Un enfoque de cribado de alto rendimiento para evaluar la afinidad de unión de los contaminantes ambientales a los receptores nucleares

Resumen

Este protocolo describe un sistema de cribado de alto rendimiento que utiliza la polarización de fluorescencia de una sonda fluorescente específica que se une a un receptor nuclear como lectura para el cribado de contaminantes ambientales.

Resumen

Se han detectado niveles crecientes de compuestos en el medio ambiente, lo que causa una contaminación generalizada y plantea riesgos para la salud humana. Sin embargo, a pesar de su alta incidencia ambiental, existe muy poca información sobre sus efectos toxicológicos. Es urgente desarrollar métodos de cribado de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés) para guiar los estudios toxicológicos. En este estudio, se desarrolló un ensayo de unión receptor-ligando utilizando un sistema HTS para determinar la potencia de unión de contaminantes ambientales en receptores nucleares. La prueba se lleva a cabo utilizando un lector de microplacas (es decir, una placa de 96 pocillos que contiene varios productos químicos) midiendo la polarización de fluorescencia (FP) de una sonda fluorescente específica. Este ensayo consta de cuatro partes: la construcción y transformación de vectores recombinantes, la expresión y purificación de la proteína receptora (dominio de unión al ligando), la unión receptor-sonda y la unión competitiva de productos químicos con el receptor. Para ilustrar el procedimiento de ensayo, se determinó la potencia de unión de dos contaminantes ambientales, el ácido perfluorooctanosulfónico (PFOS) y el fosfato de trifenilo (TPHP), con el receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPARγ). Finalmente, también se discutieron las ventajas y desventajas de este método y sus posibles aplicaciones.

Introducción

Se ha detectado ampliamente un gran número de sustancias químicas en el medio ambiente y en el cuerpo humano, lo que plantea importantes preocupaciones sobre su impacto en el entorno ecológico y la salud humana ^1,2,3. A pesar de su alta incidencia ambiental, la información sobre sus efectos toxicológicos es escasa. Por lo tanto, es urgente desarrollar métodos de cribado de alto rendimiento (HTS) para facilitar la evaluación de la toxicidad química.

Se han descrito varios métodos de cribado de alto rendimiento (HTS) para la evaluación de la toxicidad química, como los bioensayos HTS utilizados en los programas Tox21 y ToxCast ^4,5. Estos métodos pueden identificar rápidamente los tóxicos potenciales y proporcionar información valiosa sobre los mecanismos de la toxicidad química. Sin embargo, estos bioensayos HTS se basan principalmente en sistemas basados en células, que pueden ser complejos y costosos. Además, también se han utilizado métodos de secuenciación de alto rendimiento para la evaluación de la toxicidad química, pero lograr una evaluación de alto rendimiento de los productos químicos sigue siendo un desafío⁶. Estudios previos han desarrollado ensayos de unión competitiva receptor-ligando basados en polarización de fluorescencia (FP) para determinar la potencia de unión de varios contaminantes ambientales, incluidas las sustancias perfluoroalquiladas y polifluoroalquiladas (PFAS)^7,8,9, el bisfenol A (BPA)^10,11 y el material particulado (PM)¹², con receptores nucleares como el receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPAR)^7, 8,9,10,13, receptor X farnesoide (FXR)^11,12 y receptor tiroideo (TR)^14,15. Este enfoque es eficiente, rentable y proporciona información mecanicista.

En este estudio, se describe el protocolo para el ensayo de unión receptor-ligando basado en la detección de la polarización de fluorescencia (FP) de una pequeña sonda fluorescente. El principio del ensayo de unión receptor-ligando basado en FP se ilustra en la Figura 1. Cuando una pequeña molécula fluorescente es excitada por luz polarizada plana, la luz emitida se vuelve altamente despolarizada debido a la rápida rotación molecular. Sin embargo, cuando el marcador se une a un receptor más grande, su rotación se ralentiza. Un valor alto de FP se detecta cuando el trazador está unido al receptor grande, mientras que un valor bajo de FP se observa cuando el trazador está libre. El receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPARγ) se purificó para la unión de la sonda al receptor. Se utilizaron rosiglitazona (Rosi), ácido perfluorooctanosulfónico (PFOS) y fosfato de trifenilo (TPHP) para competir por la unión de la sonda con el receptor. Rosi, un agonista específico de PPARγ, se utilizó como control positivo en los ensayos de unión competitiva al receptor. Además, el PFOS y el TPHP han sido identificados previamente como agonistas débiles de PPARγ en estudios anteriores 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Además, pertenecen a diferentes categorías estructurales de compuestos conocidos por su exposición ambiental y son notables por sus tasas de detección relativamente altas en las poblaciones humanas. Estos compuestos se utilizaron para validar aún más la amplia aplicabilidad del ensayo de unión de competencia. El procedimiento consta de cuatro etapas: construcción y transformación de vectores recombinantes, expresión y purificación de la proteína receptora (dominio de unión al ligando), unión receptor-sonda y unión competitiva de productos químicos con el receptor.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Construcción y transformación de vectores recombinantes

NOTA: PPARγ es un factor de transcripción dependiente de ligando con una estructura de receptor nuclear clásica, que comprende un dominio de unión al ADN que regula los genes diana y un dominio de unión al ligando activado por los ligandos. Tras la activación del ligando, PPARγ forma un heterodímero con otro receptor nuclear, el receptor X retinoide (RXR), y se une a los elementos de respuesta de PPARγ, regulando así la transcripción de los genes diana posteriores ^9,16.

1. Diseñe cebadores para el PPARγ-LBD (ver Tabla 1) y amplifique el segmento de ADN PPARγ-LBD (ver Tabla 2 y Tabla 3).
2. Linealizar el vector pET28a marcado con His×6 digiriéndolo con endonucleasas de restricción XhoI y BamHI¹⁸.
3. Clonar el segmento de ADN PPARγ-LBD en el vector pET28a marcado con His×6 utilizando el kit de clonación disponible comercialmente, lo que da como resultado el plásmido recombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸.
4. Transfectar el plásmido de expresión recombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His en células de Escherichia coli BL21 (DE3) para la expresión de proteínas¹⁸.
5. Añadir 5 μL del vector recombinante a las células BL21(DE3) competentes, incubar en hielo durante 30 min, realizar un choque térmico a 42 °C durante 45 s y, a continuación, volver inmediatamente al hielo.
6. Agregue 900 μL de medio LB, agite a 37 °C durante 1 h (160-200 rpm), luego centrifugue a ~ 3000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
7. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet bacteriano en 100 μL de medio LB y extiéndalo sobre un medio sólido. Invertir las placas y el cultivo a 37 °C durante 12-16 h.
8. Seleccionar colonias individuales para la secuenciación, identificación y posterior expresión y purificación de proteínas.

2. Expresión y purificación de la proteína receptora

1. Incubar las células BL21 (DE3) transformadas en 200 mL de medio LB suplementado con 100 μg/mL de ampicilina en un agitador orbital (230 rpm) durante 1-2 h a 37 °C.
2. Inducir las células cuando el OD₆₀₀ alcance 0,4-0,6 unidades de absorbancia añadiendo 10 μM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e incubar a 16 °C durante 16 h.
3. Recoja la suspensión bacteriana y centrifugue a 8000 × g, 4 °C, durante 10 min.
4. Lisar las células en 20 mL de tampón de lisis soluble (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8,0), añadiendo 200 μL de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 200 μL de lisozima. Vuelva a suspender el pellet bacteriano con una pipeta de 5 mL, y luego proceda con la sonicación al 30% de potencia durante 20 min.
5. Agregue un tampón de lisis igual a 5 veces el volumen de la columna para equilibrar la columna de níquel. Repite este proceso dos veces y reserva.
6. Centrifugar la suspensión bacteriana sonicada a 8000 × g durante 15 min a 4 °C para obtener el lisado de sobrenadante bacteriano (CL).
7. Cargue el CL en la columna de níquel (para la adsorción de proteínas) para obtener el flujo continuo (FT).
8. Lavar la columna con 5 veces el volumen de la columna de tampón de lavado (50 mM de NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 8,0) para obtener el eluido de lavado (W1-W6).
9. Lavar la columna con 1 mL de tampón de elución (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) para eluir la proteína objetivo y obtener las fracciones proteicas (E1-E5).
10. Tome una alícuota de 20 μL de cada fracción (CL, FT, W1-W6 y E1-E5) y analice usando SDS-PAGE¹⁸ con tinción Coomassie Brilliant Blue. PPARγ-LBD funciona como una proteína de 34,9 kDa en un gel desnaturalizante.

3. Ensayo de unión al receptor

NOTA: En este ensayo, C1-BODIPY-C12 se utilizó como sonda fluorescente de sitio específico para establecer el sistema de unión receptor-ligando. C1-BODIPY-C12, un ligando específico para PPARγ, es un análogo fluorescente del ácido graso con el grupo fluorescente BODIPY incorporado en el ácido graso en la posición C1.

1. Diluir el PPARγ-LBD humano purificado en tampón Tris-HCl (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 8,0) hasta un rango de concentración de 1 nM a 6400 nM. Además, diluya la sonda C1-BODIPY-C12 en tampón Tris-HCl a una concentración de 50 nM.
2. Mezcle la solución diluida de PPARγ-LBD (55 μL por pocillo) y la solución de sonda C1-BODIPY-C12 (55 μL por pocillo) en una placa negra de 96 pocillos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Mida la polarización de fluorescencia (FP) con el lector de microplacas.
4. Grafique los valores de FP frente a la concentración del receptor, ajuste la curva utilizando la unión específica con la ecuación de la pendiente de Hill utilizando software estadístico y gráfico, y calcule el valor de K_d .

4. Ensayo de unión competitivo

NOTA: En este ensayo, se utilizaron 800 nM de PPARγ-LBD humano y 50 nM de sonda C1-BODIPY-C12 para la unión al receptor. Se utilizaron rosiglitazona (Rosi), fosfato de trifenilo (TPHP) y ácido perfluorooctanosulfónico (PFOS) para competir con la unión de la sonda a PPARγ.

1. Diluir los tres compuestos en tampón Tris-HCl dentro de un rango de concentración de 0 a 200 μM.
2. Prepare la solución de unión receptor-sonda con una concentración final de 800 nM de PPARγ-LBD humano y 50 nM de sonda C1-BODIPY-C12.
3. Mezcle la solución de unión receptor-sonda (55 μL por pocillo) y la solución compuesta (55 μL por pocillo) en una placa negra de 96 pocillos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
4. Mida la polarización de fluorescencia (FP) con el lector de microplacas.
5. Represente los valores de FP en función de la concentración del ligando. Obtener la concentración inhibitoria semimáxima (IC₅₀) de cada ligando a partir de la curva de competencia utilizando el modelo sigmoidal procesado por un software de gráfica y análisis.

Resultados

Expresión proteica y purificación de PPARγ-LBD
PPARγ-LBD se expresó heterólogamente en BL21 (DE3) como una proteína marcada con histidina. La proteína se detectó en las fracciones solubles, y el PPARγ-LBD purificado mostró una sola banda en SDS-PAGE con un peso molecular aparente de aproximadamente 34,9 kDa (Figura 2), consistente con el peso molecular predicho de la proteína.

La unión de l...

Discusión

La polarización de fluorescencia (FP), la resonancia de plasmón de superficie (SPR) y la resonancia magnética nuclear (RMN) son técnicas comunes utilizadas para evaluar las interacciones de unión directa entre proteínas y compuestos^19,20. La PF ha sido ampliamente empleada en la investigación de interacciones moleculares para el descubrimiento de fármacos y el cribado químico 21,22,23.<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 Probe	Thermo Fisher Scientific, China	102209-82-3	Binds to PPARγ-LBD and emits fluorescence.
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, China	6104-59-2	Stain the protein bands.
GraphPad prism	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
imidazole	Solarbio, China	I8090	Prepare buffers for the protein purification process.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Solarbio, China	367-93-1	Induce the expression of PPARγ-LBD
Microplate reader	Biotek , USA	Synergy H1	Detecting FP value
NaCl	Shanghai Reagent	7647-15-5	Prepare buffers for the protein purification process.
NaH2PO4 · 2H2O	Shanghai Reagent	13472-35-0	Prepare buffers for the protein purification process.
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, China	SA005005	Protein purification.
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	J&K Scientific Ltd, China	1763-23-1	The detected environmental pollutants
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Solarbio, China	P0100	Inhibit protein degradation.
PPARγ-Competitor Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay Kit	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)	aladdin, China	122320-73-4	The agonists of PPARγ
Shaker	ZHICHENG, China	ZWY-211C	Bacterial culture expansion and induction of protein expression
Triphenyl phosphate (TPHP)	Macklin, China	T819317	The detected environmental pollutants
Tris	Solarbio, China	T8230	Prepare buffers for the protein purification process.
Tryptone	OXOID Limited, China	LP0042B	Prepare Lysogeny Broth (LB) medium.
Ultrasonic Cleaner	Kimberly, China	LHO-1	Disrupt the bacteria to achieve complete lysis
Urea	Solarbio, China	U8020	Prepare buffers for the protein purification process.
Yeast extract	OXOID Limited, China	LP0021B	Prepare Lysogeny Broth (LB) medium.