一种用于评估环境污染物与核受体结合亲和力的高通量筛选方法

摘要

该方案描述了一种高通量筛选系统，该系统使用与核受体结合的特异性荧光探针的荧光极化作为筛选环境污染物的读数。

摘要

在环境中检测到的化合物含量不断增加，造成了广泛的污染，并对人类健康构成风险。然而，尽管它们在环境范围内的发生率很高，但关于其毒理学影响的信息非常有限。迫切需要开发高通量筛选 （HTS） 方法来指导毒理学研究。在这项研究中，开发了一种使用 HTS 系统的受体-配体结合测定法，以确定环境污染物对核受体的结合效力。该测试是使用酶标仪（即含有各种化学物质的 96 孔板）通过测量特定荧光探针的荧光偏振 （FP） 进行的。该检测包括四个部分：重组载体的构建和转化、受体蛋白（配体结合域）的表达和纯化、受体-探针结合以及化学物质与受体的竞争性结合。测定两种环境污染物全氟辛烷磺酸 （PFOS） 和磷酸三苯酯 （TPHP） 与过氧化物酶体增殖物激活受体 γ （PPARγ） 的结合效力，以说明测定程序。最后，还讨论了该方法的优缺点及其潜在应用。

引言

在环境和人体中广泛检测到大量化学物质，引起了人们对其对生态环境和人类健康影响的严重担忧 ^1,2,3。尽管它们在环境下的发生率很高，但有关其毒理学影响的信息却很少。因此，迫切需要开发高通量筛选 （HTS） 方法来促进化学毒性的评估。

已经报道了几种用于化学毒性评估的高通量筛选 （HTS） 方法，例如 Tox21 和 ToxCast 计划中使用的 HTS 生物测定 ^4,5。这些方法可以快速识别潜在的毒物，并提供有关化学毒性机制的宝贵信息。然而，这些 HTS 生物测定主要依赖于基于细胞的系统，这可能既复杂又昂贵。此外，高通量测序方法也已用于化学毒性评估，但实现化学品的高通量评估仍然具有挑战性⁶。以前的研究已经开发了基于荧光偏振 （FP） 的受体-配体竞争性结合测定法，以确定几种环境污染物的结合效力，包括全氟和多氟烷基物质 （PFAS）^7,8,9、双酚 A （BPA）^10,11 和颗粒物 （PM）¹²，以及过氧化物酶体增殖物激活受体 （PPAR^{） 等}核受体7^， 8,9,10,13，法尼醇 X 受体 （FXR）^11,12 和甲状腺受体 （TR）^14,15。这种方法高效、经济高效，并提供机制见解。

在本研究中，基于检测小荧光探针的荧光偏振 （FP） 描述了受体 - 配体结合测定的方案。基于 FP 的受体-配体结合测定的原理如图 1 所示。当一个小荧光分子被平面偏振光激发时，由于分子的快速旋转，发射的光会变得高度去偏振。然而，当示踪剂与较大的受体结合时，其旋转速度会减慢。当示踪剂与大受体结合时，检测到高 FP 值，而当示踪剂游离时，观察到低 FP 值。纯化过氧化物酶体增殖物激活受体 γ （PPARγ） 以使探针与受体结合。罗格列酮 （Rosi） 、全氟辛烷磺酸 （PFOS） 和磷酸三苯酯 （TPHP） 用于竞争探针与受体的结合。Rosi 是 PPARγ 的特异性激动剂，在受体竞争性结合试验中用作阳性对照。此外，PFOS 和 TPHP 先前在以前的研究中已被确定为 PPARγ 的弱激动剂 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。此外，它们属于已知环境暴露的化合物的不同结构类别，并以其在人类群体中相对较高的检出率而著称。这些化合物用于进一步验证竞争结合测定的广泛适用性。该程序包括四个步骤：重组载体的构建和转化、受体蛋白（配体结合结构域）的表达和纯化、受体探针结合以及化学物质与受体的竞争性结合。

研究方案

试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 重组载体的构建和转化

注：PPARγ 是一种配体依赖性转录因子，具有经典的核受体结构，包括一个调节靶基因的 DNA 结合结构域和一个由配体激活的配体结合结构域。配体激活后，PPARγ 与另一个核受体类视黄醇 X 受体 （RXR） 形成异二聚体，并与 PPARγ 的反应元件结合，从而调节下游靶基因的转录 ^9,16。

1. 设计 PPARγ-LBD 的引物（见 表 1）并扩增 PPARγ-LBD DNA 片段（见 表 2 和 表 3）。
2. 通过用限制性核酸内切酶 XhoI 和 BamHI¹⁸ 消化 His ×6 标记的 pET28a 载体，将其线性化。
3. 使用市售克隆试剂盒将 PPARγ-LBD DNA 片段克隆到 His×6 标记的 pET28a 载体中，得到重组质粒 pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸。
4. 将重组表达质粒 pET28a-PPARγ-LBD-6×His 转染到 BL21 （DE3） 大肠杆菌 细胞中，用于蛋白表达¹⁸。
5. 将 5 μL 重组载体加入感受态 BL21 （DE3） 细胞中，在冰上孵育 30 分钟，在 42 °C 下进行热休克 45 秒，然后立即返回冰中。
6. 加入 900 μL LB 培养基，在 37 °C 下摇动 1 小时 （160-200 rpm），然后在室温下以 ~3000 x g 离心 5 分钟。
7. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于 100 μL LB 培养基中，然后铺展到固体培养基上。将板倒置并在 37 °C 下培养 12-16 小时。
8. 选择单个菌落进行测序鉴定以及随后的蛋白质表达和纯化。

2. 受体蛋白的表达和纯化

1. 将转化的 BL21 （DE3） 细胞在补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 200 mL LB 培养基中，在轨道振荡器 （230 rpm） 上孵育 1-2 小时，温度为 37 °C。
2. 当OD₆₀₀ 达到0.4-0.6吸光度单位时，通过加入10μM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导细胞，并在16°C下孵育16小时。
3. 收集细菌悬浮液并在 8000 × g、4 °C 下离心 10 分钟。
4. 在 20 mL 可溶性裂解缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、10 mM 咪唑，pH 8.0）中裂解细胞，加入 200 μL 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 和 200 μL 溶菌酶。使用 5 mL 移液器重悬细菌沉淀，然后以 30% 的功率进行超声处理 20 分钟。
5. 加入等于柱体积 5 倍的裂解缓冲液以平衡镍柱。重复此过程两次，然后放在一边。
6. 将超声处理的细菌悬浮液在 4 °C 下以 8000 × g 离心 15 分钟，以获得细菌上清液裂解物 （CL）。
7. 将 CL 加载到镍柱上（用于蛋白质吸附）以获得流出率 （FT）。
8. 用 5 倍柱体积的洗涤缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、20 mM 咪唑，pH 8.0）洗涤色谱柱，以获得洗涤洗脱液 （W1-W6）。
9. 用 1 mL 洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、250 mM 咪唑，pH 8.0）洗涤色谱柱，洗脱目标蛋白质并获得蛋白质组分 （E1-E5）。
10. 取每个馏分（CL、FT、W1-W6 和 E1-E5）的 20 μL 等分试样，并使用 SDS-PAGE¹⁸ 和考马斯亮蓝染色进行分析。PPARγ-LBD 在变性凝胶上以 34.9 kDa 蛋白的形式电泳。

3. 受体结合测定

注：在该测定中，C1-BODIPY-C12 用作位点特异性荧光探针以建立受体-配体结合系统。C1-BODIPY-C12 是 PPARγ 的特异性配体，是脂肪酸的荧光类似物，在 C1 位点将 BODIPY 荧光基团掺入脂肪酸中。

1. 在 Tris-HCl 缓冲液（20 mM Tris，100 mM NaCl，pH 8.0）中将纯化的人 PPARγ-LBD 稀释至 1 nM 至 6400 nM 的浓度范围。此外，在 Tris-HCl 缓冲液中将 C1-BODIPY-C12 探针稀释至 50 nM 的浓度。
2. 将稀释的 PPARγ-LBD 溶液（每孔 55 μL）和 C1-BODIPY-C12 探针溶液（每孔 55 μL）混合在 96 孔黑色板中。在室温下孵育 5 分钟。
3. 使用酶标仪测量荧光偏振 （FP）。
4. 根据受体浓度绘制 FP 值，使用统计和绘图软件使用 Hill 斜率方程的特异性结合拟合曲线，并计算 K_d 值。

4. 竞争性结合测定

注：在该测定中，使用 800 nM 人 PPARγ-LBD 和 50 nM C1-BODIPY-C12 探针进行受体结合。使用罗格列酮 （Rosi）、磷酸三苯酯 （TPHP） 和全氟辛烷磺酸 （PFOS） 与探针与 PPARγ 的结合竞争。

1. 在 Tris-HCl 缓冲液中稀释三种化合物，浓度范围为 0-200 μM。
2. 用终浓度为 800 nM 的人 PPARγ-LBD 和 50 nM 的 C1-BODIPY-C12 探针制备受体-探针结合溶液。
3. 在 96 孔黑色板中混合受体探针结合溶液（每孔 55 μL）和化合物溶液（每孔 55 μL）。在室温下孵育 5 分钟。
4. 使用酶标仪测量荧光偏振 （FP）。
5. 将 FP 值绘制为配体浓度的函数。使用由绘图和分析软件处理的 S 形模型从竞争曲线中获得每个配体的半数最大抑制浓度 （IC₅₀）。

结果

PPARγ-LBD 的蛋白表达和纯化
PPARγ-LBD 在 BL21 （DE3） 中作为组氨酸标记蛋白异源表达。在可溶性组分中检测到蛋白质，纯化的 PPARγ-LBD 在 SDS-PAGE 上显示一条带，表观分子量约为 34.9 kDa（图 2），与蛋白质的预测分子量一致。

C 1-BODIPY-C₁₂ 探针与 PPARγ-LBD 的结合
在受体结合试验中，以 C1-...

讨论

荧光偏振 （FP）、表面等离子体共振 （SPR） 和核磁共振 （NMR） 是用于评估蛋白质和化合物之间直接结合相互作用的常用技术^19,20。FP 已广泛用于药物发现和化学筛选的分子相互作用研究 21,22,23。相比之下，SPR 和 NMR 分析既昂贵又耗时，因此不太适合高通量...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 Probe	Thermo Fisher Scientific, China	102209-82-3	Binds to PPARγ-LBD and emits fluorescence.
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, China	6104-59-2	Stain the protein bands.
GraphPad prism	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
imidazole	Solarbio, China	I8090	Prepare buffers for the protein purification process.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Solarbio, China	367-93-1	Induce the expression of PPARγ-LBD
Microplate reader	Biotek , USA	Synergy H1	Detecting FP value
NaCl	Shanghai Reagent	7647-15-5	Prepare buffers for the protein purification process.
NaH2PO4 · 2H2O	Shanghai Reagent	13472-35-0	Prepare buffers for the protein purification process.
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, China	SA005005	Protein purification.
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	J&K Scientific Ltd, China	1763-23-1	The detected environmental pollutants
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Solarbio, China	P0100	Inhibit protein degradation.
PPARγ-Competitor Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay Kit	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)	aladdin, China	122320-73-4	The agonists of PPARγ
Shaker	ZHICHENG, China	ZWY-211C	Bacterial culture expansion and induction of protein expression
Triphenyl phosphate (TPHP)	Macklin, China	T819317	The detected environmental pollutants
Tris	Solarbio, China	T8230	Prepare buffers for the protein purification process.
Tryptone	OXOID Limited, China	LP0042B	Prepare Lysogeny Broth (LB) medium.
Ultrasonic Cleaner	Kimberly, China	LHO-1	Disrupt the bacteria to achieve complete lysis
Urea	Solarbio, China	U8020	Prepare buffers for the protein purification process.
Yeast extract	OXOID Limited, China	LP0021B	Prepare Lysogeny Broth (LB) medium.