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要約

このプロトコルは、核内受容体に結合する特定の蛍光プローブの蛍光分極を環境汚染物質のスクリーニングの読み出しとして使用するハイスループットスクリーニングシステムについて説明しています。

要約

環境中には、ますます多くの化合物が検出され、広範囲にわたる汚染を引き起こし、人間の健康にリスクをもたらしています。しかし、その高い環境発生にもかかわらず、その毒物学的影響に関する情報は非常に限られています。毒物学的研究を導くためのハイスループットスクリーニング(HTS)法の開発が急務です。本研究では、HTSシステムを用いた受容体-リガンド結合アッセイを開発し、核内受容体に対する環境汚染物質の結合力を決定しました。この試験は、マイクロプレートリーダー(つまり、さまざまな化学物質を含む96ウェルプレート)を使用して、特定の蛍光プローブの蛍光分極(FP)を測定することにより行われます。このアッセイは、組換えベクターの構築と形質転換、受容体タンパク質(リガンド結合ドメイン)の発現と精製、受容体プローブ結合、および化学物質と受容体の競合的結合の4つの部分で構成されています。2つの環境汚染物質、ペルフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)およびリン酸トリフェニル(TPHP)とペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)との結合力を決定し、アッセイ手順を例示しました。最後に、この方法の長所と短所、およびその潜在的なアプリケーションについても説明しました。

概要

環境や人体からは、多くの化学物質が広く検出されており、生態環境や人間の健康への影響について大きな懸念が生じています1,2,3。それらの高い環境発生にもかかわらず、それらの毒物学的影響に関する情報は乏しいです。そのため、化学毒性の評価を容易にするためのハイスループットスクリーニング(HTS)法の開発が急務となっています。

Tox21およびToxCastプログラムで使用されるHTSバイオアッセイなど、化学毒性評価のためのいくつかのハイスループットスクリーニング(HTS)法が報告されています4,5。これらの方法は、潜在的な毒物を迅速に特定し、化学的毒性のメカニズムに関する貴重な情報を提供することができます。しかし、これらのHTSバイオアッセイは主に細胞ベースのシステムに依存しており、複雑で高価になる可能性があります。さらに、化学物質の毒性評価にはハイスループットシーケンシング法も使用されていますが、化学物質のハイスループット評価を達成することは依然として困難です6。これまでの研究では、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)7などの核内受容体を持つ、パーフルオロアルキル化合物およびポリフルオロアルキル化合物(PFAS)7,8,9、ビスフェノールA(BPA)10,11、粒子状物質(PM)12など、いくつかの環境汚染物質の結合力を決定するための蛍光分極(FP)ベースの受容体-リガンド競合的結合アッセイが開発されました。 8,9,10,13、ファルネソイドX受容体(FXR)11,12、および甲状腺受容体(TR)14,15。このアプローチは、効率的で費用対効果が高く、メカニズムに関する洞察を提供します。

この研究では、受容体-リガンド結合アッセイのプロトコルが、小さな蛍光プローブの蛍光分極(FP)の検出に基づいて説明されています。FPベースの受容体-リガンド結合アッセイの原理を図1に示します。小さな蛍光分子が平面偏光によって励起されると、放出された光は急速な分子回転により高度に脱分極します。しかし、トレーサーがより大きな受容体に結合すると、その回転は遅くなります。トレーサーが大きな受容体に結合しているときは高いFP値が検出され、トレーサーが空いているときは低いFP値が観察されます。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)を精製して、プローブを受容体に結合させました。ロシグリタゾン(Rosi)、パーフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)、およびリン酸トリフェニル(TPHP)を使用して、プローブと受容体の結合を競いました。PPARγの特異的アゴニストであるRosiは、受容体競合的結合アッセイのポジティブコントロールとして使用されました。さらに、PFOSおよびTPHPは、過去の研究8,9,10,11,12,13,14,15,16,17において、PPARγの弱いアゴニストとして以前に同定されている。さらに、それらは環境曝露で知られる化合物のさまざまな構造カテゴリに属しており、ヒト集団での検出率が比較的高いことで注目に値します。これらの化合物を使用して、競合結合アッセイの広範な適用性をさらに検証しました。この手順は、組換えベクターの構築と形質転換、受容体タンパク質(リガンド結合ドメイン)の発現と精製、受容体プローブ結合、および化学物質と受容体の競合的結合の4つのステップで構成されています。

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プロトコル

試薬と機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1. 組換えベクターの構築と形質転換

注:PPARγは、古典的な核内受容体構造を持つリガンド依存性転写因子であり、標的遺伝子を調節するDNA結合ドメインと、リガンドによって活性化されるリガンド結合ドメインで構成されています。リガンドが活性化すると、PPARγは別の核内受容体であるレチノイドX受容体(RXR)とヘテロ二量体を形成し、PPARγの応答要素に結合することで、下流の標的遺伝子の転写を調節します9,16。

  1. PPARγ-LBDのプライマーを設計し( 表1を参照)、PPARγ-LBD DNAセグメントを増幅します( 表2 および 表3を参照)。
  2. His×6タグ付きpET28aベクターを制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびBamHI18で消化することにより、直鎖化します。
  3. 市販のクローニングキットを用いて、PPARγ-LBD DNAセグメントをHis×6タグ付きpET28aベクターにクローニングし、組換えプラスミドpET28a-PPARγ-LBD-6×His18を得ます。
  4. 組換え発現プラスミドpET28a-PPARγ-LBD-6×HisをBL21(DE3) 大腸菌 細胞にトランスフェクションし、タンパク質発現18を行います。
  5. 5 μLの組換えベクターをコンピテントBL21(DE3)細胞に加え、氷上で30分間インキュベートし、42°Cで45秒間ヒートショックを行った後、すぐに氷に戻します。
  6. 900 μL の LB 培地を加え、37 °C で 1 時間 (160-200 rpm) 振とうした後、~3000 x g で室温で 5 分間遠心分離します。
  7. 上清を捨て、バクテリアペレットを100μLのLB培地に再懸濁し、固体培地に広げます。プレートを反転させ、37°Cで12〜16時間培養します。
  8. シーケンシングの同定とその後のタンパク質発現および精製のために、個々のコロニーを選択します。

2. 受容体タンパク質の発現と精製

  1. 形質転換BL21(DE3)細胞を、100 μg/mLアンピシリンを添加した200 mL LB培地で、オービタルシェーカー(230 rpm)で37°Cで1〜2時間インキュベートします。
  2. OD600 が0.4-0.6吸光度単位に達したときに、10 μMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して細胞を誘導し、16°Cで16時間インキュベートします。
  3. 細菌懸濁液を回収し、8000 × g、4°Cで10分間遠心分離します。
  4. 20 mLの可溶性溶解バッファー(50 mMのNaH2PO4、300 mMのNaCl、10 mMのイミダゾール、pH 8.0)で細胞を溶解し、200 μLのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)と200 μLのリゾチームを加えます。5mLピペットを使用して細菌ペレットを再懸濁し、次いで30%の電力で20分間超音波処理を進める。
  5. カラム容量の5倍に等しい溶解バッファーを添加して、ニッケルカラムを平衡化します。このプロセスを2回繰り返して、取っておきます。
  6. 超音波処理した細菌懸濁液を8000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、細菌上清溶解物(CL)を得ます。
  7. CLをニッケルカラム(タンパク質吸着用)にロードして、フロースルー(FT)を取得します。
  8. カラム容量の 5 倍の洗浄バッファー (50 mM の NaH2PO4、300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール、pH 8.0) でカラムを洗浄し、洗浄溶出液 (W1-W6) を得ます。
  9. カラムを 1 mL の溶出バッファー(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、250 mM イミダゾール、pH 8.0)で洗浄して標的タンパク質を溶出し、タンパク質画分(E1-E5)を取得します。
  10. 各フラクション(CL、FT、W1-W6、E1-E5)の20 μLアリコートを採取し、SDS-PAGE18 とCoomassie Brilliant Blue染色を使用して分析します。PPARγ-LBDは、変性ゲル上で34.9 kDaのタンパク質として動作します。

3. 受容体結合アッセイ

注:このアッセイでは、C1-BODIPY-C12を部位特異的蛍光プローブとして使用して、受容体-リガンド結合系を確立しました。PPARγの特異的配位子であるC1-BODIPY-C12は、C1位の脂肪酸にBODIPY蛍光基が組み込まれた脂肪酸の蛍光類似体です。

  1. 精製したヒトPPARγ-LBDをTris-HClバッファー(20 mMのTris、100 mMのNaCl、pH 8.0)で1 nM〜6400 nMの濃度範囲に希釈します。また、C1-BODIPY-C12プローブをTris-HClバッファーで50 nMの濃度に希釈します。
  2. 希釈したPPARγ-LBD溶液(55 μL/ウェル)とC1-BODIPY-C12プローブ溶液(55 μL/ウェル)を96ウェルのブラックプレートに混合します。室温で5分間インキュベートします。
  3. マイクロプレートリーダーで蛍光偏光(FP)を測定します。
  4. 受容体濃度に対するFP値をプロットし、統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用してHill勾配方程式との特異的結合を使用して曲線を適合させ、KD 値を計算します。

4. 競合的結合アッセイ

注:このアッセイでは、800 nMのヒトPPARγ-LBDおよび50 nM C1-BODIPY-C12プローブを受容体結合に使用した。ロシグリタゾン(Rosi)、リン酸トリフェニル(TPHP)、およびパーフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)を使用して、プローブのPPARγへの結合を競合させました。

  1. Tris-HClバッファー中の3つの化合物を0〜200μMの濃度範囲で希釈します。
  2. 最終濃度800 nMのヒトPPARγ-LBDと50 nMのC1-BODIPY-C12プローブで受容体-プローブ結合溶液を調製します。
  3. 受容体プローブ結合溶液(ウェルあたり55 μL)と化合物溶液(ウェルあたり55 μL)を96ウェルブラックプレートに混合します。室温で5分間インキュベートします。
  4. マイクロプレートリーダーで蛍光偏光(FP)を測定します。
  5. FP値をリガンド濃度の関数としてプロットします。グラフ化および分析ソフトウェアによって処理されたシグモイドモデルを使用して、競合曲線から各リガンドの半値阻害濃度(IC50)を取得します。

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結果

PPARγ-LBDのタンパク質発現と精製
PPARγ-LBDは、BL21(DE3)でヒスチジンタグタンパク質として不均一に発現していました。可溶性画分中にタンパク質が検出され、精製されたPPARγ-LBDは、SDS-PAGE上に見かけの分子量約34.9 kDa(図2)の単一バンドを示し、タンパク質の予測分子量と一致しました。

C 1-BODIPY-C12...

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ディスカッション

蛍光分極(FP)、表面プラズモン共鳴(SPR)、および核磁気共鳴(NMR)は、タンパク質と化合物との間の直接結合相互作用を評価するために使用される一般的な技術である19,20。FPは、創薬や化学スクリーニングのための分子間相互作用の研究に広く利用されています21,22,23。

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開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(Grant No. 82103875)の支援を受けたものです。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
C1-BODIPY-C12 ProbeThermo Fisher Scientific, China102209-82-3Binds to PPARγ-LBD and emits fluorescence.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, China6104-59-2Stain the protein bands.
GraphPad prismDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazoleSolarbio, ChinaI8090Prepare buffers for the protein purification process.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideSolarbio, China367-93-1Induce the expression of PPARγ-LBD
Microplate readerBiotek , USASynergy H1 Detecting FP value
NaClShanghai Reagent7647-15-5Prepare buffers for the protein purification process.
NaH2PO4 · 2H2OShanghai Reagent13472-35-0Prepare buffers for the protein purification process.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, ChinaSA005005Protein purification.
Origin 8.5 OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)J&K Scientific Ltd, China1763-23-1The detected environmental pollutants
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Solarbio, ChinaP0100Inhibit protein degradation.
PPARγ-Competitor Assay KitThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay KitCayman600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)aladdin, China122320-73-4The agonists of PPARγ
ShakerZHICHENG, ChinaZWY-211CBacterial culture expansion and induction of protein expression
Triphenyl phosphate (TPHP)Macklin, ChinaT819317The detected environmental pollutants
TrisSolarbio, ChinaT8230Prepare buffers for the protein purification process.
TryptoneOXOID Limited, ChinaLP0042BPrepare Lysogeny Broth (LB) medium.
Ultrasonic CleanerKimberly, ChinaLHO-1Disrupt the bacteria to achieve complete lysis
UreaSolarbio, ChinaU8020Prepare buffers for the protein purification process.
Yeast extractOXOID Limited, ChinaLP0021BPrepare Lysogeny Broth (LB) medium.

参考文献

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  2. Naidu, R., et al. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).
  3. Ryu, H., Li, B., De Guise, S., McCutcheon, J., Lei, Y. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).
  4. Alofe, O., et al. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).
  5. Bajard, L., et al. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).
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  12. Zhang, D., et al. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).
  13. Li, C. H., Ren, X. M., Guo, L. H. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).
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