JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מדגימים פרוטוקול לשימוש בטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol (18F-FES) ככלי להמחשת ביטוי ERα בהשתלות שד חיוביות ל-ERα.

Abstract

כדי להדגים כיצד ניתן לדמיין קסנוגרפטים חיוביים לסרטן שד אלפא (ERα) בעכברים עירומים BALB/c באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol (18F-FES), הוזרקו לעכברי BALB/c עירומים שעברו שחלות תאי סרטן שד חיוביים ל-ERα (MCF-7, 3 × 106 תאים; כתף [n = 10] או כרית שומןחלב מפשעתית 4 [n = 10]) או תאי סרטן שד שליליים ל-ERΑ (MDA-MB-231, 1 × 106 תאים; כרית שומן חלב [n = 5]). עכברים המכילים תאי MCF-7 קיבלו זריקות תת עוריות של 20 מיקרוגרם של 17β-אסטרדיול (20 מיקרוגרם/20 מיקרוליטר; שמן תירס: אתנול, 9:1) בעורף יומיים לפני הזרקת התאים, ולאחר מכן זריקות יומיות חמש פעמים בשבוע במשך 5 שבועות. נפחי הגידול נמדדו על פי הנוסחה: (L*W2)/2 (L; אורך, W; רוחב). לאחר שנפחי הגידול הגיעו לכ-100 מ"מ3, זריקות 17β-אסטרדיול הופסקו יומיים לפני שעכברים קיבלו 18F-FES להדמיית PET כדי למנוע קשירה תחרותית עם ERα. לאחר מתן 18F-FES דרך וריד הזנב הצדדי, בוצע PET/MRI במשך 15 דקות בשעה עד שעה וחצי לאחר ההזרקה. 18קליטת F-FES לא נצפתה בעכברים נושאי גידול שליליים ל-ERα, MDA-MB-231. 18ספיגת F-FES הייתה בולטת ביותר בעכברים שהכילו גידולי MCF-7 בכתף. בגידולי MCF-7 שגדלו בכרית השומן המפשעתי, ספיגת 18F-FES הייתה פחות נראית לעין, מכיוון שדפוס הפרשת המעי של 18F-FES טשטש את הרדיואקטיביות שניתן לזהות בגידולים אלה. כדי להשתמש ב-18F-FES PET ככלי להמחשת ביטוי ERα בהשתלות שד חיוביות ל-ERα, אנו מדגימים כי הנראות של ספיגת 18F-FES ברורה בגידולים הממוקמים הרחק מאזור הבטן של עכברים, כגון בכתף.

Introduction

סרטן השד (BC) יכול להיות מרובד לתת-סוגים מולקולריים שונים1. גידולי שד המסווגים כתת-סוג לומינלי מבטאים יתר על המידה את קולטן האסטרוגן אלפא (ERα). ככזה, תת-סוג זה של BC מכונה גם ERα-חיובי (ERα+). למרבה המזל, אלה שאובחנו עם ERα+ BC חווים את ההישרדות הגבוהה ביותר של 10 שנים יחד עם שיעורים נמוכים של גרורות מרוחקות 2,3. בשל ביטוי ERα, לחולים כאלה יש גישה לאוסף של אפשרויות טיפול הורמונלי, כולל מודולטורים סלקטיביים של קולטני אסטרוגן (SERMs), תרופות אנטי-אסטרוגן ומעכבי ארומטאז4.

כדי להעריך אם חולת סרטן השד זכאית לטיפול הורמונלי, יש לקבוע את רמות הביטוי של ERα בגידולי שד 5,6,7. בעוד שתקן הזהב של הבדיקות נערך בשיטות אימונוהיסטוכימיה (IHC), דיווחים רבים מדגישים את נושא השחזור והאמינות של התוצאות שהתקבלו 6,8,9. IHC יכול לגרום לחוסר התאמה כתוצאה מכיוון שהטכניקה היא כמותית למחצה באופיה, כאשר הבדלים בעיבוד הרקמות ובפרשנות שלאחר מכן יכולים להוביל לשונות6. כדי לתקן בעיה חוזרת זו, נקבעו הנחיות בשנת 2010 ועודכנו בשנת 2020 על ידי האגודה האמריקאית לאונקולוגיה קלינית מתוך כוונה להפחית את השונות בין הצופים10. נכון לעכשיו, החתך המאומת קלינית עומד על ≥1%, כאשר ביטוי ERα אפילו ברמות ביטוי קטנות מאוד מדגים יתרונות משמעותיים מבחינה קלינית באמצעות טיפול אנדוקריני11.

ב-BC מתקדם, ביטוי ERα עשוי להיות שונה בין גרורות לגידול הראשוני. תצפיות מסוימות מדווחות על פער של 18%-55% ברמות הביטוי של ERα בין נגעים גרורתיים לגידול הראשוני, מה שמצביע על החשיבות של קביעת מצב ה-ERα של גרורות BC12. כדי לטפל בכך, ההנחיות מדגישות את החשיבות של אישור מצב קולטני ההורמונים בנגעים גרורתיים כדי ליצור תוכניות טיפול מושכלות13,14. עם זאת, היתכנות הדבר מוטלת בספק, במיוחד בשיטות IHC, בהתחשב בכך שגרורות עשויות להתקיים במקומות שקשה לקחת מהם ביופסיות.

שיטות הדמיה מולקולרית הפכו לכלים חיוניים לאיתור והדמיה של נגעי גידול בחולי סרטן. בפרט, הדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) מחייבת שימוש במעקבים או, ליתר דיוק, תרופות רדיו-פרמצבטיות, שנועדו לנצל מאפיינים מסוימים של גידולים מתוך כוונה לדמיין את הנגעים הללו באופן לא פולשני. עוקב ה-PET הנפוץ ביותר המשמש באונקולוגיה הוא 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG)15. במחקר זה, אנו בוחנים את השימוש בצורה מסומנת רדיו של אסטרדיול, 18F-פלואורואסטרדיול (18F-FES). אסטרדיול - ליגנד ל- ERα - הוא הורמון המיוצר בעיקר על ידי השחלות אצל נקבות16. 18F-FES קיבלה לאחרונה אישור ממינהל המזון והתרופות (FDA) ומשווקת בשם CeriannaTM. חומר הדמיה זה נועד לשמש כתוספת לביופסיות בחולים עם BC17 חוזר או גרורתי. הדמיית PET של כל הגוף עם 18F-FES יכולה לשמש כשיטה לא פולשנית לאיתור רמות ERα הן בגידול הראשוני והן בגרורות מרוחקות באזורים שמהם קשה להשיג ביופסיות18. חיזוי רמות ERα באמצעות הדמיית 18F-FES PET מתאם עם תוצאות IHC, ויתרה מכך, זיהוי מועט עד אפסי של ERα באמצעות הדמיית 18F-FES PET הוא מנבא אמין לגידולים שלא סביר שיגיבו לטיפול הורמונלי18. כדי להבטיח את השימוש הנכון ב-18F-FES במרפאה, גובשו הנחיות בהסכמה על ידי מומחים בתחום19. במחקר זה, אנו מעריכים את השימוש ב-18F-FES PET במודלים פרה-קליניים של סרטן השד בעכברים.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים אוסטין (A2023/05812) ונערכו בהתאם לקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות.

1. הכנת תאים

  1. באמצעות הליכי תרבית תאים שגרתיים, שמור על תאי MDA-MB-231 ו-MCF-7 ב-DMEM/F-12 בתוספת פניצילין/סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי (FBS) בצלוחיות תרבית רקמה T175. לפני הכנת התאים להזרקה, תאי מעבר לפחות 3 פעמים לאחר החייאה ממאגרי חנקן נוזלי. גדל את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  2. להפיץ תאים כך שביום הכנת התאים להזרקה, יהיו 3 ×10 6 תאי MCF-7 לזריקה לעכבר עבור 15 עכברים (כלומר, לפחות 45 × 106 תאי MCF-7) ו-1 ×10 6 תאי MDA-MB-231 לזריקה לעכבר עבור 5 עכברים (כלומר, לפחות 5 × 106 תאי MDA-MB-231).
    הערה: כדי לאפשר מספר שווה של תאים בכל עכבר, הכינו מספיק תאים לחמש זריקות נוספות (למשל, הכינו מספיק תאים ל-10 זריקות להזרקת חמישה עכברים).
  3. ביום הזרקת התאים, הסר את המדיה מכל הצלוחיות והנח כ-5 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25% טריפסין ו-0.05% EDTA) בתמיסת מלח 1x פוספט (PBS) (pH 7.4) על התאים כדי להקל על ניתוק התאים.
  4. לאחר שהתאים מתנתקים, הניחו כ-10 מ"ל של מדיום שלם לתוך צלוחיות כדי לעכב את פעילות הטריפסין. השעו מחדש תאים והעבירו את המתלה החד-תאי לצינור של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב ~ 300 × גרם למשך 2 דקות לתאי גלולה.
  5. השעו מחדש את גלולת התא בנפח מתאים של מדיה וספרו תאים כדי לקבוע את המספר הכולל של התאים שנקטפו.
    הערה: שאפו לספור פתרונות של כ-1 ×-106 תאים למ"ל (50-100 תאים לכל 16 ריבועים אם משתמשים בתא ספירה). עבור תאים הגדלים בקצב של 5 × 106 לכל בקבוק מלא, קצרו תאים ב -5 מ"ל מדיה. עבור קווי תאים בעלי צפיפות גבוהה יותר, השתמש ב-10 מ"ל מדיה לכל בקבוק.
  6. בצע שלב זה על קרח בארון זרימה למינרי סטרילי. לאחר השגת מספר זה, צנטריפוגה את תרחיף התאים שוב ב-300 × גרם למשך 2 דקות לתאי גלולה. השעו מחדש את הגלולה בתמיסת מטריצת קרום PBS וקר כקרח כך שלכל 3 ×10 6 תאי MCF-7, יש 40 מיקרוליטר של PBS ו-10 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת קרום מרתף.
  7. השעו מחדש את גלולת התא MDA-MB-231 עם אותם מרכיבים כך שלכל 1 × 106 תאים, יש 40 מיקרוליטר של PBS ו-10 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת קרום מרתף. העבירו את תערובת מטריצת הממברנה של תא-PBS-מרתף מהצינור של 50 מ"ל לצינורות קטנים יותר של 1.5 מ"ל עם קצה פיפטה קרה ושמרו את תערובת התאים על קרח ממש לפני הזרקת התא לעכברים.
    הערה: מטריצת קרום הבסיס המשמשת במחקר זה מאוחסנת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. יום לפני שנדרשת תמיסת מטריצת קרום המרתף, מניחים כמות של התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להפשרה למשך הלילה. למחרת, הוא מוכן לשימוש בטמפרטורות קרות (על קרח). בעת פיפטינג התמיסה, ודא שקצות הפיפטה המשמשות קרות כדי למנוע מתמיסת מטריצת קרום המרתף להתמצק. מומלץ לשמור קופסה של קצות פיפטות סטריליות במקרר לפני יום הכנת התא להזרקה. בעת השעיה מחדש של גלולת התא ב-PBS קר כקרח ובתמיסת מטריצת קרום המרתף, PBS מתווסף תחילה, ואחריו הכמות הנדרשת של תמיסת מטריצת קרום המרתף.

2. הזרקת תאים לעכברים עם שחלות

  1. אפשר לעכברים עירומים BALB/c בנות 6-8 שבועות להתאקלם במתקן הדיור לבעלי חיים לפחות שבוע לפני הזרקת התאים.
    הערה: למחקר זה הייתה גישה לעכברים מבוגרים יותר, בני 12-14 שבועות. כריתת שחלות מבטיחה רמות נמוכות של אסטרדיול אנדוגני ומפחיתה את התחרות עם ליגנד 18F-FES. בהתאם למודל הנחקר, עכברים צעירים יותר (למשל, 4-8 שבועות) עשויים שלא להזדקק לכריתת שחלות עקב רמות נמוכות יותר של אסטרדיול אנדוגני 20,21.
  2. השראת הרדמה בעכבר עם 4% איזופלורן וחמצן בקצב של 4 ליטר לדקה באמצעות תא אינדוקציה להרדמה. התבונן בעכבר ובדוק אם יש אובדן רפלקס ימני. ברגע שהם כבר לא זזים, העבירו את העכבר לארון זרימה למינרי סטרילי, הנח את החוטם לתוך מסכת האף ושמור על הרדמה על ידי התאמת האיזופלורן ל-2% והחמצן לקצב של 2 ליטר לדקה.
    הערה: הרדמו עכבר אחד בכל פעם כדי להבטיח טיפול מיטבי.
  3. להזרקות כרית שומן תוך-שדית (IMF), יש לספוג את העור מעל בלוטת החלבהמפשעתית הרביעית באלכוהול. השתמש במזרק 27 גרם מקורר מראש (על קרח) כדי למשוך את תרחיף התאים הקרים ולהשאיר את המזרק על קרח כדי למנוע התחממות/התמצקות של תמיסת מטריצת קרום הבסיס לפני ההזרקה.
  4. בעזרת האגודל והאצבע המורה של היד הלא דומיננטית, הרם בעדינות את בלוטת החלבהרביעית והכנס מחט מזרק 27 גרם ביד הדומיננטית, וודא שהשיפוע של המחט פונה כלפי מעלה. הזרקו לאט 50 מיקרוליטר מתרחיף התא המכיל את תערובת תמיסת מטריצת הממברנה PBS-מרתף לתוך כרית השומן החלבי.
    הערה: יש להרגיש בועה בין האצבעות בעת הזרקת התאים. בדוק אם יש נזילות באתר ההזרקה.
  5. לאחר השלמת ההזרקה, כבה את האיזופלורן והשאר את חוטם העכבר בקונוס האף כדי לנשום חמצן ולחזור להכרה (זה אמור לקחת כדקה). הנח את העכבר בחזרה בכלוב על כרית חום להתאוששות מיטבית.
  6. עבור זריקות כתף, השתמש בהליך לעיל המתואר עבור הזרקת IMF, ההבדל היחיד הוא מיקום הזרקת התאים.
    הערה: לחלופין, ניתן להשלים את הזרקת הכתף ללא הרדמה (ראה שלב 2.7 להלן).
  7. להזרקת כתף ללא הרדמה, החזיקו והרימו את העור מעל כתף העכבר באמצעות היד הלא דומיננטית בין האגודל לאצבע המורה, ויוצרים 'אוהל' בעור. הזרקו לאט 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים המכיל את תמיסת מטריצת הממברנה של התא-PBS-מרתף באמצעות מחט מזרק 27 גרם. משוך בעדינות את המחט ובדוק אם יש נזילות.
    הערה: כחלופה, ניתן להשתמש במזרק המילטון להזרקות בנפח קטן כדי להבטיח את דיוק אספקת הנפח. בין הזריקות, 80% v/v אתנול משמש לשטיפת המזרק בעת שימוש בקווי תאים שונים, ו-PBS משמש לשטיפה והסרת שאריות אתנול מהמזרק.

3. הכנת תמיסת אסטרדיול

  1. בעזרת משקל שיכול למדוד במדויק מיליגרם של חומר, שקלו 7 מ"ג של אבקת אסטרדיול לתוך שפופרת של 1.5 מ"ל.
  2. הוסף 700 מיקרוליטר של 100% אתנול ל-7 מ"ג של אבקת אסטרדיול. הנח את שפופרת ה-1.5 מ"ל על שייקר עדין למשך כשעה בטמפרטורת החדר (RT) או עד שאבקת האסטרדיול נמסה במלואה.
  3. יש לציין את התמיסה על פני עשרה צינורות של 1.5 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל תמיסת אתנול-אסטרדיול של 70 מיקרוליטר. הנח את הצינורות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
    הערה: ניתן לשמור על מלאי אסטרדיול-אתנול בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך כשבועיים.

4. הזרקה תת עורית של תמיסת אסטרדיול

  1. ביום בו נדרשת הזרקת אסטרדיול, הכינו את התערובת הבאה טרייה. שלב 630 מיקרוליטר שמן תירס כרכב לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 70 מיקרוליטר של תמיסת אתנול-אסטרדיול. מערבולת את התמיסה עד להומוגנית, מבטיחה שהאתנול לא נפרד ויוצר שכבה בחלק העליון של שמן הרכב.
    הערה: זה מניב 700 מיקרוליטר של שמן תירס של 20 מיקרוגרם/20 מיקרוליטר: אתנול, תמיסה של 9:1. כל עכבר מקבל 20 מיקרוליטר של תמיסה זו. הכינו תמיד תמיסה נוספת מכיוון שהשמן בתערובת נוטה להיצמד לחלק החיצוני של המזרק ובצידי צינור של 1.5 מ"ל בשל צמיגותו (למשל, עבור 20 עכברים, אם כי 400 מיקרוליטר יספיקו, מה שהופך כמעט כפול את הכמות (700 מיקרוליטר) מספקת מספיק מקום לטעויות).
  2. בעזרת מחט 29 גרם המחוברת למזרק אינסולין, שאב לאט 20 מיקרוליטר של תמיסת אסטרדיול.
    הערה: מכיוון שהתמיסה מכילה 9 חלקי שמן לחלק אחד של אסטרדיול-אתנול, ייקח זמן לתערובת להישאב לתוך המזרק.
  3. עכברים שיוזרקו להם תמיסת אסטרדיול הם אלה שמכילים גידולים המבטאים ERα ולכן מסתמכים על אסטרוגן כדי לגדול (MCF-7 במחקר זה). עכברים המכילים גידולים שאינם מבטאים ERα (MDA-MB-231 במחקר זה) אינם מקבלים תמיסת אסטרדיול. מקם בעדינות את העכבר להזרקה מלפנים, רצוי על מגבת, כדי למנוע פגיעה בגפיים שלו בזמן ריסון.
  4. בעזרת היד הלא דומיננטית, רסנו את העכבר על ידי החזקת החלק העליון של זנבו בין הקמיצה לאצבע הקטנה. השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי להרים את העור הרפוי ליד צוואר העכבר כדי ליצור 'אוהל' בעור להזרקה תת עורית של תמיסת האסטרדיול.
  5. תוך שמירה על העכבר בריסון זה, השתמש ביד הדומיננטית כדי להזריק לעכבר את תמיסת האסטרדיול. כששיפוע המחט פונה כלפי מעלה, דחוף את המחט מתחת ל'אוהל' העור עד שפחות ממחצית המחט נראית לעין.
    הערה: עם הזרקת התמיסה, העור אמור להתנפח החוצה.
  6. כדי למנוע זרימה חוזרת של התמיסה, שמור את המחט מתחת לעור למשך מספר שניות. אם מתרחשת זרימה חוזרת כלשהי, יבש בעדינות את האזור עם טישו כדי להסיר את שאריות התמיסה.
    הערה: בחלק מהניסויים נעשה שימוש באסטרדיול בשילוב עם שמן שומשום למתן ההורמון. שימוש בשמן שומשום ככלי מוביל לדלקת מקומית מתחת לעור באתרי הזרקת אסטרדיול. ככזה, שמן תירס נבחר ככלי לניסויים הבאים, בהם נעדרו סימני דלקת באתרי הזרקת אסטרדיול או מינימליים22. ראה את הדיון לפרטים נוספים.
  7. לאחר הסרת המחט, יש לספוג בעדינות את מקום ההזרקה בחומר חיטוי מקומי בעזרת צמר גפן. זאת כדי למנוע דלקת על פני השטח במקום ההזרקה עקב החדרה/הסרה של המחט דרך עור העכבר.
  8. להזריק לעכברים המכילים גידולים המבטאים ERα (MCF-7) זריקות אסטרדיול תת עוריות 3 ימים לפני הזרקת התא, ולאחר מכן 5 פעמים בשבוע למשך 5 שבועות (איור 1). הפסק את זריקות האסטרדיול יומיים לפני יום ההדמיה כדי למנוע קשירה תחרותית עם 18הגשושית F-FES ליעד שלה, ERα.
    הערה: במחקר זה, עכברים המכילים גידולי MCF-7 הוזרקו עם אסטרדיול מדי יום מיום שני עד שישי. אם הם צולמו בשבוע שלאחר מכן ביום רביעי, זריקות אסטרדיול המשיכו בשבת וראשון. אסטרדיול לא ניתן בימים שני ושלישי לפני שהעכברים צולמו ביום רביעי.

5. 18הדמיית F-FES PET ו-MRI של עכברים שעברו כריתת שחלות

זהירות: השתמש בציוד מגן בעת טיפול ברדיואקטיביות. פעל לפי כל ההליכים הרגולטוריים החלים בעת טיפול ברדיואקטיביות.

  1. שקלו את העכבר ורשמו את משקלו.
  2. במחקר זה, 18F-FES סונתזו ונוסחו בדרגה קלינית23 (שהושגה מהמחלקה להדמיה וטיפול מולקולרי, Austin Health) לשימוש במודלים של בעלי חיים. לדלל 18F-FES (זמן מחצית חיים רדיואקטיבי של 109 דקות) בתמיסת אתנול-מלח של 10% w/v בריכוז הזרקה מתוקן דעיכה מותאם של כ-150-300 μCi/100 μL.
    הערה: פעילות ספציפית של 1000 Ci/mmol מספיקה להדמיית PET in vivo של ERα24, ול-18 ה-F-FES שהתקבלו הייתה פעילות ספציפית מעל ערך בסיס זה.
  3. צייר 100 מיקרוליטר עם מזרק אינסולין עם מחט 29 גרם. השתמש בכיול מינון כדי למדוד ולתעד את המינון והזמן הרדיואקטיביים. הנח את המזרק מאחורי מגן עופרת עד למועד ההזרקה.
    הערה: מדוד את הכמות של 18רדיואקטיביות F-FES בכל מנה עם כיול מינון. יש לכייל את כיול המינון כנגד חומר ייחוס סטנדרטי, כגון צזיום-137, לפי פרוטוקול היצרן. חשוב לתעד את זמן הקריאה כדי לקבוע את תיקון הדעיכה. ודא שהשעה המוצגת בכיול תואמת את השעה במחשב המשמשת לרכישת PET.
  4. כדי להרחיב את ורידי הזנב להזרקה תוך ורידית, הניחו את העכבר מתחת לגוף חימום במרחק של 30 ס"מ למשך 2 דקות. נגב את הזנב עם 70% w/v אתנול כדי לחטא את האזור לפני ההזרקה.
  5. יש לתת 100 מיקרוליטר של 18F-FES (כל הנפח במזרק) עם הזרקת בולוס דרך וריד הזנב הצדדי ולתעד את זמן ההזרקה. לחץ על מקום ההזרקה עם טישו כדי לעצור את הדימום של וריד הזנב.
  6. מדוד את המינון הנותר במזרק בתוספת הרקמה באמצעות כיול המינון ורשום את המדידה והזמן. הזרקת עכברים מתנודדים בקבוצות של שניים כדי לאפשר הדמיה באמצעות הרב-תאים.
    הערה: חלק מהבדיקה תישאר במזרק. השימוש במזרקי אינסולין עדיף על פני מזרקים המחוברים למחטים באמצעות מנעולי Luer בגלל נפח המינון המופחת הכלוא במזרק/מחט לאחר מתן ההזרקה. בנוסף, נמדדת הרדיואקטיביות ברקמה המשמשת לעצירת כל דימום שעלול להתרחש לאחר הזרקה תוך ורידית של הבדיקה. הסיבה לכך היא שזרימת הדם החוזרת הנספגת על ידי הרקמה עשויה להכיל רדיואקטיביות מסוימת מ-18F-FES. בנוסף, הזמן שלוקח לחמם את ורידי הזנב הצדדיים יהיה תלוי במשתנים כמו עוצמת מקור החום ועד כמה הוא קרוב לעכברים. עבור מנורות חום סטנדרטיות, ייתכן שיחלפו עד 15 דקות עד שהוורידים יתרחבו. יש לעקוב מקרוב אחר עכברים לאיתור סימני התחממות יתר ולהוציא אותם ממקור החימום בין הזריקות במידת הצורך.
  7. עבור עכברים שהוקצו לשינה לאחר ההזרקה, הנח את העכבר המוזרק בתא ההרדמה הנשמר תחת רמת תחזוקה של איזופלורן (2%-2.5%) וחמצן (2 ליטר לדקה) למשך שעה אחת על כרית חימום כדי לאפשר את הפצת הגשושית דרך זרימת הדם המערכתית של העכבר לפני סריקת ה-PET. אפשרו לעכברים האחרים בקבוצה ללכת בחופשיות בכלוב שלהם במשך שעה עד שעה וחצי עד לסריקת ה-PET.
  8. לאחר 1-1.5 שעות, הנח את העכבר בתא הדמיה תחת הרדמה איזופלורן של חרוט האף. הפעל את מחמם המיטה ל-32 מעלות צלזיוס, בחר התקנה רב-תאית והפעל את מערכת ניטור הנשימה. הנח את שני העכברים להדמיה במצב שכיבה. הנח את תא ההדמיה במכשיר ה-PET/MRI.
  9. עקוב אחר נשימת העכבר לאורך רכישת התמונה. השתמש בטבלת נשימה כדי להבטיח 60-80 נשימות לדקה בכל זמן נתון במהלך הסריקה. אם קצב הנשימה יורד מתחת או מעל הטווח הרצוי, התאם את מינון האיזופלורן לפי הצורך.
    הערה: ניתן לנטר את הנשימה של בעל החיים עקב נוכחות חיישן בתא ההדמיה.
  10. התאם רכישת PET סטטית של 15 דקות עם סריקת MRI צירית תלת מימדית של Gradient Echo (GRE). ראה להלן פרמטרים לרכישה:
    1. כדי להגדיר את פרוטוקול PET, פתח את החלון Radiopharmaceutical Editor בתוכנה הרלוונטית. ציין את האיזוטופ שבשימוש, פעילות המזרק (MBq), זמן ההזרקה והפעילות היישומית (MBq) ומשקל הגוף. כל הפרמטרים הללו חיוניים כדי לעזור לחשב ולכמת את קליטת הגשושית ברקמה המעניינת.
    2. כדי להבטיח שהעכבר ממוקם נכון להדמיה, השתמש ברצף צופים דו-ממדי (מלפנים ומאחור) כדי לקבוע את שדה ה-PET view. המשך לרכישת PET סטטית של 15 דקות באמצעות חלון אנרגיה של 400-600 keV, מצב צירוף מקרים של 1-5, 5 ns. בצע סריקת MRI צירית GRE3D למשך כ-27 דקות לאחר מכן.
  11. שחזר את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנה מתאימה.
    1. בצע שחזור סטטי של תמונת ה-PET/MRI והשתמש במתכנן הגיאומטרי כדי לשנות את אזור השחזור כדי להבטיח שהוא מכסה את כל העכבר, מה שמבטיח זמן שחזור אופטימלי.
    2. תחת החלון זיהוי תוצאות, העבר תיקונים אקראיים, תיקון הנחתה (AC) + פיזור, טווח מיקום למצב מופעל. הגדר את זמן ההתייחסות לדעיכה ל-ADMIN. הגדר את סף הגוף-אוויר ל-30% ובסס את תיקון ההנחתה על מפת החומר.
  12. השתמש בתוכנה רלוונטית להפרדת תמונות מרובות תאים, רישום משותף ולציור אזורי עניין (ROI). לרישום משותף, יישר מחדש את ה-MRI כך שיתאים ל-PET, ושחזר את תמונת ה-PET.
  13. כדי להפריד בין התמונות מרובות החדרים, לחץ על עיבוד תמונה > פילוח > מפריד מלונות. הפעל את המצב המדעי והתאם את פרמטרי הסף והנפח לפי הצורך עד שיימצאו 2 אובייקטים.
  14. הזן את המינון בזמן ההזרקה לאחר התחשבות בכל המינון השיורי שנותר במזרק כדי להמיר את נתוני ה-PET ליחידת אחוז המינון המוזרק לגרם (%ID/g) או בנוסף הזן את משקל הנבדק כדי להמיר את נתוני ה-PET ליחידת ערך הספיגה הסטנדרטי (SUV). בצע המרה זו על ידי לחיצה ימנית על מערך הנתונים של PET ואיתור השדה %ID/g בכרטיסייה מידע בסיסי . הזן את %ID/g שנרשם קודם לכן.
  15. כדי לצייר החזר ROI על מקטעי הגידול, לחץ על הכרטיסייה מדידות בצד שמאל של חלון התוכנית. צייר את ההחזר על ההשקעה בעזרת המצולע או הכלי ביד חופשית . צייר בזהירות סביב היקף הגידול, וודא שהפעולה מתבצעת בזמן שתמונת ה-PET נמצאת בחלון הפעיל (בדוק באמצעות Fn-A). התוצאה נותנת ערך של החזר ההשקעה כ-%ID/g.
    הערה: ניתוח החזר ROI נותן הערכה טובה של %ID/g. מצלמה מכוילת היטב אמורה לתת דיוק של ±5% בהשוואה לנתוני הפצה ביולוגית ex vivo .

6. קציר וקיבוע רקמת גידול לאימונוהיסטוכימיה

  1. בסיום הניסוי, המתת חסד של העכבר באמצעות שאיפה קטלנית של איזופלורן ב-4%-5% או שאיפת יתר של CO2.
  2. בעזרת מספריים ופינצטה כירורגיים, צור בזהירות חתך קטן ליד פני הגידול וכרת את רקמת הגידול. אם העור מחובר לרקמת הגידול, השתמש בלהב אזמל כדי להפריד בעדינות את העור מהגידול.
  3. הנח את רקמת הגידול בבקבוקון של 5 מ"ל המכיל כ-3 מ"ל של פורמלין ניטרלי 10%. ודא שכל הרקמה מכוסה בתמיסה כדי להקל על קיבוע הרקמות. שמור את הטישו שקוע בפורמלין למשך 24 שעות.
  4. למחרת, העבירו את רקמת הגידול הקבועה לבקבוקון של 5 מ"ל המכיל 70% אתנול. סמן קלטת רקמה ספציפית לרקמת הגידול כהכנה להטמעת פרפין.
  5. מניחים את רקמת הגידול בקלטת רקמות ומאחסנים אותה בתמיסת אתנול של 70% עד להטמעת פרפין.
    הערה: במחקר זה, הטמעת פרפין נערכה על ידי פתולוגים אנטומיים מאוסטין הלת'.

7. אימונוהיסטוכימיה לגילוי קולטן אסטרוגן אלפא (ERα)

  1. בעזרת מיקרוטום, חותכים חלקים בעובי 4 מיקרומטר מרקמת הגידול הנדרשים לצביעה, בהתאם להליכים סטנדרטיים.
  2. הנח את שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית עם חלקי הגידול החתוכים לתוך מתלה שקופיות והכניס את המתלה לתנור של 37 מעלות צלזיוס לייבוש למשך הלילה וכדי להבטיח שהרקמות נדבקות לשקופיות לפני הצביעה.
  3. למחרת בבוקר, הכניסו את המתלה עם שקופיות המכילות קטעי גידול חתוכים לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להקל על תהליך הסרת השעווה.
    הערה: מגלשות הזכוכית צריכות לפנות כלפי מעלה בזמן האפייה. זה מבטיח היצמדות לרקמות, וכל שעווה שנמסה נמסה על המגלשה שלה ולא על מגלשות סמוכות.
  4. כדי להחזיר את הלחות לחלקים, טבלו את החלקים האפויים בקסילן פעמיים, 5 דקות כל אחד (2x 5 דקות) 100% אתנול למשך 2x 5 דקות ולאחר מכן 70% אתנול למשך 1x 5 דקות. שוטפים מגלשות במים מזוקקים למשך 5 דקות.
  5. לאחזור אנטיגן, טבלו את המגלשות במיכל של 1x מאגר EDTA, pH 8, למשך 25-30 דקות באמבט מים של 100 מעלות צלזיוס. הסר מגלשות מאמבט המים ואפשר למגלשות לשבת ב-RT למשך שעה לפחות. לאחר שהמגלשות התקררו, שטפו אותן במי ברז זורמים למשך 2 דקות ולאחר מכן TBST (TBS עם 0.01% Tween20) למשך 2x 5 דקות.
  6. בעזרת עט מחסום הידרופובי, צייר עיגול סביב החלקים בשקופיות.
  7. הרוו פרוקסידאזות אנדוגניות על ידי הנחת כ-100 מיקרוליטר של תמיסת 3% H2O2 (מדוללת במים מזוקקים) על חלקים למשך 10 דקות ב-RT. שטפו את המגלשות במי ברז זורמים למשך 2 דקות ולאחר מכן TBST למשך 2x 5 דקות.
  8. חסום קטעי עם כ-100 מיקרוליטר/קטע של מאגר חוסם (5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-TBST) למשך 30 דקות ב-RT.
  9. מסננים את המאגר החוסם על ידי הזזה עדינה של התמיסה העודפת לתוך מגש הדגירה. הוסף כ-100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני (אנטי-ERα אנושי שגדל בארנב) למקטעים בדילול של 1:300 (או בדילול אופטימלי שנקבע מראש ספציפי לנוגדנים המשמשים). השלימו דילול נוגדנים ב-1% BSA TBST והניחו שקופיות כדי לדגור עם הנוגדן ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: יש למלא את מגש הדגירה במים בתחתית כדי להבטיח שהחלקים לא יתייבשו למשך הלילה.
  10. למחרת בבוקר, שטפו את המגלשות עם TBST למשך 3x5 דקות. הוסף כ-100 מיקרוליטר של נוגדן משני נגד ארנב על חלקים והשאיר למשך 45 דקות ב-RT. שטפו את השקופיות עם TBST למשך 3x 5 דקות.
  11. במכסה אדים, הוסף כ-100 מיקרוליטר של מגיב 3,3'-diaminobenzidine (DAB) על חלקים ושמור את התמיסה דולקת למשך כ-3 דקות לכל חלק. לעכב את תגובת ה-DAB על ידי שטיפת מגלשות במי ברז זורמים למשך 10 דקות.
  12. יש להחליק עם המטוקסילין למשך דקה אחת, ולשטוף במי ברז זורמים למשך 2 דקות. טבלו את המגלשות במים של סקוט למשך דקה אחת, ולאחר מכן שטפו במי ברז זורמים למשך 2 דקות נוספות.
  13. כדי לייבש חלקים, טבלו את החלקים ב-70% אתנול למשך 2 דקות, 100% אתנול למשך 2x 2 דקות, ולאחר מכן קסילן למשך 2x2 דקות.
  14. במכסה אדים, הרכיבו בזהירות קטעים בפוליסטירן קסילן דיבוטיל פתלט (DPX) והניחו כיסוי על החלקים, כדי להבטיח שבועות לא יילכדו מעל הרקמה המעניינת. השאירו את השקופיות לייבוש למשך הלילה במכסה האדים.
  15. למחרת, השתמש בסורק שקופיות כדי לצלם תמונות ולדמיין את הצביעה.

תוצאות

כדי לקבוע את המיקום שבו ניתן לדמיין בבירור גידולים חיוביים ל-ERα באמצעות 18F-FES PET, נעשה שימוש בשלוש קבוצות של עכברים שעברו כריתת שחלות במחקר זה (איור 1). לשתי קבוצות של עכברים הוזרקו תאי MCF-7 - קו תאי סרטן שד חיובי ל- ERα - IMF או בכתף. כביקורת שלילית, קבוצה נוס?...

Discussion

כאן, אנו מתארים את התועלת של 18F-FES PET/MRI באיתור גידולי שד המאופיינים בביטוי ERα. כדוגמה, אנו מדגימים כי מיקום אחד בו ניתן לדמיין גידולים חיוביים ל-ERα הוא בכתף של עכברים - ניתן לזהות בבירור גידולים אלה על ידי קליטת 18F-FES, בהשוואה לגידולים הממוקמים בתוך כרית השומןה?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית לסרטן השד (IIRS-22-071). אנו מכירים בתוכנית התמיכה בתשתיות תפעוליות של ממשלת מדינת ויקטוריה. מחקר זה בוצע גם באמצעות מעבדת המטרה המוצקה, שותפות ANSTO-Austin-LCR, הנתמכת גם על ידי מתקן ההדמיה הלאומי והממשלה הוויקטוריאנית. המחברים מכירים בסיוע המדעי והטכני של מתקן ההדמיה הלאומי, יכולת אסטרטגיית תשתית מחקר שיתופית לאומית (NCRIS), בצומת La Trobe-ONJCRI, המכון לחקר הסרטן אוליביה ניוטון-ג'ון (ONJCRI). איורים 1 ו-3 נעשו עם BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5% Trypsin (10x)Gibco15090-046
27 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringeTerumoSS*05M2713KAFor cell injections
29 G x 13 mm 0.5 mL insulin syringeTerumoSS*05M2913KAFor estradiol injections
30% H2O2Chem-SupplyHA154Diluted to a 3% working solution with distilled water
Corn oilSigmaC8267
DAB Substrate KitAbcamab64238
Dako anti-rabbit-HRP, 110 mLAligent-DakoK4003Secondary antibody used for IHC
DMEM/F-12 MediumGibco11320033
Dose calibratorCapintec5130-3216
Estradiol SigmaE2758
Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAbCell Signalling Technology#8644Primary antibody used for IHC
FBSBovogenSFBS
Heat element (Infra Red Lamp)Amcal12400For tail vein dilation
MatrigelCorning356225
MultiCell 4 Channel Monitoring kit for triple- or quadruple-mouse imaging chamberMedisoPR-MC900200For monitoring of mouse respiration
NanoScan PET/MRI 3T SystemMedisoPR-RD000000For PET/MRI acquistion
PBS (1x)Gibco14190-144
TBSTThermoFisher#28360Wash buffer for IHC
Three mice imaging chamberMedisoPR-MC407300For PET/MRI acquistion

References

  1. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  2. Ignatov, A., Eggemann, H., Burger, E., Ignatov, T. Patterns of breast cancer relapse in accordance to biological subtype. J Cancer Res Clin Oncol. 144 (7), 1347-1355 (2018).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Gnant, M., Turner, N. C., Hernando, C. Managing a long and winding road: Estrogen receptor-positive breast cancer. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 43, e390922 (2023).
  5. Thomsen, C., Nielsen, S., Nielsen, B. S., Pedersen, S. H., Vyberg, M. Estrogen receptor-α quantification in breast cancer: Concordance between immunohistochemical assays and mRNA-in situ hybridization for ESR1 gene. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 28 (5), 347-353 (2020).
  6. Shafi, S., et al. Integrating and validating automated digital imaging analysis of estrogen receptor immunohistochemistry in a fully digital workflow for clinical use. J Pathol Inform. 13, 100122 (2022).
  7. Harvey, J. M., Clark, G. M., Osborne, C. K., Allred, D. C. Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to the ligand-binding assay for predicting response to adjuvant endocrine therapy in breast cancer. J Clin Oncol. 17 (5), 1474-1474 (1999).
  8. Caruana, D., Wei, W., Martinez-Morilla, S., Rimm, D. L., Reisenbichler, E. S. Association between low estrogen receptor positive breast cancer and staining performance. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 5 (2020).
  9. Goldstein, N. S., Ferkowicz, M., Odish, E., Mani, A., Hastah, F. Minimum formalin fixation time for consistent estrogen receptor immunohistochemical staining of invasive breast carcinoma. Am J Clin Pathol. 120 (1), 86-92 (2003).
  10. Hammond, M. E. H., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Allison, K. H., et al. Estrogen and progesterone receptor testing in breast cancer: ASCO/CAP guideline update. J Clin Oncol. 38 (12), 1346-1366 (2020).
  12. Amir, E., et al. Tissue confirmation of disease recurrence in breast cancer patients: Pooled analysis of multi-centre, multi-disciplinary prospective studies. Cancer Treat Rev. 38 (6), 708-714 (2012).
  13. Cardoso, F., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L., Costa, A., Castiglione, M. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 21 (Suppl 5), v15-v19 (2010).
  14. Cardoso, F., et al. 5th ESO-ESMO international consensus guidelines for advanced breast cancer (ABC 5). Ann Oncol. 31 (12), 1623-1649 (2020).
  15. James, W. F., et al. Recommendations on the use of 18F-FDG PET in oncology. J Nucl Med. 49 (3), 480-508 (2008).
  16. Pedersen, M. A., et al. Dynamic whole-body [18F]FES PET/CT increases lesion visibility in patients with metastatic breast cancer. EJNMMI Res. 14 (1), 24 (2024).
  17. Grabher, B. J. 18F-FES whole-body imaging protocol for evaluating tumor estrogen receptor status in patients with recurrent or metastatic breast cancer. J Nucl Med Technol. 51 (3), 188-193 (2023).
  18. Van Kruchten, M., et al. PET imaging of estrogen receptors as a diagnostic tool for breast cancer patients presenting with a clinical dilemma. J Nucl Med. 53 (2), 182-190 (2012).
  19. Ulaner, G. A., et al. Summary: Appropriate use criteria for estrogen receptor-targeted pet imaging with 16α-18F-fluoro-17β-fluoroestradiol. J Nucl Med. 64 (3), 351-354 (2023).
  20. He, S., Wang, M., Zhang, Y., Luo, J., Zhang, Y. Monitoring the early response of fulvestrant plus tanshinone IIA combination therapy to estrogen receptor-positive breast cancer by longitudinal 18F-FES PET/CT. Contrast Media Mol Imaging. 2019 (1), 2374565 (2019).
  21. Joseph, J. D., et al. The selective estrogen receptor downregulator GDC-0810 is efficacious in diverse models of ER+ breast cancer. eLife. 5, e15828 (2016).
  22. Alsina-Sanchis, E., et al. Intraperitoneal oil application causes local inflammation with depletion of resident peritoneal macrophages. Mol Cancer Res. 19 (2), 288-300 (2021).
  23. Sluka, P., et al. Characterization of an estrogen receptor α-selective 18F-estradiol PET tracer. World J Nucl Med. 23 (03), 153-160 (2024).
  24. Katzenellenbogen, J. A. The quest for improving the management of breast cancer by functional imaging: The discovery and development of 16α-[18f]fluoroestradiol (fes), a pet radiotracer for the estrogen receptor, a historical review. Nucl Med Biol. 92, 24-37 (2021).
  25. Boers, J., et al. Image quality and interpretation of [18F]-FES-PET: Is there any effect of food intake. Diagnostics (Basel). 10 (10), 756 (2020).
  26. Caceres, S., et al. Tumor growth progression in ectopic and orthotopic xenografts from inflammatory breast cancer cell lines. Vet Sci. 8 (9), 194 (2021).
  27. Kumar, M., Salem, K., Jeffery, J. J., Fowler, A. M. PET Imaging of Estrogen Receptors Using 18F-Based Radioligands. Estrogen Receptors. , (2022).
  28. Zhang, W., et al. Comparative study of subcutaneous and orthotopic mouse models of prostate cancer: Vascular perfusion, vasculature density, hypoxic burden and BB2r-targeting efficacy. Sci Rep. 9 (1), 11117 (2019).
  29. Lee, A. V., Oesterreich, S., Davidson, N. E. MCF-7 cells-changing the course of breast cancer research and care for 45 years. J Natl Cancer Inst. 107 (7), djv073 (2015).
  30. Pedram, H., et al. 18F-fluoroestradiol PET guides dosing of selective estrogen receptor degraders. J Nucl Med. 55 (supplement 1), 11 (2014).
  31. Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17β-estradiol administration to mice. Gen Comp Endocrinol. 175 (1), 188-193 (2012).
  32. Luengo-Mateos, M., et al. Protocol for ovariectomy and estradiol replacement in mice. STAR Protoc. 5 (1), 102910 (2024).
  33. Yang, Z., et al. High specific activity is not optimal: 18F-fluoroestradio positron emission tomography-computed tomography results in a breast cancer xenograft. J Labelled Comp Radiopharm. 59 (13), 576-581 (2016).
  34. Aliaga, A., et al. Breast cancer models to study the expression of estrogen receptors with small animal PET imaging. Nucl Med Biol. 31 (6), 761-770 (2004).
  35. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. -. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: A visual demonstration. J Vis Exp. 64, e4013 (2012).
  36. Pisaneschi, F., et al. Automated, resin-based method to enhance the specific activity of fluorine-18 clicked PET radiotracers. Bioconjug Chem. 28 (2), 583-589 (2017).
  37. Johannes, N., et al. Variation of specific activities of 68Ga-aquibeprin and 68Ga-avebetrin enables selective PET imaging of different expression levels of integrins α5β1 and αvβ3. J Nucl Med. 57 (10), 1618-1624 (2016).
  38. Liu, C., Ma, G., Xu, X., Song, S., Yang, Z. Can 18F-FES PET improve the evaluation of 18F-FDG PET in patients with metastatic invasive lobular carcinoma. Clin Nucl Med. 49 (4), 301-307 (2024).
  39. Heidari, P., et al. Pharmacodynamic imaging guides dosing of a selective estrogen receptor degrader. Clin Cancer Res. 21 (6), 1340-1347 (2015).
  40. Roswall, P., et al. Microenvironmental control of breast cancer subtype elicited through paracrine platelet-derived growth factor-CC signaling. Nat Med. 24 (4), 463-473 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

18F FESPETMCF 7ERBALB c

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved