Un approccio di screening ad alto rendimento per la valutazione dell'affinità di legame degli inquinanti ambientali ai recettori nucleari

Riepilogo

Questo protocollo descrive un sistema di screening ad alto rendimento che utilizza la polarizzazione a fluorescenza di una specifica sonda fluorescente che si lega a un recettore nucleare come lettura per lo screening degli inquinanti ambientali.

Abstract

Nell'ambiente sono stati rilevati livelli crescenti di composti, che causano un inquinamento diffuso e mettono a rischio la salute umana. Tuttavia, nonostante la loro elevata presenza ambientale, le informazioni sui loro effetti tossicologici sono molto limitate. È urgente sviluppare metodi di screening ad alto rendimento (HTS) per guidare gli studi tossicologici. In questo studio, è stato sviluppato un saggio di legame recettore-ligando utilizzando un sistema HTS per determinare la potenza di legame degli inquinanti ambientali sui recettori nucleari. Il test viene condotto utilizzando un lettore di micropiastre (cioè una piastra a 96 pozzetti contenente varie sostanze chimiche) misurando la polarizzazione della fluorescenza (FP) di una specifica sonda fluorescente. Questo saggio si compone di quattro parti: la costruzione e la trasformazione di vettori ricombinanti, l'espressione e la purificazione della proteina recettore (dominio di legame del ligando), il legame recettore-sonda e il legame competitivo di sostanze chimiche con il recettore. Per illustrare la procedura di analisi è stata determinata la potenza di legame di due inquinanti ambientali, l'acido perfluoroottanosolfonico (PFOS) e il trifenil fosfato (TPHP), con il recettore gamma attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPARγ). Infine, sono stati discussi anche i vantaggi e gli svantaggi di questo metodo e le sue potenziali applicazioni.

Introduzione

Un gran numero di sostanze chimiche è stato ampiamente rilevato nell'ambiente e nel corpo umano, sollevando notevoli preoccupazioni circa il loro impatto sull'ambiente ecologico e sulla salute umana ^1,2,3. Nonostante la loro elevata presenza ambientale, le informazioni sui loro effetti tossicologici sono scarse. Pertanto, è urgente sviluppare metodi di screening ad alto rendimento (HTS) per facilitare la valutazione della tossicità chimica.

Sono stati segnalati diversi metodi di screening ad alto rendimento (HTS) per la valutazione della tossicità chimica, come i biosaggi HTS utilizzati nei programmi Tox21 e ToxCast ^4,5. Questi metodi possono identificare rapidamente potenziali sostanze tossiche e fornire informazioni preziose sui meccanismi della tossicità chimica. Tuttavia, questi biosaggi HTS si basano principalmente su sistemi basati su cellule, che possono essere complessi e costosi. Inoltre, per la valutazione della tossicità chimica sono stati utilizzati anche metodi di sequenziamento ad alto rendimento, ma il raggiungimento di una valutazione ad alto rendimento delle sostanze chimiche rimane impegnativo⁶. Studi precedenti hanno sviluppato saggi di legame competitivo recettore-ligando basati sulla polarizzazione della fluorescenza (FP) per determinare la potenza di legame di diversi inquinanti ambientali, tra cui sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS)^7,8,9, bisfenolo A (BPA)^10,11 e particolato (PM)¹², con recettori nucleari come il recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPAR)^7, 8,9,10,13, recettore X farnesoide (FXR)^11,12 e recettore tiroideo (TR)^14,15. Questo approccio è efficiente, conveniente e fornisce informazioni meccanicistiche.

In questo studio, il protocollo per il saggio di legame recettore-ligando è descritto sulla base del rilevamento della polarizzazione della fluorescenza (FP) di una piccola sonda fluorescente. Il principio del saggio di legame recettore-ligando basato su FP è illustrato nella Figura 1. Quando una piccola molecola fluorescente viene eccitata dalla luce polarizzata sul piano, la luce emessa diventa altamente depolarizzata a causa della rapida rotazione molecolare. Tuttavia, quando il tracciante si lega a un recettore più grande, la sua rotazione viene rallentata. Un valore FP elevato viene rilevato quando il tracciante è legato al recettore grande, mentre un valore FP basso si osserva quando il tracciante è libero. Il recettore gamma attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPARγ) è stato purificato per il legame della sonda al recettore. Il rosiglitazone (Rosi), l'acido perfluoroottanosolfonico (PFOS) e il trifenil fosfato (TPHP) sono stati utilizzati per competere per il legame della sonda con il recettore. Rosi, un agonista specifico di PPARγ, è stato utilizzato come controllo positivo nei saggi di legame competitivo del recettore. Inoltre, PFOS e TPHP sono stati precedentemente identificati come agonisti deboli di PPARγ in studi precedenti 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Inoltre, appartengono a diverse categorie strutturali di composti noti per l'esposizione ambientale e si distinguono per i loro tassi di rilevamento relativamente elevati nelle popolazioni umane. Questi composti sono stati utilizzati per convalidare ulteriormente l'ampia applicabilità del saggio di legame della competizione. La procedura consiste in quattro fasi: costruzione e trasformazione di vettori ricombinanti, espressione e purificazione della proteina recettore (dominio di legame del ligando), legame recettore-sonda e legame competitivo di sostanze chimiche con il recettore.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e dell'attrezzatura sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Costruzione e trasformazione di vettori ricombinanti

NOTA: PPARγ è un fattore di trascrizione ligando-dipendente con una struttura di recettori nucleari classica, comprendente un dominio di legame al DNA che regola i geni bersaglio e un dominio di legame al ligando attivato dai ligandi. Dopo l'attivazione del ligando, PPARγ forma un eterodimero con un altro recettore nucleare, il recettore X retinoide (RXR), e si lega agli elementi di risposta di PPARγ, regolando così la trascrizione dei geni bersaglio a valle ^9,16.

1. Progettare primer per il PPARγ-LBD (vedi Tabella 1) e amplificare il segmento di DNA PPARγ-LBD (vedi Tabella 2 e Tabella 3).
2. Linearizzare il vettore pET28a marcato con His×6 digerindolo con le endonucleasi di restrizione XhoI e BamHI¹⁸.
3. Clonare il segmento di DNA PPARγ-LBD nel vettore pET28a marcato con His×6 utilizzando il kit di clonazione disponibile in commercio, ottenendo il plasmide ricombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸.
4. Trasfettare il plasmide di espressione ricombinante pET28a-PPARγ-LBD-6×His in cellule BL21 (DE3) di Escherichia coli per l'espressione proteica¹⁸.
5. Aggiungere 5 μL del vettore ricombinante alle cellule BL21(DE3) competenti, incubare su ghiaccio per 30 minuti, eseguire uno shock termico a 42 °C per 45 s, quindi tornare immediatamente al ghiaccio.
6. Aggiungere 900 μl di LB di terreno, agitare a 37 °C per 1 ora (160-200 giri/min), quindi centrifugare a ~3000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Scartare il surnatante, risospendere il pellet batterico in 100 μl di terreno LB e stenderlo su un terreno solido. Capovolgere le piastre e la coltura a 37 °C per 12-16 ore.
8. Selezionare le singole colonie per il sequenziamento, l'identificazione e la successiva espressione e purificazione delle proteine.

2. Espressione e purificazione della proteina recettore

1. Incubare le cellule BL21 (DE3) trasformate in un terreno da 200 mL LB integrato con 100 μg/mL di ampicillina su un agitatore orbitale (230 giri/min) per 1-2 ore a 37 °C.
2. Indurre le cellule quando l'OD₆₀₀ raggiunge 0,4-0,6 unità di assorbanza aggiungendo 10 μM di isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare a 16 °C per 16 ore.
3. Raccogliere la sospensione batterica e centrifugare a 8000 × g, 4 °C, per 10 min.
4. Lisi le cellule in 20 mL di tampone di lisi solubile (50 mM di NaH₂PO₄, 300 mM di NaCl, 10 mM di imidazolo, pH 8,0), aggiungendo 200 μL di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) e 200 μL di lisozima. Risospendere il pellet batterico utilizzando una pipetta da 5 mL, quindi procedere con la sonicazione al 30% della potenza per 20 minuti.
5. Aggiungere un tampone di lisi pari a 5 volte il volume della colonna per equilibrare la colonna di nichel. Ripetere questo processo due volte e mettere da parte.
6. Centrifugare la sospensione batterica sonicata a 8000 × g per 15 minuti a 4 °C per ottenere il lisato surnatante batterico (CL).
7. Caricare il CL sulla colonna di nichel (per l'adsorbimento delle proteine) per ottenere il flusso continuo (FT).
8. Lavare la colonna con 5 volte il volume della colonna di tampone di lavaggio (50 mM di NaH₂PO₄, 300 mM di NaCl, 20 mM di imidazolo, pH 8,0) per ottenere l'eluato di lavaggio (W1-W6).
9. Lavare la colonna con 1 mL di tampone di eluizione (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8,0) per eluire la proteina bersaglio e ottenere le frazioni proteiche (E1-E5).
10. Prelevare un'aliquota di 20 μl di ciascuna frazione (CL, FT, W1-W6 ed E1-E5) e analizzare utilizzando SDS-PAGE¹⁸ con colorazione Coomassie Brilliant Blue. PPARγ-LBD funziona come una proteina da 34,9 kDa su un gel denaturante.

3. Saggio di legame del recettore

NOTA: In questo test, C1-BODIPY-C12 è stato utilizzato come sonda fluorescente sito-specifica per stabilire il sistema di legame recettore-ligando. C1-BODIPY-C12, un ligando specifico per PPARγ, è un analogo fluorescente dell'acido grasso con il gruppo fluorescente BODIPY incorporato nell'acido grasso in posizione C1.

1. Diluire il PPARγ-LBD umano purificato in tampone Tris-HCl (20 mM di Tris, 100 mM di NaCl, pH 8,0) a un intervallo di concentrazione compreso tra 1 nM e 6400 nM. Inoltre, diluire la sonda C1-BODIPY-C12 nel tampone Tris-HCl a una concentrazione di 50 nM.
2. Miscelare la soluzione diluita di PPARγ-LBD (55 μl per pozzetto) e la soluzione della sonda C1-BODIPY-C12 (55 μl per pozzetto) in una piastra nera a 96 pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
3. Misura la polarizzazione della fluorescenza (FP) con il lettore di micropiastre.
4. Tracciare i valori di FP rispetto alla concentrazione del recettore, adattare la curva utilizzando il legame specifico con l'equazione della pendenza di Hill utilizzando software statistici e grafici e calcolare il valore_{K d} .

4. Saggio di legame competitivo

NOTA: In questo test, sono stati utilizzati 800 nM di PPARγ-LBD umano e 50 nM di sonda C1-BODIPY-C12 per il legame del recettore. Il rosiglitazone (Rosi), il trifenil fosfato (TPHP) e l'acido perfluoroottanosulfonico (PFOS) sono stati utilizzati per competere con il legame della sonda al PPARγ.

1. Diluire i tre composti nel tampone Tris-HCl entro un intervallo di concentrazione compreso tra 0 e 200 μM.
2. Preparare la soluzione di legame recettore-sonda con una concentrazione finale di 800 nM di PPARγ-LBD umano e 50 nM di sonda C1-BODIPY-C12.
3. Miscelare la soluzione legante recettore-sonda (55 μl per pozzetto) e la soluzione composta (55 μl per pozzetto) in una piastra nera a 96 pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
4. Misura la polarizzazione della fluorescenza (FP) con il lettore di micropiastre.
5. Tracciare i valori di FP in funzione della concentrazione del ligando. Ottenere la concentrazione inibitoria semimassimale (IC₅₀) di ciascun ligando dalla curva di competizione utilizzando il modello sigmoidale elaborato da un software di grafica e analisi.

Risultati

Espressione proteica e purificazione di PPARγ-LBD
PPARγ-LBD era espresso in modo eterologo in BL21 (DE3) come proteina marcata con istidina. La proteina è stata rilevata nelle frazioni solubili e il PPARγ-LBD purificato ha mostrato una singola banda su SDS-PAGE con un peso molecolare apparente di circa 34,9 kDa (Figura 2), coerente con il peso molecolare previsto della proteina.

Il legame della sond...

Discussione

La polarizzazione a fluorescenza (FP), la risonanza plasmonica di superficie (SPR) e la risonanza magnetica nucleare (NMR) sono tecniche comuni utilizzate per valutare le interazioni di legame diretto tra proteine e composti^19,20. La FP è stata ampiamente impiegata nello studio delle interazioni molecolari per la scoperta di farmaci e lo screening chimico 21,22,23.^<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 Probe	Thermo Fisher Scientific, China	102209-82-3	Binds to PPARγ-LBD and emits fluorescence.
Coomassie Brilliant Blue R-250	Solarbio, China	6104-59-2	Stain the protein bands.
GraphPad prism	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
imidazole	Solarbio, China	I8090	Prepare buffers for the protein purification process.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Solarbio, China	367-93-1	Induce the expression of PPARγ-LBD
Microplate reader	Biotek , USA	Synergy H1	Detecting FP value
NaCl	Shanghai Reagent	7647-15-5	Prepare buffers for the protein purification process.
NaH2PO4 · 2H2O	Shanghai Reagent	13472-35-0	Prepare buffers for the protein purification process.
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, China	SA005005	Protein purification.
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS)	J&K Scientific Ltd, China	1763-23-1	The detected environmental pollutants
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Solarbio, China	P0100	Inhibit protein degradation.
PPARγ-Competitor Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay Kit	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)	aladdin, China	122320-73-4	The agonists of PPARγ
Shaker	ZHICHENG, China	ZWY-211C	Bacterial culture expansion and induction of protein expression
Triphenyl phosphate (TPHP)	Macklin, China	T819317	The detected environmental pollutants
Tris	Solarbio, China	T8230	Prepare buffers for the protein purification process.
Tryptone	OXOID Limited, China	LP0042B	Prepare Lysogeny Broth (LB) medium.
Ultrasonic Cleaner	Kimberly, China	LHO-1	Disrupt the bacteria to achieve complete lysis
Urea	Solarbio, China	U8020	Prepare buffers for the protein purification process.
Yeast extract	OXOID Limited, China	LP0021B	Prepare Lysogeny Broth (LB) medium.