JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описывается высокопроизводительная система скрининга, которая использует флуоресцентную поляризацию специфического флуоресцентного зонда, связывающегося с ядерным рецептором, в качестве считывания для скрининга загрязнителей окружающей среды.

Аннотация

В окружающей среде было обнаружено повышение уровня соединений, вызывающих широкомасштабное загрязнение и представляющих опасность для здоровья человека. Однако, несмотря на их высокую распространенность в окружающей среде, имеется очень ограниченная информация об их токсикологическом воздействии. Необходимо в срочном порядке разработать методы высокопроизводительного скрининга (ВТСП) для руководства токсикологическими исследованиями. В этом исследовании был разработан анализ связывания рецептор-лиганд с использованием системы HTS для определения связывающей активности загрязнителей окружающей среды на ядерных рецепторах. Испытание проводится с помощью считывателя микропланшетов (т.е. 96-луночного планшета, содержащего различные химические вещества) путем измерения поляризации флуоресценции (ФП) конкретного флуоресцентного зонда. Этот анализ состоит из четырех частей: построение и трансформация рекомбинантных векторов, экспрессия и очистка рецепторного белка (лиганд-связывающего домена), связывание рецептор-зонд и конкурентное связывание химических веществ с рецептором. Для иллюстрации процедуры анализа была определена связывающая способность двух загрязнителей окружающей среды, перфтороктансульфоновой кислоты (ПФОС) и трифенилфосфата (ТФГ), с гамма-рецептором, активируемым пролифератором пероксисом (PPARγ). Наконец, были также обсуждены преимущества и недостатки этого метода и его потенциальные применения.

Введение

Большое количество химических веществ было широко обнаружено в окружающей среде и организме человека, что вызывает серьезную обеспокоенность по поводу их воздействия на экологическую среду и здоровье человека 1,2,3. Несмотря на их высокую распространенность в окружающей среде, информация об их токсикологическом воздействии скудна. В связи с этим необходимо срочно разработать методы высокопроизводительного скрининга (ВТСП) для облегчения оценки химической токсичности.

Сообщалось о нескольких высокопроизводительных методах скрининга (HTS) для оценки химической токсичности, таких как биотесты HTS, используемые в программах Tox21 и ToxCast 4,5. Эти методы позволяют быстро выявлять потенциальные токсиканты и получать ценную информацию о механизмах химической токсичности. Тем не менее, эти биотесты HTS в основном основаны на клеточных системах, которые могут быть сложными и дорогими. Кроме того, для оценки химической токсичности также используются методы высокопроизводительного секвенирования, но достижение высокопроизводительной оценки химических веществ остается сложной задачей6. В предыдущих исследованиях были разработаны анализы конкурентного связывания рецептор-лиганд на основе флуоресцентной поляризации (FP) для определения связывающей активности нескольких загрязнителей окружающей среды, включая пер- и полифторалкильные вещества (PFAS)7,8,9, бисфенол А (BPA)10,11 и твердые частицы (PM)12, с ядерными рецепторами, такими как рецептор, активируемый пролифератором пероксисом (PPAR)7, 8,9,10,13, фарнезоидный X-рецептор (FXR)11,12 и рецептор щитовидной железы (TR)14,15. Такой подход является эффективным, экономичным и позволяет получить механистическую информацию.

В данном исследовании протокол анализа связывания рецептор-лиганд описан на основе детектирования флуоресцентной поляризации (ФП) малого флуоресцентного зонда. Принцип анализа связывания рецептор-лиганд на основе FP проиллюстрирован на рисунке 1. Когда маленькая флуоресцентная молекула возбуждается плоскополяризованным светом, излучаемый свет становится сильно деполяризованным из-за быстрого вращения молекул. Однако, когда индикатор связывается с более крупным рецептором, его вращение замедляется. Высокое значение FP обнаруживается, когда индикатор связан с большим рецептором, в то время как низкое значение FP наблюдается, когда индикатор свободен. Рецептор гамма, активируемый пролифератором пероксисом (PPARγ), очищали для связывания зонда с рецептором. Росиглитазон (РОЗИ), перфтороктансульфоновая кислота (ПФОС) и трифенилфосфат (ТФГ) использовались для борьбы за связывание зонда с рецептором. Rosi, специфический агонист PPARγ, использовался в качестве положительного контроля в анализах конкурентного связывания рецепторов. Кроме того, в предыдущих исследованиях ПФОС и ТФГ были ранее идентифицированы как слабые агонисты PPARγ 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Кроме того, они принадлежат к различным структурным категориям соединений, известных своим воздействием на окружающую среду, и отличаются относительно высокими показателями обнаружения в человеческих популяциях. Эти соединения были использованы для дальнейшей проверки широкой применимости анализа связывания с конкуренцией. Процедура состоит из четырех этапов: построение и трансформация рекомбинантных векторов, экспрессия и очистка рецепторного белка (лиганд-связывающего домена), связывание рецептор-зонд и конкурентное связывание химических веществ с рецептором.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании указана в Таблице материалов.

1. Построение и преобразование рекомбинантных векторов

PPARγ является лиганд-зависимым транскрипционным фактором с классической структурой ядерного рецептора, включающим ДНК-связывающий домен, регулирующий гены-мишени, и лиганд-связывающий домен, активируемый лигандами. При активации лиганда PPARγ образует гетеродимер с другим ядерным рецептором, ретиноидным X-рецептором (RXR), и связывается с ответными элементами PPARγ, тем самым регулируя транскрипцию нижестоящих генов-мишеней 9,16.

  1. Спроектируйте праймеры для PPARγ-LBD (см. Таблицу 1) и амплифицируйте сегмент ДНК PPARγ-LBD (см. Таблицу 2 и Таблицу 3).
  2. Линеаризовать меченный His×6 вектор pET28a путем его расщепления эндонуклеазами рестрикции XhoI и BamHI18.
  3. Клонируйте сегмент ДНК PPARγ-LBD в меченый His×6 вектор pET28a с использованием коммерчески доступного набора для клонирования, в результате чего получится рекомбинантная плазмида pET28a-PPARγ-LBD-6×His18.
  4. Трансфектировать рекомбинантную экспрессию плазмиды pET28a-PPARγ-LBD-6×His в клетки BL21 (DE3) Escherichia coli для экспрессии белка18.
  5. Добавьте 5 μL рекомбинантного вектора в компетентные клетки BL21(DE3), инкубируйте на льду в течение 30 минут, выполните тепловой шок при 42 °C в течение 45 секунд, затем немедленно вернитесь на лед.
  6. Добавьте 900 μL LB среды, встряхните при 37 °C в течение 1 часа (160-200 об/мин), затем центрифугируйте при ~3000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 100 мкл среды LB и распределите на твердую среду. Переверните планшеты и закваску при температуре 37 °C в течение 12-16 часов.
  8. Отбор отдельных колоний для секвенирования, идентификации и последующей экспрессии и очистки белков.

2. Экспрессия и очистка рецепторного белка

  1. Трансформированные клетки BL21 (DE3) инкубируют в среде объемом 200 мл LB с добавлением ампициллина 100 мкг/мл на орбитальном шейкере (230 об/мин) в течение 1-2 ч при 37 °C.
  2. Индуцируют клетки, когда OD600 достигает 0,4-0,6 единиц абсорбции путем добавления 10 мкМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранзида (IPTG) и инкубируют при 16 °C в течение 16 ч.
  3. Соберите бактериальную суспензию и центрифугируйте при 8000 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
  4. Лизировать клетки в 20 мл растворимого лизисного буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, pH 8,0), добавив 200 мкл фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и 200 мкл лизоцима. Повторно суспендируйте бактериальную гранулу с помощью пипетки объемом 5 мл, затем продолжайте ультразвуковую обработку при мощности 30% в течение 20 минут.
  5. Добавьте буфер для лизиса, равный 5-кратному объему колонки, чтобы уравновесить никелевую колонну. Повторите этот процесс дважды и отложите в сторону.
  6. Центрифугирование ультразвуковой бактериальной суспензии при 8000 × г в течение 15 мин при 4 °C с получением лизата надосадочной жидкости бактерий (CL).
  7. Загрузите CL на никелевую колонку (для адсорбции белка) для получения проточного (FT).
  8. Промойте колонку в 5 раз большим объемом промывочного буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, pH 8,0) для получения промывочного элюата (W1-W6).
  9. Промойте колонку 1 мл элюирующего буфера (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, pH 8,0) для элюирования целевого белка и получения белковых фракций (E1-E5).
  10. Возьмите аликвоту объемом 20 мкл каждой фракции (CL, FT, W1-W6 и E1-E5) и проанализируйте с помощью SDS-PAGE18 с окрашиванием Coomassie Brilliant Blue. PPARγ-LBD работает как белок с массой 34,9 кДа на денатурирующем геле.

3. Анализ связывания рецепторов

Примечание: В этом анализе C1-BODIPY-C12 использовали в качестве сайт-специфичного флуоресцентного зонда для установления системы связывания рецептор-лиганд. C1-BODIPY-C12, специфический лиганд для PPARγ, представляет собой флуоресцентный аналог жирной кислоты с флуоресцентной группой BODIPY, включенной в жирную кислоту в положении C1.

  1. Разведите очищенный человеческий PPARγ-LBD в буфере Tris-HCl (20 мМ Tris, 100 мМ NaCl, pH 8,0) до диапазона концентраций от 1 нМ до 6400 нМ. Кроме того, разведите зонд C1-BODIPY-C12 в буфере Tris-HCl до концентрации 50 нМ.
  2. Смешайте разбавленный раствор PPARγ-LBD (55 μл на лунку) и раствор зонда C1-BODIPY-C12 (55 μл на лунку) в 96-луночной черной пластине. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  3. Измерьте поляризацию флуоресценции (FP) с помощью считывателя микропланшетов.
  4. Нанесите диаграмму значений FP в зависимости от концентрации рецептора, сопоставьте кривую с помощью специфической связи с уравнением склона Хилла с помощью статистического и графического программного обеспечения и рассчитайте значение Kd .

4. Конкурентный анализ связывания

Примечание: В этом анализе для связывания рецепторов использовали 800 нМ человеческого зонда PPARγ-LBD и 50 нМ зонда C1-BODIPY-C12. Росиглитазон (Rosi), трифенилфосфат (TPHP) и перфтороктансульфоновая кислота (PFOS) использовались для конкуренции с связыванием зонда с PPARγ.

  1. Разбавьте три соединения в буфере Tris-HCl в диапазоне концентраций от 0 до 200 мкМ.
  2. Готовят раствор для связывания рецептора и зонда с конечной концентрацией 800 нМ человеческого PPARγ-LBD и 50 нМ зонда C1-BODIPY-C12.
  3. Смешайте раствор для связывания рецептора и зонда (55 л на лунку) и раствор соединения (55 л на лунку) в 96-луночной черной пластине. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  4. Измерьте поляризацию флуоресценции (FP) с помощью считывателя микропланшетов.
  5. Построение графика значений FP в зависимости от концентрации лиганда. Получите полумаксимальную ингибиторную концентрацию (IC50) каждого лиганда из кривой конкуренции с помощью сигмоидальной модели, обработанной программным обеспечением для построения графиков и анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Экспрессия белка и очистка PPARγ-LBD
PPARγ-LBD гетерологически экспрессировался в BL21 (DE3) в виде белка, меченного гистидином. Белок был обнаружен в растворимых фракциях, и очищенный PPARγ-LBD показал одну полосу на SDS-PAGE с видимой молекулярной массой около 34,9 кДа (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Флуоресцентная поляризация (ФП), поверхностный плазмонный резонанс (СПР) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) являются распространенными методами, используемыми для оценки прямых взаимодействий между белками и соединениями19,20. FP широко ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 82103875).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
C1-BODIPY-C12 ProbeThermo Fisher Scientific, China102209-82-3Binds to PPARγ-LBD and emits fluorescence.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, China6104-59-2Stain the protein bands.
GraphPad prismDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazoleSolarbio, ChinaI8090Prepare buffers for the protein purification process.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideSolarbio, China367-93-1Induce the expression of PPARγ-LBD
Microplate readerBiotek , USASynergy H1 Detecting FP value
NaClShanghai Reagent7647-15-5Prepare buffers for the protein purification process.
NaH2PO4 · 2H2OShanghai Reagent13472-35-0Prepare buffers for the protein purification process.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, ChinaSA005005Protein purification.
Origin 8.5 OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)J&K Scientific Ltd, China1763-23-1The detected environmental pollutants
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Solarbio, ChinaP0100Inhibit protein degradation.
PPARγ-Competitor Assay KitThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay KitCayman600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)aladdin, China122320-73-4The agonists of PPARγ
ShakerZHICHENG, ChinaZWY-211CBacterial culture expansion and induction of protein expression
Triphenyl phosphate (TPHP)Macklin, ChinaT819317The detected environmental pollutants
TrisSolarbio, ChinaT8230Prepare buffers for the protein purification process.
TryptoneOXOID Limited, ChinaLP0042BPrepare Lysogeny Broth (LB) medium.
Ultrasonic CleanerKimberly, ChinaLHO-1Disrupt the bacteria to achieve complete lysis
UreaSolarbio, ChinaU8020Prepare buffers for the protein purification process.
Yeast extractOXOID Limited, ChinaLP0021BPrepare Lysogeny Broth (LB) medium.

Ссылки

  1. Maddela, N. R., Ramakrishnan, B., Dueñas-Rivadeneira, A. A., Venkateswarlu, K., Megharaj, M. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).
  2. Naidu, R., et al. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).
  3. Ryu, H., Li, B., De Guise, S., McCutcheon, J., Lei, Y. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).
  4. Alofe, O., et al. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).
  5. Bajard, L., et al. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).
  6. Chen, Q., Chou, W. C., Lin, Z. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).
  7. Li, C. H., Ren, X. M., Cao, L. Y., Qin, W. P., Guo, L. H. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).
  8. Li, C. H., et al. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).
  9. Li, C. H., Shi, Y. L., Li, M., Guo, L. H., Cai, Y. Q. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).
  10. Li, C. H., Zhang, D. H., Jiang, L. D., Qi, Y., Guo, L. H. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).
  11. Zhang, D., et al. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).
  12. Zhang, D., et al. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).
  13. Li, C. H., Ren, X. M., Guo, L. H. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).
  14. Qin, W. P., Li, C. H., Guo, L. H., Ren, X. M., Zhang, J. Q. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).
  15. Ren, X. M., Li, C. H., Zhang, J. Q., Guo, L. H. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).
  16. Evans, N., et al. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).
  17. Kim, S., et al. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).
  18. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  19. Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  20. Hu, J., Kim, J., Hilty, C. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).
  21. LeBlanc, E. V., Shekhar-Guturja, T., Whitesell, L., Cowen, L. E. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).
  22. Huang, X., Aulabaugh, A. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).
  23. Seethala, R., et al. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).
  24. Hu, W., et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).
  25. Weatherman, R. V., Fletterick, R. J., Scanlan, T. S. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).
  26. Khazaee, M., et al. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).
  27. de Vera, I. M. S., et al. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).
  28. Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B., Eremin, S. A. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).
  29. Liu, C., et al. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены