, записанный ранее.
  15. Чтобы нарисовать ROI на участках опухоли, перейдите на вкладку «Измерения » в левой части окна программы. Нарисуйте ROI с помощью многоугольника или инструмента от руки . Тщательно проведите по окружности опухоли, следя за тем, чтобы действие выполнялось в то время, когда ПЭТ-изображение находится в активном окне (проверьте с помощью Fn-A). В результате получается значение ROI в виде %ID/г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ ROI дает хорошую оценку %ID/г. Хорошо откалиброванная камера должна давать точность ±5% по сравнению с данными биораспределения ex vivo .

6. Забор и фиксация опухолевой ткани для иммуногистохимии

  1. В экспериментальной конечной точке усыпить мышь с помощью смертельной ингаляции изофлурана в концентрации 4-5% или чрезмерного вдыхания CO2.
  2. С помощью хирургических ножниц и пинцета аккуратно сделайте небольшой разрез у поверхности опухоли и резецируйте опухолевую ткань. Если кожа прикреплена к опухолевой ткани, используйте лезвие скальпеля, чтобы аккуратно отделить кожу от опухоли.
  3. Поместите опухолевую ткань во флакон объемом 5 мл, содержащий примерно 3 мл 10% нейтрального буферизованного формалина. Убедитесь, что вся ткань покрыта раствором для облегчения фиксации ткани. Подержите ткань в формалине в течение 24 часов.
  4. На следующий день перенесите неподвижную опухолевую ткань во флакон объемом 5 мл, содержащий 70% этанола. Пометьте тканевую кассету, специфичную для опухолевой ткани, при подготовке к заделке парафина.
  5. Поместите опухолевую ткань в тканевую кассету и храните ее в 70% растворе этанола до образования парафина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании встраивание парафина проводилось патологоанатомами из Austin Health.

7. Иммуногистохимия для выявления рецептора эстрогена альфа (ERα)

  1. С помощью микротома разрежьте участки опухолевой ткани толщиной 4 мкм, необходимые для окрашивания, следуя стандартным процедурам.
  2. Поместите предметные стекла стеклянного микроскопа с разрезанными опухолевыми срезами в штатив для предметных стекол и поместите штатив в духовку при температуре 37 °C для сушки в течение ночи и обеспечения прилипания тканей к предметным стеклам перед окрашиванием.
  3. На следующее утро поместите решетку со слайдами, содержащими срезанные опухоли, в духовку при температуре 60 °C на 30 минут, чтобы облегчить процесс депарафинизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные горки должны быть обращены вверх во время выпечки. Это обеспечивает адгезию тканей, и любой плавящийся воск плавится на собственном предметном стекле, а не на соседних предметных стеклах.
  4. Чтобы увлажнить секции, погрузите обожженные секции в ксилол два раза, по 5 мин каждый (2x 5 мин) 100% этанола на 2x 5 мин, а затем 70% этанола на 1x 5 мин. Вымойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 минут.
  5. Для извлечения антигена погрузите предметные стекла в контейнер с 1x буфером ЭДТА, pH 8, на 25-30 минут на водяную баню при температуре 100 °C. Снимите слайды с водяной бани и дайте им постоять на RT не менее 1 часа. Как только предметные стекла остынут, промойте их в проточной воде из-под крана в течение 2 минут, а затем TBST (TBS с 0,01% Tween20) в течение 2x 5 минут.
  6. С помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте круг вокруг секций на слайдах.
  7. Охладите эндогенные пероксидазы, поместив приблизительно 100 мкл 3% раствора H2O2 (разведенного в дистиллированной воде) на секции на 10 мин при RT. Промойте предметные стекла в проточной водопроводной воде в течение 2 мин, а затем TBST в течение 2 x 5 мин.
  8. Блокируйте срезы примерно 100 мкл/срез блокирующего буфера (5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в TBST) в течение 30 мин в режиме РТ.
  9. Слейте воду из блокирующего буфера, аккуратно перебросив излишки раствора в инкубационный лоток. Добавьте приблизительно 100 мкл первичного антитела (человеческий анти-ERα, выращенный у кроликов) в срезы в соотношении 1:300 (или при оптимальном заранее определенном разведении, специфичном для используемого антитела). Восполните разведения антител в 1% BSA TBST и поместите предметные стекла для инкубации с антителом при 4 °C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационный лоток должен быть заполнен водой на дне, чтобы секции не высохли за ночь.
  10. На следующее утро вымойте предметные стекла с TBST в течение 3x 5 минут. Добавьте примерно 100 мкл вторичного антитела против кролика на срезы и оставьте на 45 минут при RT. Промойте предметные стекла TBST в течение 3x 5 минут.
  11. В вытяжной шкаф добавьте примерно 100 мкл реагента 3,3'-диаминобензидина (DAB) на срезы и держите раствор примерно 3 минуты на срез. Подавите реакцию DAB, промыв предметные стекла проточной водой из-под крана в течение 10 минут.
  12. Противодействуйте горкам гематоксилином в течение 1 минуты, а затем промойте в проточной воде из-под крана в течение 2 минут. Погрузите горки в воду Скотта на 1 минуту, затем промойте в проточной воде из-под крана еще на 2 минуты.
  13. Чтобы обезвожить секции, погрузите секции в 70% этанол на 2 мин, 100% этанол на 2x 2 мин, а затем в ксилол на 2x 2 мин.
  14. В вытяжном шкафу аккуратно установите секции из дибутилфталата полистирол-ксилола (DPX) и наденьте на них покровное стекло, чтобы пузырьки не попали в интересующую ткань. Оставьте предметные стекла сушиться на ночь в вытяжном шкафу.
  15. На следующий день используйте сканер слайдов для получения изображений и визуализации пятен.

Результаты

Чтобы определить местоположение, для которого ERα-положительные опухоли могут быть четко визуализированы с помощью 18F-FES PET, в этом исследовании были использованы три когорты овариэктомированных мышей (рис. 1). Двум группам мышей вводили клетки MCF-7 ...

Обсуждение

Здесь мы описываем полезность 18F-FES ПЭТ/МРТ в выявлении опухолей молочной железы, характеризующихся экспрессией ERα. В качестве примера мы демонстрируем, что одним из мест, где можно визуализировать ERα-положительные опухоли, является плечо мышей - эти опухоли могу...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом по борьбе с раком молочной железы (IIRS-22-071). Мы выражаем признательность правительству штата Виктория за программу поддержки операционной инфраструктуры. Это исследование также было проведено с использованием Solid Target Laboratory, партнерства ANSTO-Austin-LICR при поддержке Национального центра визуализации и правительства штата Виктория. Авторы отмечают научную и техническую помощь Национального центра визуализации, возможности Национальной стратегии совместной исследовательской инфраструктуры (NCRIS), в узле La Trobe-ONJCRI, Научно-исследовательский институт рака Оливии Ньютон-Джон (ONJCRI). Рисунки 1 и 3 были сделаны с помощью BioRender.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5% Trypsin (10x)Gibco15090-046
27 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringeTerumoSS*05M2713KAFor cell injections
29 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringeTerumoSS*05M2913KAFor estradiol injections
30% H2O2Chem-SupplyHA154Diluted to a 3% working solution with distilled water
Corn oilSigmaC8267
DAB Substrate KitAbcamab64238
Dako anti-rabbit-HRP, 110 mLAligent-DakoK4003Secondary antibody used for IHC
DMEM/F-12 MediumGibco11320033
Dose calibratorCapintec5130-3216
Estradiol SigmaE2758
Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAbCell Signalling Technology#8644Primary antibody used for IHC
FBSBovogenSFBS
Heat element (Infra Red Lamp)Amcal12400For tail vein dilation
MatrigelCorning356225
MultiCell 4 Channel Monitoring kit for triple- or quadruple-mouse imaging chamberMedisoPR-MC900200For monitoring of mouse respiration
NanoScan PET/MRI 3T SystemMedisoPR-RD000000For PET/MRI acquistion
PBS (1x)Gibco14190-144
TBSTThermoFisher#28360Wash buffer for IHC
Three mice imaging chamberMedisoPR-MC407300For PET/MRI acquistion

Ссылки

  1. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  2. Ignatov, A., Eggemann, H., Burger, E., Ignatov, T. Patterns of breast cancer relapse in accordance to biological subtype. J Cancer Res Clin Oncol. 144 (7), 1347-1355 (2018).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Gnant, M., Turner, N. C., Hernando, C. Managing a long and winding road: Estrogen receptor-positive breast cancer. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 43, e390922 (2023).
  5. Thomsen, C., Nielsen, S., Nielsen, B. S., Pedersen, S. H., Vyberg, M. Estrogen receptor-α quantification in breast cancer: Concordance between immunohistochemical assays and mRNA-in situ hybridization for ESR1 gene. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 28 (5), 347-353 (2020).
  6. Shafi, S., et al. Integrating and validating automated digital imaging analysis of estrogen receptor immunohistochemistry in a fully digital workflow for clinical use. J Pathol Inform. 13, 100122 (2022).
  7. Harvey, J. M., Clark, G. M., Osborne, C. K., Allred, D. C. Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to the ligand-binding assay for predicting response to adjuvant endocrine therapy in breast cancer. J Clin Oncol. 17 (5), 1474-1474 (1999).
  8. Caruana, D., Wei, W., Martinez-Morilla, S., Rimm, D. L., Reisenbichler, E. S. Association between low estrogen receptor positive breast cancer and staining performance. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 5 (2020).
  9. Goldstein, N. S., Ferkowicz, M., Odish, E., Mani, A., Hastah, F. Minimum formalin fixation time for consistent estrogen receptor immunohistochemical staining of invasive breast carcinoma. Am J Clin Pathol. 120 (1), 86-92 (2003).
  10. Hammond, M. E. H., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Allison, K. H., et al. Estrogen and progesterone receptor testing in breast cancer: ASCO/CAP guideline update. J Clin Oncol. 38 (12), 1346-1366 (2020).
  12. Amir, E., et al. Tissue confirmation of disease recurrence in breast cancer patients: Pooled analysis of multi-centre, multi-disciplinary prospective studies. Cancer Treat Rev. 38 (6), 708-714 (2012).
  13. Cardoso, F., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L., Costa, A., Castiglione, M. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 21 (Suppl 5), v15-v19 (2010).
  14. Cardoso, F., et al. 5th ESO-ESMO international consensus guidelines for advanced breast cancer (ABC 5). Ann Oncol. 31 (12), 1623-1649 (2020).
  15. James, W. F., et al. Recommendations on the use of 18F-FDG PET in oncology. J Nucl Med. 49 (3), 480-508 (2008).
  16. Pedersen, M. A., et al. Dynamic whole-body [18F]FES PET/CT increases lesion visibility in patients with metastatic breast cancer. EJNMMI Res. 14 (1), 24 (2024).
  17. Grabher, B. J. 18F-FES whole-body imaging protocol for evaluating tumor estrogen receptor status in patients with recurrent or metastatic breast cancer. J Nucl Med Technol. 51 (3), 188-193 (2023).
  18. Van Kruchten, M., et al. PET imaging of estrogen receptors as a diagnostic tool for breast cancer patients presenting with a clinical dilemma. J Nucl Med. 53 (2), 182-190 (2012).
  19. Ulaner, G. A., et al. Summary: Appropriate use criteria for estrogen receptor-targeted pet imaging with 16α-18F-fluoro-17β-fluoroestradiol. J Nucl Med. 64 (3), 351-354 (2023).
  20. He, S., Wang, M., Zhang, Y., Luo, J., Zhang, Y. Monitoring the early response of fulvestrant plus tanshinone IIA combination therapy to estrogen receptor-positive breast cancer by longitudinal 18F-FES PET/CT. Contrast Media Mol Imaging. 2019 (1), 2374565 (2019).
  21. Joseph, J. D., et al. The selective estrogen receptor downregulator GDC-0810 is efficacious in diverse models of ER+ breast cancer. eLife. 5, e15828 (2016).
  22. Alsina-Sanchis, E., et al. Intraperitoneal oil application causes local inflammation with depletion of resident peritoneal macrophages. Mol Cancer Res. 19 (2), 288-300 (2021).
  23. Sluka, P., et al. Characterization of an estrogen receptor α-selective 18F-estradiol PET tracer. World J Nucl Med. 23 (03), 153-160 (2024).
  24. Katzenellenbogen, J. A. The quest for improving the management of breast cancer by functional imaging: The discovery and development of 16α-[18f]fluoroestradiol (fes), a pet radiotracer for the estrogen receptor, a historical review. Nucl Med Biol. 92, 24-37 (2021).
  25. Boers, J., et al. Image quality and interpretation of [18F]-FES-PET: Is there any effect of food intake. Diagnostics (Basel). 10 (10), 756 (2020).
  26. Caceres, S., et al. Tumor growth progression in ectopic and orthotopic xenografts from inflammatory breast cancer cell lines. Vet Sci. 8 (9), 194 (2021).
  27. Kumar, M., Salem, K., Jeffery, J. J., Fowler, A. M. PET Imaging of Estrogen Receptors Using 18F-Based Radioligands. Estrogen Receptors. , (2022).
  28. Zhang, W., et al. Comparative study of subcutaneous and orthotopic mouse models of prostate cancer: Vascular perfusion, vasculature density, hypoxic burden and BB2r-targeting efficacy. Sci Rep. 9 (1), 11117 (2019).
  29. Lee, A. V., Oesterreich, S., Davidson, N. E. MCF-7 cells-changing the course of breast cancer research and care for 45 years. J Natl Cancer Inst. 107 (7), djv073 (2015).
  30. Pedram, H., et al. 18F-fluoroestradiol PET guides dosing of selective estrogen receptor degraders. J Nucl Med. 55 (supplement 1), 11 (2014).
  31. Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17β-estradiol administration to mice. Gen Comp Endocrinol. 175 (1), 188-193 (2012).
  32. Luengo-Mateos, M., et al. Protocol for ovariectomy and estradiol replacement in mice. STAR Protoc. 5 (1), 102910 (2024).
  33. Yang, Z., et al. High specific activity is not optimal: 18F-fluoroestradio positron emission tomography-computed tomography results in a breast cancer xenograft. J Labelled Comp Radiopharm. 59 (13), 576-581 (2016).
  34. Aliaga, A., et al. Breast cancer models to study the expression of estrogen receptors with small animal PET imaging. Nucl Med Biol. 31 (6), 761-770 (2004).
  35. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. -. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: A visual demonstration. J Vis Exp. 64, e4013 (2012).
  36. Pisaneschi, F., et al. Automated, resin-based method to enhance the specific activity of fluorine-18 clicked PET radiotracers. Bioconjug Chem. 28 (2), 583-589 (2017).
  37. Johannes, N., et al. Variation of specific activities of 68Ga-aquibeprin and 68Ga-avebetrin enables selective PET imaging of different expression levels of integrins α5β1 and αvβ3. J Nucl Med. 57 (10), 1618-1624 (2016).
  38. Liu, C., Ma, G., Xu, X., Song, S., Yang, Z. Can 18F-FES PET improve the evaluation of 18F-FDG PET in patients with metastatic invasive lobular carcinoma. Clin Nucl Med. 49 (4), 301-307 (2024).
  39. Heidari, P., et al. Pharmacodynamic imaging guides dosing of a selective estrogen receptor degrader. Clin Cancer Res. 21 (6), 1340-1347 (2015).
  40. Roswall, P., et al. Microenvironmental control of breast cancer subtype elicited through paracrine platelet-derived growth factor-CC signaling. Nat Med. 24 (4), 463-473 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

18F FESMCF 7ERBALB c

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены