通过膜片钳技术记录新鲜分离的基底动脉平滑肌细胞中的向内整流 K + 电流

摘要

该方案描述了一种从大鼠基底动脉中分离平滑肌细胞并使用全细胞膜片钳技术记录这些细胞中向内整流钾通道电流的快速有效方法。它为研究基底动脉和离子通道的研究人员提供了一种新的方法。

摘要

脑血管病是老年人中普遍存在的疾病，发病率稳步上升。基底动脉是供应脑桥、小脑、后脑区和内耳的重要大脑血管。钾 （K⁺） 通道活性通过调节细胞膜电位在决定血管张力中起重要作用。与其他 K⁺ 通道一样，向内整流 K⁺ （Kir） 通道的激活导致细胞膜超极化和血管舒张。在这项研究中，使用从基底动脉中新鲜分离的平滑肌细胞通过全细胞膜片钳技术记录 Kir 电流。研究了 100 μmol/L BaCl₂（一种 Kir 通道抑制剂）和 10 μmol/L 硝基血管扩张剂 10 μmol/L 硝普钠 （SNP） 对 Kir 通道电流的影响。结果表明，BaCl₂ 抑制基底动脉平滑肌细胞中的 Kir 通道电流，而 SNP 增强这些电流。该协议为制备新鲜分离的动脉平滑肌细胞和使用膜片钳技术记录 Kir 通道电流提供了全面的指南，为寻求掌握该方法的研究人员提供了宝贵的资源。

引言

脑血管疾病是老年人群的普遍疾病。随着生活水平的提高、预期寿命的延长和人口老龄化，脑血管病的发病率正在稳步上升¹。基底动脉是由双侧椎动脉融合形成的不成对血管，在颅骨内的脑桥下方延伸，分为两条大脑后动脉。它供应脑桥、小脑、大脑后部区域和内耳。基底动脉供血不足会导致阵发性眩晕，通常伴有恶心和呕吐。患者还可能会出现耳鸣、听力损失和其他相关问题等症状。这些症状通常与颈椎病、脑动脉粥样硬化和血压异常等疾病有关。脑血管疾病，尤其在中老年人中普遍存在，通常与这些潜在疾病有关 ^2,3,4。

阻力动脉在心血管功能和维持身体稳态方面起着至关重要的作用。作为血管阻力的主要部位，它们调节血压和心输出量，确保足够的血流来满足组织和器官的代谢和生理需求⁵。基底动脉被归类为阻力动脉，主要调节流向脑干⁶ 的血流。平滑肌细胞形成阻力动脉壁，通过调节稳态收缩或血管张力，是血管阻力的关键介质。这些细胞包含许多离子通道，包括 K⁺ 通道、Ca²⁺ 通道和 Cl^- 通道，这些通道对血管张力的调节至关重要 ^5,7。

K⁺ 通道在建立动脉平滑肌细胞的膜电位和调节收缩张力方面至关重要⁸。动脉平滑肌中有四种类型的 K⁺ 通道：电压依赖性 K⁺ （Kᴠ）、Ca²⁺ 依赖性 K⁺ （K_Ca）、ATP 依赖性 K⁺ （K_ATP） 和内向整流器 K⁺ （Kir） 通道 ^9,10,11。Kir 通道分为 7 个亚型，其中 Kir2.x 是经典的 Kir 通道。其中，Kir2.x 亚家族在脉管系统中最相关。Kir 电流在负电压下表现出向内整流，表明 K⁺ 净流入电池，而在正电压下，净 K⁺ 电流很少或没有⁵。在心血管系统中，Kir 通道对于稳定膜电位至关重要。它们的激活诱导细胞膜超极化和血管舒张 12,13,14。

已在各种动脉（包括冠状动脉、脑动脉、肾动脉和肠系膜动脉）中对新鲜分离的平滑肌细胞进行了膜片钳实验^15,16。虽然有些方法使用相同类型的胶原酶进行细胞分离，但确切的程序各不相同。很少有研究全面总结了分离血管平滑肌细胞的方法。因此，本研究的重点是从大鼠基底动脉中新鲜分离原代血管平滑肌细胞，并使用全细胞膜片钳技术记录这些细胞中的 Kir 通道电流，为相关领域的研究人员提供了详细而完整的方案。

研究方案

该动物规程经成都中医药大学实验动物福利伦理委员会批准（备案号2024035）。本研究使用雄性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠，体重 260-300 g，年龄 8-10 周龄。随意向动物提供水和食物 （SPF 实验动物饲料）。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 大鼠基底动脉夹层

1. 溶液制备
   1. 如 表 1 所述准备溶液。
2. 通过吸入 2% 异氟醚麻醉大鼠。通过捏住脚趾确认深度麻醉。如果需要，给予额外的麻醉剂。立即打开头骨，将大脑暴露在便携式手术台上。
3. 将大脑快速转移到含有 4 °C 下饱和 95% O₂ 和 5% CO₂ 的 PSS 的培养皿中。 确保溶液的 pH 值为 7.40。
4. 将大脑腹侧向上放置在培养皿中，并用针固定。在光学显微镜下，找到基底动脉并使用高压灭菌的镊子和剪刀小心地去除周围的组织（参见 图 1A）。
5. 将一根直径为 25 μm 的 2 cm 长的导线插入离体的基底动脉。用金属丝轻轻摩擦内壁，以有效去除血管内皮。
   注意：大鼠的基底动脉位于大脑底部的脑干基底沟内，由左右椎动脉汇合形成².在隔离过程中，请小心处理动脉，以避免过度拉伸或压缩，从而导致损伤。

2. 分离平滑肌细胞

1. 在试管 1、2 和 3 中分别将 1 mL 细胞分离溶液、1 mL 酶解物 I 和 1 mL 酶解物 II 预热至 37 °C（参见 图 1B）。
2. 将分离的基底动脉转移到试管 2 中。将 95% O₂ 和 5% CO₂ 的混合物连续注入管中，并保持酶处理 30 分钟（参见 图 1C）。
3. 将基底动脉从试管 2 转移到试管 3。继续将 95% O₂ 和 5% CO₂ 注入管中，并保持酶处理 5 分钟（参见 图 1D）。
4. 将 1 mL 的 37 °C 细胞分离溶液从试管 1 中加入试管 3 中。继续注射 95% O₂ 和 5% CO₂ ，同时保持酶处理 3 分钟。研磨基底动脉制剂以释放细胞（参见 图 1E）。
5. 向试管 3 中加入 4 °C 分离溶液以终止酶促过程（参见 图 1F）。将混合物以 59 × g 离心 6 分钟。用移液管弃去上清液，再次加入4°C分离溶液（参见 图1G），并重复离心两次以除去残留的酶。
6. 使用移液管去除上清液，并将 1 mL 细胞悬液在 4 °C 下储存长达 6-8 小时。
7. 取 100 μL 细胞悬液，将其放入浴中（参见 图 1H）。向浴中加入 1 mL 细胞外液，让细胞沉淀 40 分钟以附着在底部（见 图 2）。
   注：对于处理组中的细胞（例如，BaCl₂ 或硝普钠），在附着期间，在室温 （22-26°C） 下与相应物质预孵育 40 分钟。

3. 使用全细胞膜片钳记录 Kir 电流

1. 微量移液器的制造
   1. 打开微量移液器拉拔器（请参阅 材料表）。
   2. 将玻璃管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm，长度：10 cm）放入拉拔器中。选择 程序 1，单击 Enter，然后访问 程序 1。单击控制面板上的 Ramp 进行升温测试，以测量玻璃管的热值。
      注意：使用以下参数编辑程序 1：加热：斜坡，拉动：0，速度：25，延迟：1，压力：500，模式：延迟，启用安全加热。更换细丝或玻璃移液器类型时，必须进行 ramp 测试。微量移液器的吸头直径应为 ~1-2 μm，锥体长度约为 5 mm。较小的枪头直径和较长的吸头锥体会导致更高的移液器阻力。
   3. 插入新的玻璃管，然后选择 程序 1。单击 Enter 以制造微量移液器。
2. 记录 Kir 电流
   1. 按顺序打开硬件设备：数模转换器、信号放大器、显微作器、显微镜、相机和计算机。
   2. 按以下顺序启动软件：相机、信号放大器和数据采集软件。
      注：如果显微镜未配备摄像头，则只需激活仪器软件。确保在硬件初始化后打开软件以启用正确的功能。
   3. 在数据采集软件中，选择 File > Set Data File Names 以建立数据存储路径。
   4. 编辑记录 Kir 电流的协议，如下所示：
      1. 波形界面：纪元 A & D：类型 = 步长;第一电平 = −60 mV;Delta 电平 = 0 mV;第一个持续时间 = 100 毫秒;增量持续时间 = 0 毫秒。纪元 B：类型 = step;第一电平 = −160 mV;Delta 电平 = 0 mV;第一个持续时间 = 1 毫秒;增量持续时间 = 0 毫秒。纪元 C：类型 = 斜坡;第一电平 = 40 mV;Delta 电平 = 20 mV;第一个持续时间 = 500 毫秒;增量持续时间 = 0 毫秒。
      2. 模式/速率接口：试验延迟 = 0 s;跑动 = 1;扫描 = 1;扫描持续时间 = 0.8 秒。
      3. 输出接口：通道 #0;保持电平 = −60 mV。将协议保存并命名为 “Kir protocol”。
         注意：协议设置是针对特定的当前记录量身定制的，保存后可以重复使用。确保输出接口与仪器的接线匹配（例如，通道 #0）。
   5. 在数据采集软件的 Tools 菜单中启用 Membrane Test 功能。
   6. 将要测量的比色皿放置在显微镜相机视图的中心。
   7. 将参比丝尖端浸入浴液中。用细胞内溶液填充 20% 的微量移液器（在步骤 3.1 中制备），并将其固定在记录电极支架上。
      1. 使用注射器施加正压，将移液器吸头移入浴液中，并在信号放大器软件上调整移液器偏移量，将当前基线设置为 0 pA（参见 图 3A）。
         注意：使用 Ag/AgCl 参考线。移液器电阻应为 4-6 MΩ。
   8. 轻轻地将移液器压在细胞膜上。观察到密封电阻 （Rt） 增加到至少 1 MΩ（图 3B）。去除正压并施加负压以建立 Rt ≥ 1 GΩ 的高电阻（图 3C）。
      1. 将保持电压设置为 −60 mV 并使用 Cp Fast 和 Cp Slow 补偿电极电容（图 3D）。
         注意： 如果 Rt 保持在 1 GΩ 以上，请继续执行下一步;否则，更换细胞或移液器并重复步骤 3.2.6-3.2.8。
   9. 施加短暂的负压以破坏细胞膜，形成全细胞构型（图 3E）。在信号放大器软件中选择 Whole Cell ，单击 Auto 进行膜电容补偿（图 3F），加载 Kir 协议，然后开始数据记录。对处理过的细胞重复步骤 3.2.6-3.2.9。
      注意： 如果串联电阻 （Ra） 为 >30 MΩ，请选择新电池。如果 30 MΩ > Ra > 10 MΩ，请在录制前应用串联电阻补偿。该协议要求 Ra < 10 MΩ。
3. 分析数据
   1. 打开数据分析软件并加载记录的数据。使用光标分析电流轨迹并导出数据以进行 I-V 曲线绘图。
   2. 通过选择 Edit > Create Stimulus Waveform Signal 创建激励波形信号 并确认。
   3. 通过选择 Edit > Transfer Traces，指定完整的迹线区域和信号 （A0 #0），并复制数据以供进一步分析，导出 Kir 协议迹线。
   4. 通过选择 Edit > Transfer Traces，指定完整的迹线区域和信号 （IN 0），并复制数据以生成电流迹线图，导出具有代表性的 Kir 电流迹线。
      注：使用电流密度 （pA/pF） 对电流数据进行归一化，以便在不同大小的电池之间进行准确比较。确保在实验期间记录膜电容 （Cm）¹⁷。

结果

分离动脉平滑肌细胞
该程序的第一部分详细介绍了从大鼠的大脑基底动脉中分离平滑肌细胞的过程。 此过程如图 1 所示。该程序包括酶消化和细胞分离步骤，以从动脉中释放平滑肌细胞。

分离的平滑肌细胞的代表性图像
第二部分介绍了分离的平滑肌细胞的代表性图表。 图 2...

讨论

使用新鲜分离的细胞进行全细胞记录可以追溯到 1980 年代初期¹⁸，而记录啮齿动物基底平滑肌细胞的通道电流在 1990 年代得到广泛应用¹⁹。随着技术的进步，研究人员越来越关注通过这些技术获得的结果。然而，对更新和总结技术方法的关注已经逐渐减少。本文介绍了一种血管平滑肌细胞新鲜分离的详细方法，并随后使用这些细胞来记?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin	Sigma, USA	B2064
Barium chloride	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
Camera	Hamamatsu, Japan	C11440
Camera software	Image J, USA	Micro-manager 2.0.0-gammal
Collagenase F	Sigma, USA	C7926
Collagenase H	Sigma, USA	C8051
Computer	Lenovo, China	~
Data acquisition software	Molecular Devices, USA	Clampex 10.4
Data analysis software	Axon, USA	clampfit 10.4
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
Digital-analog converter	Molecular Devices, USA	Axon digidata 1550B
Dithiothreitol	Sigma, USA	D0632
Drawing software	San Diego, California, USA	GraphPad
EGTA	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A600077
Glass tube	DL Naturegene Life Sciences.USA	B150-86-10
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Micromanipulator	sutter, USA	MP285A
Micropipette puller	sutter, USA	P1000
Microscope	Olympus, Japan	IX73
Na2-ATP	Sigma, USA	A26209
Na2HPO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610404
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A600878
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
NaOH	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100173
Papain	Sigma, USA	P4762
Potassium-D-gluconate	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A507810
Signal amplifier	Molecular Devices, USA	Axon MutiClamp 700B
Signal amplifier software	Molecular Devices, USA	MultiClamp Commander software
Sodium nitroprusside	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A600867
Statistical analysis software	San Diego, California, USA	GraphPad