Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, sıçan baziler arterinden düz kas hücrelerini izole etmek ve tüm hücre yama kelepçesi tekniğini kullanarak bu hücrelerde içe doğru doğrultucu potasyum kanal akımlarını kaydetmek için hızlı ve etkili bir yöntemi tanımlar. Baziler arter ve iyon kanallarını inceleyen araştırmacılar için yeni bir yaklaşım sunar.

Özet

Serebrovasküler hastalık, yaşlılar arasında yaygın bir durumdur ve görülme sıklığı giderek artmaktadır. Baziler arter, pons, beyincik, arka beyin bölgeleri ve iç kulağı besleyen kritik bir beyin damarıdır. Potasyum (K+) kanal aktivitesi, hücre zarı potansiyelini düzenleyerek vasküler tonusun belirlenmesinde önemli bir rol oynar. İçe doğrultucu K+ (Kir) kanallarının aktivasyonu, diğer K+ kanalları gibi, hücre zarı hiperpolarizasyonuna ve vazodilatasyona yol açar. Bu çalışmada, baziler arterden yeni izole edilmiş düz kas hücreleri, tüm hücre yama klemp tekniği ile Kir akımlarını kaydetmek için kullanıldı. Bir Kir kanalı inhibitörüolan 100 μmol/L BaCl2 ve bir nitro vazodilatör olan 10 μmol/L sodyum nitroprussidin (SNP) Kir kanal akımları üzerindeki etkileri araştırıldı. Sonuçlar, BaCl2'nin baziler arter düz kas hücrelerinde Kir kanal akımlarını inhibe ettiğini, SNP'nin ise bu akımları arttırdığını gösterdi. Bu protokol, yeni izole edilmiş arteriyel düz kas hücrelerinin hazırlanması ve yama kelepçesi tekniğini kullanarak Kir kanal akımlarının kaydedilmesi için kapsamlı bir kılavuz sağlar ve bu yöntemde ustalaşmak isteyen araştırmacılar için değerli bir kaynak sunar.

Giriş

Serebrovasküler hastalık yaşlı popülasyonda sık görülen bir durumdur. Yaşam standartlarındaki iyileşmeler, artan yaşam beklentisi ve yaşlanan nüfusla birlikte, serebrovasküler hastalık insidansı giderek artmaktadır1. Bilateral vertebral arterlerin füzyonu ile oluşan eşleşmemiş bir damar olan baziler arter, kafatası içindeki ponsun altından geçer ve iki posterior serebral artere ayrılır. Pons, beyincik, beynin arka bölgeleri ve iç kulağı besler. Baziler artere yetersiz kan akışı, genellikle bulantı ve kusmanın eşlik ettiği epizodik vertigoya yol açabilir. Hastalar ayrıca kulak çınlaması, işitme kaybı ve diğer ilgili sorunlar gibi semptomlar yaşayabilir. Bu semptomlar sıklıkla servikal spondiloz, serebral ateroskleroz ve anormal kan basıncı gibi durumlarla ilişkilidir. Özellikle orta yaşlı ve yaşlı bireyler arasında yaygın olan serebrovasküler hastalık, genellikle bu altta yatan koşullarla bağlantılıdır 2,3,4.

Direnç arterleri, kardiyovasküler fonksiyonda ve vücut homeostazının korunmasında hayati bir rol oynar. Vasküler direncin birincil bölgesi olarak, doku ve organların metabolik ve fizyolojik taleplerini karşılamak için yeterli kan akışını sağlayarak kan basıncını ve kalp debisini düzenlerler5. Dirençli arter olarak sınıflandırılan baziler arter, öncelikle beyin sapına giden kan akışını düzenler6. Direnç arterlerinin duvarlarını oluşturan düz kas hücreleri, kararlı durum kasılmasının veya vasküler gerginliğin düzenlenmesi yoluyla vasküler direncin anahtar aracılarıdır. Bu hücreler, vasküler tonusun 5,7 modülasyonu için kritik olan K+ kanalları, Ca2+ kanalları ve Cl- kanalları dahil olmak üzere çok sayıda iyon kanalını barındırır.

K+ kanalları, membran potansiyelinin oluşturulmasında ve arteriyel düz kas hücrelerinin kasılma tonusunun düzenlenmesindekritik öneme sahiptir 8. Arteriyel düz kasta dört tip K+ kanalı vardır: voltaja bağımlı K+ (Kᴠ), Ca2+'ya bağımlı K+ (KCa), ATP'ye bağımlı K+ (KATP) ve içe doğrultucu K+ (Kir) kanalları 9,10,11. Kir kanalları, Kir2.x klasik Kir kanalları olmak üzere yedi alt türe ayrılır. Bunlar arasında, Kir2.x alt aileleri vaskülatürde en alakalı olanlardır. Kir akımları, negatif voltajlarda içe doğru düzeltme sergiler, bu da hücreye net bir K+ akışını gösterirken, pozitif voltajlarda net K+ akım akışı çok azdır veya hiç yoktur5. Kardiyovasküler sistemde, zar potansiyelini stabilize etmek için Kir kanalları gereklidir. Aktivasyonları hücre zarı hiperpolarizasyonunu ve vazodilatasyonunu indükler 12,13,14.

Koroner, serebral, renal ve mezenterik arterler dahil olmak üzere çeşitli arterlerde yeni izole edilmiş düz kas hücreleri üzerinde yama-klemp deneyleri yapılmıştır15,16. Bazı yöntemler hücre izolasyonu için aynı tip kollajenaz kullanırken, kesin prosedürler değişiklik gösterir. Çok az sayıda çalışma, vasküler düz kas hücrelerini izole etme yöntemlerini kapsamlı bir şekilde özetlemiştir. Bu nedenle, bu çalışma, sıçan baziler arterinden primer vasküler düz kas hücrelerinin taze izolasyonuna ve bu hücrelerdeki Kir kanal akımlarının tüm hücre yama klemp tekniği kullanılarak kaydedilmesine odaklanarak, ilgili alanlardaki araştırmacılar için ayrıntılı ve eksiksiz bir protokol sunmaktadır.

Protokol

Hayvan protokolü, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Laboratuvarı Hayvan Refahı Etik Komitesi tarafından onaylandı (Kayıt No. 2024035). Bu çalışmada 260-300 g ağırlığında ve 8-10 haftalık erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanları kullanıldı. Hayvanlara su ve yiyecek (SPF deneysel hayvan yemi) ad libitum sağlandı. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Sıçan baziler arter diseksiyonu

  1. Çözelti Hazırlama
    1. Çözeltileri Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
  2. % 2 izofluran soluyarak sıçanı uyuşturun. Bir ayak parmağı tutamını kullanarak derin anesteziyi onaylayın. Gerekirse, ek anestezikler uygulayın. Hemen kafatasını açmaya devam edin ve beyni portatif ameliyat masasına maruz bırakın.
  3. Beyni, 4 ° C'de% 95O2 ve% 5 CO2 ile doyurulmuş PSS içeren bir Petri kabına hızla aktarın. Çözeltinin pH'ının 7.40 olduğundan emin olun.
  4. Beyni bir Petri kabında ventral olarak yukarı doğru konumlandırın ve iğnelerle sabitleyin. Işık mikroskobu altında, baziler arteri bulun ve otoklavlanmış cımbız ve makas kullanarak çevredeki dokuyu dikkatlice çıkarın (bkz. Şekil 1A).
  5. İzole edilmiş baziler artere 25 μm çapında 2 cm uzunluğunda bir tel yerleştirin. Vasküler endotelyumu etkili bir şekilde çıkarmak için iç duvarı tel ile hafifçe ovalayın.
    NOT: Sıçanlarda baziler arter, beynin tabanındaki beyin sapının bazal sulkusları içinde bulunur ve sol ve sağ vertebral arterlerin2 birleşmesiyle oluşur. İzolasyon işlemi sırasında, hasara neden olabilecek aşırı gerilme veya sıkışmayı önlemek için arteri dikkatli bir şekilde kullanın.

2. Düz kas hücrelerinin izolasyonu

  1. 1 mL hücre ayırma çözeltisini, 1 mL enzimatik hidrolizat I'i ve 1 mL enzimatik hidrolizat II'yi sırasıyla 1, 2 ve 3 test tüplerinde 37 °C'ye önceden ısıtın (bkz. Şekil 1B).
  2. İzole edilmiş baziler arteri test tüpü 2'ye aktarın. Tüpe sürekli olarak %95O2 ve %5 CO2 karışımı enjekte edin ve enzimatik işlemi 30 dakika sürdürün (bkz. Şekil 1C).
  3. Baziler arteri test tüpü 2'den test tüpü 3'e aktarın. Tüpe% 95 O2 ve% 5 CO2 enjekte etmeye devam edin ve enzimatik tedaviyi 5 dakika boyunca sürdürün (bkz. Şekil 1D).
  4. Test tüpü 1'den test tüpü 3'e 1 mL 37 °C hücre ayırma solüsyonu ekleyin. Enzimatik tedaviyi 3 dakika sürdürürken %95O2 ve %5 CO2 enjekte etmeye devam edin. Hücreleri serbest bırakmak için baziler arter preparatını tritüre edin (bkz. Şekil 1E).
  5. Enzimatik işlemi sonlandırmak için test tüpü 3'e 4 °C ayırma çözeltisi ekleyin (bkz. Şekil 1F). Karışımı 59 × g'da 6 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın, tekrar 4 °C ayırma çözeltisi ekleyin (bkz. Şekil 1G) ve artık enzimleri çıkarmak için santrifüjlemeyi iki kez tekrarlayın.
  6. Süpernatanı bir pipet kullanarak çıkarın ve 1 mL hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 6-8 saate kadar saklayın.
  7. Hücre süspansiyonunun 100 μL'sini alın ve banyoya yerleştirin (bkz. Şekil 1H). Banyoya 1 mL hücre dışı sıvı ekleyin ve hücrelerin dibe yapışması için 40 dakika oturmasına izin verin (bkz. Şekil 2).
    NOT: Tedavi grubundaki hücreler için (ör., BaCl2 veya sodyum nitroprussid), bağlanma süresi boyunca 40 dakika boyunca oda sıcaklığında (22-26 ° C) ilgili maddelerle önceden inkübe edin.

3. Tüm hücre yama kelepçesi kullanarak Kir akımını kaydetme

  1. Mikropipet üretimi
    1. Mikropipet çekiciyi açın ( Malzeme Tablosuna bakın).
    2. Çektirmeye bir cam tüp (dış çap: 1,5 mm, iç çap: 1,10 mm, uzunluk: 10 cm) yerleştirin. Program 1'i seçin, Enter'a tıklayın ve Program 1'e erişin. Cam tüpün ısı değerini ölçmek için kontrol panelindeki Rampa'ya tıklayarak bir ramp testi gerçekleştirin.
      NOT: Program 1'i aşağıdaki parametrelerle düzenleyin: Isı: Ramp, Çekme: 0, Hız: 25, Gecikme: 1, Basınç: 500, Mod: Gecikme, Güvenli ısı etkin. Filamentler veya cam pipet türleri değiştirilirken rampa testi yapılmalıdır. Mikropipetlerin uç çapı ~1-2 μm ve koni uzunluğu yaklaşık 5 mm olmalıdır. Daha küçük uç çapları ve daha uzun koniler, daha yüksek pipet direnci sağlar.
    3. Yeni bir cam tüp yerleştirin ve Program 1'i seçin. Mikropipeti imal etmek için Enter'a tıklayın.
  2. Kir Akımını Kaydetme
    1. Donanım aygıtlarını sırayla açın: dijitalden analoğa dönüştürücü, sinyal amplifikatörü, mikromanipülatör, mikroskop, kamera ve bilgisayar.
    2. Yazılımı şu sırayla başlatın: kamera, sinyal yükseltici ve veri toplama yazılımı.
      NOT: Bir mikroskop bir kamera ile donatılmamışsa, yalnızca cihaz yazılımının etkinleştirilmesi gerekir. Uygun işlevselliği sağlamak için donanım başlatıldıktan sonra yazılımın açıldığından emin olun.
    3. Veri toplama yazılımında, bir veri depolama yolu oluşturmak için Dosya > Veri Dosyası Adlarını Ayarla'yı seçin.
    4. Kir akımlarını kaydetme protokolünü aşağıdaki gibi düzenleyin:
      1. Dalga formu arayüzü: Epoch A & D: Tip = adım; Birinci seviye = −60 mV; Delta seviyesi = 0 mV; İlk süre = 100 ms; Delta süresi = 0 ms. Dönem B: Tür = adım; Birinci seviye = −160 mV; Delta seviyesi = 0 mV; İlk süre = 1 ms; Delta süresi = 0 ms. Epoch C: Tip = rampa; Birinci seviye = 40 mV; Delta seviyesi = 20 mV; İlk süre = 500 ms; Delta süresi = 0 ms.
      2. Mod/Hız arayüzü: Deneme gecikmesi = 0 sn; Koşu = 1; Süpürme = 1; Süpürme süresi = 0,8 sn.
      3. Çıkış arayüzü: Kanal # 0; Tutma seviyesi = −60 mV. Protokolü kaydedin ve "Kir protokolü" olarak adlandırın.
        NOT: Protokol kurulumu, belirli mevcut kayıtlar için uyarlanmıştır ve kaydedildikten sonra yeniden kullanılabilir. Çıkış arayüzünün cihazın kablolarıyla eşleştiğinden emin olun (örn. Kanal #0).
    5. Veri toplama yazılımının Araçlar menüsünde Membran Testi işlevini etkinleştirin.
    6. Hücreyi ölçüm için mikroskobun kamera görüntüsünün ortasına yerleştirin.
    7. Referans tel ucunu banyo solüsyonuna daldırın. Mikropipetin %20'sini (adım 3.1'de üretilmiştir) hücre içi solüsyonla doldurun ve kayıt elektrot tutucusuna sabitleyin.
      1. Bir şırınga kullanarak pozitif basınç uygulayın, pipet ucunu banyo solüsyonuna getirin ve mevcut taban çizgisini 0 pA'ya ayarlamak için sinyal amplifikatör yazılımındaki pipet ofsetini ayarlayın (bkz. Şekil 3A).
        NOT: Ag/AgCl referans kablolarını kullanın. Pipet direnci 4-6 MΩ olmalıdır.
    8. Pipeti hücre zarına hafifçe bastırın. Sızdırmazlık direncinde (Rt) en az 1 MΩ'a kadar bir artış gözlemleyin (Şekil 3B). Rt ≥ 1 GΩ ile yüksek bir direnç oluşturmak için pozitif basıncı kaldırın ve negatif basınç uygulayın (Şekil 3C).
      1. Tutma voltajını -60 mV'a ayarlayın ve Cp Hızlı ve Cp Yavaş kullanarak elektrot kapasitansını telafi edin (Şekil 3D).
        NOT: Rt 1 GΩ'un üzerinde kalırsa, bir sonraki adıma geçin; Aksi takdirde, hücreyi veya pipeti değiştirin ve 3.2.6-3.2.8 adımlarını tekrarlayın.
    9. Hücre zarını yırtmak için kısa bir negatif basınç uygulayın ve tam hücre konfigürasyonu oluşturun (Şekil 3E). Sinyal amplifikatör yazılımında Tüm Hücre'yi seçin, membran kapasitans kompanzasyonu için Otomatik'e tıklayın (Şekil 3F), Kir protokolünü yükleyin ve veri kaydına başlayın. İşlem gören hücreler için 3.2.6-3.2.9 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Seri direnç (Ra) >30 MΩ ise, yeni bir hücre seçin. 30 MΩ > Ra > 10 MΩ ise, kayıttan önce seri direnç telafisi uygulayın. Bu protokol Ra < 10 MΩ gerektirir.
  3. Verileri analiz etme
    1. Veri analizi yazılımını açın ve kaydedilen verileri yükleyin. Mevcut izleri analiz etmek ve I-V eğrisi çizimi için verileri dışa aktarmak için imleçleri kullanın.
    2. Düzenle > Uyaran Dalga Biçimi Sinyali Oluştur'u seçerek bir uyaran dalga biçimi sinyali oluşturun ve onaylayın.
    3. Edit > Transfer Traces'i seçerek, tam izleme bölgesini ve sinyalini belirterek (A0 #0) ve daha fazla analiz için verileri kopyalayarak Kir protokol izini dışa aktarın.
    4. Edit > Transfer Traces'i seçerek, tam iz bölgesini ve sinyali (IN 0) belirterek ve mevcut iz grafikleri oluşturmak için verileri kopyalayarak temsili Kir akım izlerini dışa aktarın.
      NOT: Farklı boyutlardaki hücreler arasında doğru karşılaştırma yapmak için akım yoğunluğunu (pA/pF) kullanarak mevcut verileri normalleştirin. Deney sırasında membran kapasitansının (Cm) kaydedildiğinden emin olun17.

Sonuçlar

Arteriyel düz kas hücrelerinin izolasyonu
Prosedürün ilk bölümü, sıçanın serebral baziler arterinden düz kas hücrelerini izole etme sürecini detaylandırır. Bu işlem Şekil 1'de gösterilmiştir. Prosedür, düz kas hücrelerini arterden serbest bırakmak için enzimatik sindirim ve hücre ayırma adımlarını içerir.

İzole edilmiş düz kas hücrelerinin temsili görüntüleri

Tartışmalar

Yeni izole edilmiş hücreler kullanılarak tüm hücre kaydı 1980'lerin başlarına kadar uzanır18 ve kemirgen baziler düz kas hücrelerinden kanal akımlarının kaydedilmesi 1990'larda yaygın olarak uygulanmaya başlandı19. Teknolojik gelişmelerle birlikte, araştırmacılar bu teknolojiler aracılığıyla elde edilen sonuçlara giderek daha fazla odaklanmaktadır. Bununla birlikte, teknik yöntemlerin güncellenmesine ve özetlen...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nin "Xinglin Akademisyenleri ve Disiplin Yetenekleri Araştırma Teşvik Planı" (33002324) için Özel Yetenek Programı ve Luliang Şehrinde Üst Düzey Bilimsel ve Teknolojik Yeteneklerin Tanıtılması için Temel Araştırma ve Geliştirme Projesi (2022RC28) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine serum albuminSigma, USAB2064
Barium chlorideMacklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA501330
CameraHamamatsu, JapanC11440
Camera softwareImage J, USAMicro-manager 2.0.0-gammal
Collagenase FSigma, USAC7926
Collagenase HSigma, USAC8051
ComputerLenovo, China~
Data acquisition softwareMolecular Devices, USAClampex 10.4
Data analysis softwareAxon, USAclampfit 10.4
D-glucoseSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610219
Digital-analog converterMolecular Devices, USAAxon digidata 1550B
DithiothreitolSigma, USAD0632
Drawing softwareSan Diego, California, USAGraphPad 
EGTASangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600077
Glass tubeDL Naturegene Life Sciences.USAB150-86-10
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100781
MgCl2·6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100288
Micromanipulatorsutter, USAMP285A
Micropipette pullersutter, USAP1000
MicroscopeOlympus, JapanIX73
Na2-ATPSigma, USAA26209
Na2HPO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610404
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100241
NaH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600878
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100865
NaOHSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100173
PapainSigma, USAP4762
Potassium-D-gluconateSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA507810
Signal amplifierMolecular Devices, USAAxon MutiClamp 700B
Signal amplifier softwareMolecular Devices, USAMultiClamp Commander software
Sodium nitroprussideSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600867
Statistical analysis softwareSan Diego, California, USAGraphPad 

Referanslar

  1. Goins, R. T., et al. Lower body functioning and correlates among older american indians: The cerebrovascular disease and its consequences in american indians study. BMC Geriatrics. 18 (1), 1-9 (2018).
  2. Mattle, H. P., Arnold, M., Lindsberg, P. J., Schonewille, W. J., Schroth, G. Basilar artery occlusion. Lancet Neurol. 10 (11), 1002-1014 (2011).
  3. Morales, A., Parry, P. V., Jadhav, A., Jovin, T. A novel route of revascularization in basilar artery occlusion and review of the literature. BMJ Case Reports. , 1-6 (2015).
  4. Ghantous, C. M., Azrak, Z., Rahman, F. A., Itani, H. A., Zeidan, A. Assessment of basilar artery reactivity in stroke and subarachnoid hemorrhage using wire myograph. Methods Mol Biol. 34, 625-643 (2016).
  5. Tykocki, N. R., Boerman, E. M., Jackson, W. F. Smooth muscle ion channels and regulation of vascular tone in resistance arteries and arterioles. Compr Physiol. 7 (2), 485-581 (2017).
  6. Wu, B. -. N., et al. Hyposmotic challenge inhibits inward rectifying K+ channels in cerebral arterial smooth muscle cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (2), H1085-H1094 (2007).
  7. Jackson, W. F. Ion channels and vascular. Hypertension. 35 (2), 173-178 (2000).
  8. Jackson, W. F. Potassium channels in the peripheral microcirculation. Microcirculation. 12 (1), 113-127 (2005).
  9. Dogan, M. F., Yildiz, O., Arslan, S. O., Ulusoy, K. G. Potassium channels in vascular smooth muscle: A pathophysiological and pharmacological perspective. Fundam Clin Pharmacol. 33 (5), 504-523 (2019).
  10. Daghbouche-Rubio, N., López-López, J. R., Pérez-García, M. T., Cidad, P. Vascular smooth muscle ion channels in essential hypertension. Front Physiol. 13, 1-9 (2022).
  11. Sahranavard, T., et al. The role of potassium in atherosclerosis. Eur J Clin Invest. 51 (3), 1-19 (2020).
  12. Crecelius, A. R., Dinenno, F. A. Vascular regulation via kir channels and Na+/K+-ATPase. Channels. 9 (4), 171-172 (2015).
  13. Liu, Y., et al. Prostanoids contribute to regulation of inwardly rectifying K+ channels in intrarenal arterial smooth muscle cells. Life Sci. 250, 1-9 (2020).
  14. Li, W., et al. Luteolin-induced coronary arterial relaxation involves activation of the myocyte voltage-gated K+ channels and inward rectifier K+ channels. Life Sci. 221, 233-240 (2019).
  15. Guo, P., et al. Coronary hypercontractility to acidosis owes to the greater activity of tmem16a/ano1 in the arterial smooth muscle cells. Biomed Pharmacother. 139, 1-14 (2021).
  16. Jing, Y., et al. Apigenin relaxes rat intrarenal arteries, depresses Ca2+-activated Cl− currents and augments voltage-dependent K+ currents of the arterial smooth muscle cells. Biomed Pharmacother. 115, 1-9 (2019).
  17. Manz, K. M., Siemann, J. K., Mcmahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 1-30 (2021).
  18. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  19. Langton, P. D., Standen, N. B. Calcium currents elicited by voltage steps and steady voltages in myocytes isolated from the rat basilar artery. J Physiol. 469, 535-548 (1993).
  20. Kittiwoot, T. -. O., et al. Isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses. J Vis Exp. (184), e63686 (2022).
  21. Trask, A. J., Lucchesi, P. A., Mccallinhart, P. E., Zhang, X., Husarek, K. E. Isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells. J Vis Exp. 111, e53983 (2016).
  22. Ribeiro, M. P., Relvas, R., Chiquita, S., Correia, I. J. Isolation of human umbilical arterial smooth muscle cells (HUASMC). J Vis Exp. (41), e1940 (2010).
  23. Kim, H. J., et al. Increased inward rectifier K+ current of coronary artery smooth muscle cells in spontaneously hypertensive rats; partial compensation of the attenuated endothelium-dependent relaxation via Ca2+-activated K+ channels. Clin Exp Pharmacol Physiol. 47 (1), 38-48 (2019).
  24. Qiao, Y., et al. Kir2.1 regulates rat smooth muscle cell proliferation, migration, and post-injury carotid neointimal formation. Biochem Biophys Res Commun. 477 (4), 774-780 (2016).
  25. Tykocki, N. R., Bonev, A. D., Longden, T. A., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Inhibition of vascular smooth muscle inward-rectifier K+channels restores myogenic tone in mouse urinary bladder arterioles. Am J Physiol Renal Physiol. 312 (5), F836-F847 (2017).
  26. Ko, E. A., Han, J., Jung, I. D., Park, W. S. Physiological roles of K+ channels in vascular smooth muscle cells. Smooth Muscle Res. 44 (2), 65-81 (2008).
  27. Standen, N. B., Quayle, J. M. K+ channel modulation in arterial smooth muscle. Acta Physiol Scand. 164, 549-557 (1998).
  28. Smith, P. D., et al. Kir channels function as electrical amplifiers in rat vascular smooth muscle. J Physiol. 586 (4), 1147-1160 (2008).
  29. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 1-12 (2021).
  30. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for qt interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  31. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
  32. Park, W. S., Han, J., Earm, Y. E. Physiological role of inward rectifier K+ channels in vascular smooth muscle cells. Pflugers Arch. 457 (1), 137-147 (2008).
  33. Thomas, C., Svehla, L., Moffett, B. S. Sodium nitroprusside induced cyanide toxicity in pediatric patients. Expert Opin Drug Saf. 8 (5), 599-602 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

e Do ru Do rultucu K Ak mlarBaziler ArterD z Kas H creleriYama Klemp Tekni iSerebrovask ler Hastal kVask ler TonusPotasyum KanallarH cre Zar PotansiyeliHiperpolarizasyonVazodilatasyonBaCl2Kir Kanal nhibit rSodyum Nitroprussid SNPKir Kanal Ak mlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır