Une approche de criblage à haut débit pour évaluer l’affinité de liaison des polluants environnementaux aux récepteurs nucléaires

Résumé

Ce protocole décrit un système de criblage à haut débit qui utilise la polarisation de fluorescence d’une sonde fluorescente spécifique se liant à un récepteur nucléaire comme lecture pour le dépistage des polluants environnementaux.

Résumé

Des niveaux croissants de composés ont été détectés dans l’environnement, provoquant une pollution généralisée et posant des risques pour la santé humaine. Cependant, malgré leur forte présence dans l’environnement, il existe très peu d’informations concernant leurs effets toxicologiques. Il est urgent de développer des méthodes de criblage à haut débit (HTS) pour guider les études toxicologiques. Dans cette étude, un test de liaison récepteur-ligand à l’aide d’un système HTS a été mis au point pour déterminer le pouvoir de liaison des polluants environnementaux sur les récepteurs nucléaires. L’essai est effectué à l’aide d’un lecteur de microplaques (c’est-à-dire une plaque de 96 puits contenant divers produits chimiques) en mesurant la polarisation de fluorescence (FP) d’une sonde fluorescente spécifique. Ce test se compose de quatre parties : la construction et la transformation de vecteurs recombinants, l’expression et la purification de la protéine réceptrice (domaine de liaison au ligand), la liaison récepteur-sonde et la liaison compétitive des produits chimiques avec le récepteur. Le pouvoir de liaison de deux polluants environnementaux, l’acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) et le phosphate de triphényle (TPHP), avec le récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARγ) a été déterminé pour illustrer la procédure d’essai. Enfin, les avantages et les inconvénients de cette méthode et ses applications potentielles ont également été abordés.

Introduction

Un grand nombre de produits chimiques ont été largement détectés dans l’environnement et le corps humain, ce qui soulève d’importantes préoccupations quant à leur impact sur l’environnement écologique et la santé humaine ^1,2,3. Malgré leur forte présence dans l’environnement, les informations concernant leurs effets toxicologiques sont rares. Par conséquent, il est urgent de développer des méthodes de criblage à haut débit (HTS) pour faciliter l’évaluation de la toxicité chimique.

Plusieurs méthodes de dépistage à haut débit (HTS) ont été signalées pour l’évaluation de la toxicité chimique, telles que les bioessais HTS utilisés dans les programmes Tox21 et ToxCast ^4,5. Ces méthodes permettent d’identifier rapidement les toxiques potentiels et de fournir des informations précieuses sur les mécanismes de toxicité chimique. Cependant, ces bioessais HTS reposent principalement sur des systèmes cellulaires, qui peuvent être complexes et coûteux. De plus, des méthodes de séquençage à haut débit ont également été utilisées pour l’évaluation de la toxicité chimique, mais l’évaluation à haut débit des produits chimiques reste difficile⁶. Des études antérieures ont mis au point des tests de liaison compétitive récepteur-ligand basés sur la polarisation de fluorescence (FP) pour déterminer le pouvoir de liaison de plusieurs polluants environnementaux, y compris les substances per- et polyfluoroalkylées (PFAS)^7,8,9, le bisphénol A (BPA)^10,11 et les matières particulaires (PM)¹², avec des récepteurs nucléaires tels que le récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR)^7, 8,9,10,13, récepteur farnésoïde X (FXR)^11,12 et récepteur thyroïdien (TR)^14,15. Cette approche est efficace, rentable et fournit des informations mécanistes.

Dans cette étude, le protocole de l’essai de liaison récepteur-ligand est décrit sur la base de la détection de la polarisation de fluorescence (FP) d’une petite sonde fluorescente. Le principe de l’essai de liaison récepteur-ligand basé sur la FP est illustré à la figure 1. Lorsqu’une petite molécule fluorescente est excitée par une lumière polarisée dans un plan, la lumière émise devient fortement dépolarisée en raison de la rotation moléculaire rapide. Cependant, lorsque le traceur se lie à un récepteur plus grand, sa rotation est ralentie. Une valeur FP élevée est détectée lorsque le traceur est lié au grand récepteur, tandis qu’une faible valeur FP est observée lorsque le traceur est libre. Le récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARγ) a été purifié pour la liaison de la sonde au récepteur. La rosiglitazone (Rosi), l’acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) et le phosphate de triphényle (TPHP) ont été utilisés pour rivaliser pour la liaison de la sonde avec le récepteur. Rosi, un agoniste spécifique de PPARγ, a été utilisé comme témoin positif dans les essais de liaison compétitive des récepteurs. De plus, le PFOS et le TPHP ont déjà été identifiés comme des agonistes faibles du PPARγ dans des études antérieures 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. De plus, ils appartiennent à différentes catégories structurelles de composés connus pour leur exposition environnementale et se distinguent par leurs taux de détection relativement élevés dans les populations humaines. Ces composés ont été utilisés pour valider davantage l’applicabilité générale de l’essai de liaison à la concurrence. La procédure comprend quatre étapes : la construction et la transformation des vecteurs recombinants, l’expression et la purification de la protéine réceptrice (domaine de liaison ligand), la liaison récepteur-sonde et la liaison compétitive des produits chimiques avec le récepteur.

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Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Construction et transformation de vecteurs recombinants

REMARQUE : PPARγ est un facteur de transcription dépendant du ligand avec une structure de récepteur nucléaire classique, comprenant un domaine de liaison à l’ADN qui régule les gènes cibles et un domaine de liaison au ligand activé par les ligands. Lors de l’activation du ligand, PPARγ forme un hétérodimère avec un autre récepteur nucléaire, le récepteur rétinoïde X (RXR), et se lie aux éléments de réponse de PPARγ, régulant ainsi la transcription des gènes cibles en aval ^9,16.

1. Concevoir des amorces pour le PPARγ-LBD (voir le tableau 1) et amplifier le segment d’ADN du PPARγ-LBD (voir le tableau 2 et le tableau 3).
2. Linéariser le vecteur pET28a marqué His×6 en le digérant avec les endonucléases de restriction XhoI et BamHI¹⁸.
3. Clonez le segment d’ADN PPARγ-LBD dans le vecteur pET28a marqué His×6 à l’aide du kit de clonage disponible dans le commerce, ce qui permet d’obtenir le plasmide recombinant pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸.
4. Transfectez le plasmide d’expression recombinant pET28a-PPARγ-LBD-6×His dans des cellules BL21 (DE3) d’Escherichia coli pour l’expression de la protéine¹⁸.
5. Ajouter 5 μL du vecteur recombinant aux cellules BL21(DE3) compétentes, incuber sur la glace pendant 30 min, effectuer un choc thermique à 42 °C pendant 45 s, puis retourner immédiatement dans la glace.
6. Ajouter 900 μL de milieu LB, agiter à 37 °C pendant 1 h (160-200 tr/min), puis centrifuger à ~3000 x g pendant 5 min à température ambiante.
7. Jeter le surnageant, remettre la pastille bactérienne en suspension dans 100 μL de milieu LB et l’étaler sur un milieu solide. Retournez les plaques et cultivez à 37 °C pendant 12 à 16 h.
8. Sélectionner des colonies individuelles pour l’identification du séquençage et l’expression et la purification ultérieures des protéines.

2. Expression et purification de la protéine réceptrice

1. Incuber les cellules BL21 (DE3) transformées dans un milieu de 200 mL LB complété par 100 μg/mL d’ampicilline sur un agitateur orbital (230 tr/min) pendant 1 à 2 h à 37 °C.
2. Induire les cellules lorsque l’OD₆₀₀ atteint 0,4-0,6 unités d’absorbance en ajoutant 10 μM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et incuber à 16 °C pendant 16 h.
3. Recueillir la suspension bactérienne et centrifuger à 8000 × g, 4 °C, pendant 10 min.
4. Lyser les cellules dans un tampon de lyse soluble de 20 mL (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 10 mM d’imidazole, pH 8,0), en ajoutant 200 μL de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et 200 μL de lysozyme. Remettre la pastille bactérienne en suspension à l’aide d’une pipette de 5 mL, puis procéder à la sonication à 30 % de puissance pendant 20 min.
5. Ajouter un tampon de lyse égal à 5 fois le volume de la colonne pour équilibrer la colonne de nickel. Répétez ce processus deux fois et mettez-le de côté.
6. Centrifuger la suspension bactérienne soniquée à 8000 × g pendant 15 min à 4 °C pour obtenir le lysat surnageant bactérien (CL).
7. Chargez le CL sur la colonne de nickel (pour l’adsorption des protéines) pour obtenir le flux continu (FT).
8. Laver la colonne avec 5 fois le volume de la colonne de tampon de lavage (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 20 mM d’imidazole, pH 8,0) pour obtenir l’éluat de lavage (W1-W6).
9. Laver la colonne avec 1 mL de tampon d’élution (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8,0) pour éluer la protéine cible et obtenir les fractions protéiques (E1-E5).
10. Prélever une aliquote de 20 μL de chaque fraction (CL, FT, W1-W6 et E1-E5) et analyser à l’aide de la norme SDS-PAGE¹⁸ avec coloration au bleu brillant de Coomassie. PPARγ-LBD fonctionne sous la forme d’une protéine de 34,9 kDa sur un gel dénaturant.

3. Essai de liaison au récepteur

REMARQUE : Dans cet essai, C1-BODIPY-C12 a été utilisé comme sonde fluorescente spécifique au site pour établir le système de liaison récepteur-ligand. C1-BODIPY-C12, un ligand spécifique de PPARγ, est un analogue fluorescent de l’acide gras avec le groupe fluorescent BODIPY incorporé dans l’acide gras en position C1.

1. Diluer le PPARγ-LBD humain purifié dans un tampon Tris-HCl (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 8,0) jusqu’à une plage de concentration de 1 nM à 6400 nM. Diluez également la sonde C1-BODIPY-C12 dans un tampon Tris-HCl à une concentration de 50 nM.
2. Mélanger la solution diluée de PPARγ-LBD (55 μL par puits) et la solution de sonde C1-BODIPY-C12 (55 μL par puits) dans une plaque noire de 96 puits. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
3. Mesurez la polarisation de fluorescence (FP) avec le lecteur de microplaques.
4. Tracez les valeurs FP en fonction de la concentration du récepteur, ajustez la courbe à l’aide de la liaison spécifique avec l’équation de pente de Hill à l’aide d’un logiciel statistique et graphique, et calculez la valeur_{K d} .

4. Essai de liaison concurrentiel

REMARQUE : Dans ce test, 800 nM de PPARγ-LBD humain et 50 nM de sonde C1-BODIPY-C12 ont été utilisés pour la liaison au récepteur. La rosiglitazone (Rosi), le phosphate de triphényle (TPHP) et l’acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) ont été utilisés pour concurrencer la liaison de la sonde au PPARγ.

1. Diluer les trois composés dans le tampon Tris-HCl dans une plage de concentration de 0 à 200 μM.
2. Préparer la solution de liaison récepteur-sonde avec une concentration finale de 800 nM de PPARγ-LBD humain et de 50 nM de sonde C1-BODIPY-C12.
3. Mélangez la solution de liaison récepteur-sonde (55 μL par puits) et la solution composée (55 μL par puits) dans une plaque noire à 96 puits. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
4. Mesurez la polarisation de fluorescence (FP) avec le lecteur de microplaques.
5. Tracez les valeurs FP en fonction de la concentration du ligand. Obtenir la concentration inhibitrice demi-maximale (CI₅₀) de chaque ligand de la courbe de compétition à l’aide du modèle sigmoïdal traité par un logiciel de graphisme et d’analyse.

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Résultats

Expression protéique et purification de PPARγ-LBD
PPARγ-LBD a été exprimé de manière hétérologue dans BL21 (DE3) sous la forme d’une protéine marquée à l’histidine. La protéine a été détectée dans les fractions solubles, et le PPARγ-LBD purifié a montré une seule bande sur SDS-PAGE avec une masse moléculaire apparente d’environ 34,9 kDa (figure 2), ce qui correspond à la masse moléculaire prédite de la proté...

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Discussion

La polarisation de fluorescence (FP), la résonance plasmonique de surface (SPR) et la résonance magnétique nucléaire (RMN) sont des techniques couramment utilisées pour évaluer les interactions de liaison directe entre les protéines et les composés^19,20. La PF a été largement utilisée dans l’étude des interactions moléculaires pour la découverte de médicaments et le criblage chimique 21,22,23.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 Probe	Thermo Fisher Scientific, China	102209-82-3	Binds to PPARγ-LBD and emits fluorescence.
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, China	6104-59-2	Stain the protein bands.
GraphPad prism	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
imidazole	Solarbio, China	I8090	Prepare buffers for the protein purification process.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Solarbio, China	367-93-1	Induce the expression of PPARγ-LBD
Microplate reader	Biotek , USA	Synergy H1	Detecting FP value
NaCl	Shanghai Reagent	7647-15-5	Prepare buffers for the protein purification process.
NaH2PO4 · 2H2O	Shanghai Reagent	13472-35-0	Prepare buffers for the protein purification process.
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, China	SA005005	Protein purification.
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	J&K Scientific Ltd, China	1763-23-1	The detected environmental pollutants
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Solarbio, China	P0100	Inhibit protein degradation.
PPARγ-Competitor Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay Kit	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)	aladdin, China	122320-73-4	The agonists of PPARγ
Shaker	ZHICHENG, China	ZWY-211C	Bacterial culture expansion and induction of protein expression
Triphenyl phosphate (TPHP)	Macklin, China	T819317	The detected environmental pollutants
Tris	Solarbio, China	T8230	Prepare buffers for the protein purification process.
Tryptone	OXOID Limited, China	LP0042B	Prepare Lysogeny Broth (LB) medium.
Ultrasonic Cleaner	Kimberly, China	LHO-1	Disrupt the bacteria to achieve complete lysis
Urea	Solarbio, China	U8020	Prepare buffers for the protein purification process.
Yeast extract	OXOID Limited, China	LP0021B	Prepare Lysogeny Broth (LB) medium.