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요약

이 프로토콜은 쥐 기저 동맥에서 평활근 세포를 분리하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 이러한 세포의 내부 정류 칼륨 채널 전류를 기록하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 연구는 기저동맥과 이온 채널을 연구하는 연구자들에게 새로운 접근법을 제공합니다.

초록

뇌혈관 질환은 노인들 사이에서 널리 퍼져 있는 질환으로, 발병률이 꾸준히 증가하고 있습니다. 기저동맥(basilar artery)은 교두, 소뇌, 후방 뇌 영역, 내이에 공급하는 중요한 대뇌 혈관입니다. 칼륨(K+) 채널 활성은 세포막 전위를 조절하여 혈관 긴장도를 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 다른 K+ 채널과 마찬가지로 내부 정류 K+(Kir) 채널의 활성화는 세포막 과분극 및 혈관 확장을 유발합니다. 이 연구에서는 기저 동맥에서 새로 분리된 평활근 세포를 사용하여 전체 세포 패치 클램프 기술을 통해 Kir 전류를 기록했습니다. Kir 채널 억제제인 100μmol/L BaCl2와 니트로 혈관 확장제인 10μmol/L 니트로프루시드나트륨(SNP)이 Kir 채널 전류에 미치는 영향을 조사했습니다. 그 결과, BaCl2는 기저동맥 평활근 세포에서 Kir 채널 전류를 억제하는 반면, SNP는 이러한 전류를 강화한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 패치 클램프 기술을 사용하여 새로 분리된 동맥 평활근 세포를 준비하고 Kir 채널 전류를 기록하기 위한 포괄적인 가이드를 제공하며, 이 방법을 마스터하려는 연구자에게 귀중한 리소스를 제공합니다.

서문

뇌혈관 질환은 노인 인구에서 널리 퍼져 있는 질환입니다. 생활 수준의 향상, 기대 수명 증가, 인구 고령화로 인해 뇌혈관 질환의 발병률은 꾸준히 증가하고 있다1. 기저동맥(basilar artery)은 양측 척추 동맥의 융합에 의해 형성된 짝을 이루지 않은 혈관으로, 두개골 내의 교구 아래를 달리며 두 개의 후방 대뇌 동맥으로 나뉩니다. 뇌는 교두, 소뇌, 뇌의 후방 영역, 내이에 공급합니다. 기저동맥에 혈액 공급이 충분하지 않으면 종종 메스꺼움과 구토를 동반하는 간헐적 현기증이 발생할 수 있습니다. 환자는 또한 이명, 청력 상실 및 기타 관련 문제와 같은 증상을 경험할 수 있습니다. 이러한 증상은 종종 경추증, 뇌 죽상 경화증 및 비정상적인 혈압과 같은 상태와 관련이 있습니다. 특히 중년층과 노년층에서 흔히 발생하는 뇌혈관 질환은 이러한 기저 질환과 관련이 있는 경우가 많다 2,3,4.

저항 동맥은 심혈관 기능과 신체 항상성 유지에 중요한 역할을 합니다. 혈관 저항의 주요 부위로서 혈압과 심박출량을 조절하여 조직과 장기의 대사 및 생리학적 요구를 충족시킬 수 있는 충분한 혈류를 보장합니다5. 저항 동맥으로 분류되는 기저 동맥은 주로 뇌간으로 가는 혈류를 조절합니다6. 저항 동맥의 벽을 형성하는 평활근 세포는 정상 상태 수축 또는 혈관 긴장의 조절을 통해 혈관 저항의 핵심 매개체입니다. 이 세포는 K+ 채널, Ca2+ 채널 및 Cl- 채널을 포함한 수많은 이온 채널을 보유하고 있으며, 이는 혈관 톤 5,7의 조절에 중요합니다.

K+ 채널은 막 전위를 확립하고 동맥 평활근 세포의 수축 긴장도를 조절하는 데 중요합니다8. 동맥 평활근에는 전압 의존성 K+(Kᴠ), Ca2+ 의존성 K+(KCa), ATP 의존성 K+(KATP) 및 내향 정류기 K+(Kir) 채널 9,10,11의 네 가지 유형이 있습니다. Kir 채널은 7가지 하위 유형으로 분류되며 Kir2.x는 클래식 Kir 채널입니다. 이 중 Kir2.x subfamily는 혈관 구조와 가장 관련이 있습니다. Kir 전류는 음의 전압에서 내부 정류를 나타내며 K+가 셀로의 순 유입을 나타내는 반면, 양의 전압에서는 순 K+ 전류 흐름이 최소화되거나 전혀 없음을 나타냅니다5. 심혈관계에서 Kir 채널은 막 전위를 안정화하는 데 필수적입니다. 이들의 활성화는 세포막 과분극(hyperpolarization)과 혈관 확장(vasodilation)을 유도한다 12,13,14.

갓 분리된 평활근 세포에 대한 패치 클램프 실험은 관상동맥, 대뇌동맥, 신장동맥 및 장간막 동맥을 포함한 다양한 동맥에서 수행되었습니다 15,16. 일부 방법은 세포 분리를 위해 동일한 유형의 콜라겐 분해 효소를 사용하지만 정확한 절차는 다양합니다. 혈관 평활근 세포를 분리하는 방법을 종합적으로 요약한 연구는 거의 없습니다. 따라서 본 연구는 쥐 기저동맥에서 원발혈관 평활근 세포를 새롭게 분리하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 이러한 세포의 Kir 채널 전류를 기록하는 데 중점을 두어 관련 분야의 연구자에게 상세하고 완전한 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

동물 프로토콜은 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Laboratory Animal Welfare Ethics Committee(기록 번호 2024035)의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 체중이 260-300g이고 생후 8-10주인 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐가 사용되었습니다. 동물들은 물과 음식(SPF 실험용 동물 사료)을 자유자재로 제공받았다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 쥐 기저 동맥 박리

  1. 솔루션 준비
    1. 표 1에 설명된 대로 솔루션을 준비합니다.
  2. 2% 이소플루란을 흡입하여 쥐를 마취합니다. 발가락 꼬집음을 사용하여 깊은 마취를 확인합니다. 필요한 경우 추가 마취제를 투여합니다. 즉시 두개골을 열고 휴대용 수술대에 뇌를 노출시킵니다.
  3. 4 °C에서 95% O2 및 5% CO2 로 포화된 PSS가 포함된 페트리 접시로 뇌를 빠르게 옮깁니다. 용액의 pH가 7.40인지 확인하십시오.
  4. 페트리 접시에 뇌를 복부 위쪽으로 놓고 바늘로 고정합니다. 광학 현미경으로 기저 동맥을 찾고 고압증기멸균 핀셋과 가위를 사용하여 주변 조직을 조심스럽게 제거합니다( 그림 1A 참조).
  5. 직경 25μm의 2cm 길이의 와이어를 분리된 기저 동맥에 삽입합니다. 와이어로 내벽을 부드럽게 문지르면 혈관 내피를 효과적으로 제거할 수 있습니다.
    참고: 쥐의 기저동맥(bassilar artery)은 뇌 기저부에 있는 뇌간의 기저부(basal sulci) 내에 위치하며 좌우 척추 동맥(left and right vertebral arteries)의 합류점에 의해 형성된다2. 격리 과정에서 동맥을 조심스럽게 다루어 손상을 초래할 수 있는 과도한 스트레칭이나 압박을 피하십시오.

2. 평활근 세포의 격리

  1. 시험관 1, 2, 3에서 세포 분리 용액 1mL, 효소 가수분해물 I 1mL, 효소 가수분해물 II 1mL를 각각 37°C로 예열합니다( 그림 1B 참조).
  2. 분리된 기저동맥을 시험관 2로 옮깁니다. 95% O2 및 5% CO2 의 혼합물을 튜브에 지속적으로 주입하고 30분 동안 효소 처리를 유지합니다( 그림 1C 참조).
  3. 기저동맥을 시험관 2에서 시험관 3으로 옮깁니다. 튜브에 95% O2 및 5% CO2 를 계속 주입하고 5분 동안 효소 처리를 유지합니다( 그림 1D 참조).
  4. 시험관 1의 37°C 세포 분리 용액 1mL를 시험관 3에 추가합니다. 3분 동안 효소 처리를 유지하면서 95% O2 및 5% CO2 를 계속 주입합니다. 기저동맥 제제를 분쇄하여 세포를 방출합니다( 그림 1E 참조).
  5. 시험관 3에 4°C 분리 용액을 첨가하여 효소 과정을 종료합니다( 그림 1F 참조). 혼합물을 59 × g 에서 6분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 4°C 분리 용액을 다시 첨가한 다음( 그림 1G 참조) 원심분리를 두 번 반복하여 잔류 효소를 제거합니다.
  6. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 1mL의 세포 현탁액을 4°C에서 최대 6-8시간 동안 보관합니다.
  7. 세포 현탁액 100μL를 취하여 수조에 넣습니다( 그림 1H 참조). 수조에 세포외액 1mL를 넣고 세포가 바닥에 부착될 때까지 40분 동안 가라앉힙니다( 그림 2 참조).
    참고: 치료군의 세포(예: BaCl2 또는 nitroprusside나트륨)의 경우 부착 기간 동안 40분 동안 실온(22-26°C)에서 해당 물질로 사전 배양합니다.

3. whole-cell patch clamp를 사용하여 Kir 전류 기록

  1. 마이크로피펫 제작
    1. 마이크로피펫 풀러를 켭니다( 재료표 참조).
    2. 풀러에 유리관(외경: 1.5mm, 내경: 1.10mm, 길이: 10cm)을 놓습니다. 프로그램 1을 선택하고 Enter를 클릭한 다음 프로그램 1에 액세스합니다. 제어판에서 R을 클릭하여 램프 테스트를 수행하여 유리관의 열 값을 측정합니다.
      알림: 다음 매개변수로 프로그램 1을 편집합니다: 열: Ramp, 당기기: 0, 속도: 25, 지연: 1, 압력: 500, 모드: 지연, 안전 가열 활성화. 램프 테스트는 필라멘트 또는 유리 피펫 유형을 변경할 때 수행해야 합니다. 마이크로피펫은 팁 직경이 ~1-2μm이고 원뿔 길이가 약 5mm여야 합니다. 팁 직경이 작고 원뿔이 길수록 파이펫 저항성이 높아집니다.
    3. 새 유리관을 삽입하고 프로그램 1을 선택합니다. Enter 를 클릭하여 마이크로피펫을 제작합니다.
  2. Kir Current 녹음
    1. 디지털-아날로그 변환기, 신호 증폭기, 미세 조작기, 현미경, 카메라 및 컴퓨터와 같은 하드웨어 장치를 순차적으로 켭니다.
    2. 카메라, 신호 증폭기 및 데이터 수집 소프트웨어 순서로 소프트웨어를 실행합니다.
      참고: 현미경에 카메라가 장착되어 있지 않은 경우 기기 소프트웨어만 활성화하면 됩니다. 하드웨어 초기화 후 소프트웨어가 열려 적절한 기능을 활성화하는지 확인하십시오.
    3. 데이터 수집 소프트웨어에서 파일 > 데이터 파일 이름 설정을 선택하여 데이터 저장 경로를 설정합니다.
    4. Kir 전류를 기록하기 위한 프로토콜을 다음과 같이 편집합니다.
      1. 파형 인터페이스: Epoch A & D: 유형 = 단계; 첫 번째 레벨 = -60mV; 델타 레벨 = 0mV; 첫 번째 지속 시간 = 100ms; 델타 지속 시간 = 0ms. Epoch B: 유형 = step; 첫 번째 레벨 = -160mV; 델타 레벨 = 0mV; 첫 번째 지속 시간 = 1ms; 델타 지속 시간 = 0ms. 에포크 C: 유형 = 램프; 첫 번째 레벨 = 40mV; 델타 레벨 = 20mV; 첫 번째 지속 시간 = 500ms; 델타 지속 시간 = 0ms.
      2. 모드/속도 인터페이스: 시험 지연 = 0초; 득점 = 1; 스윕 = 1; 스윕 지속 시간 = 0.8초
      3. 출력 인터페이스: 채널 #0; 유지 수준 = -60mV. 프로토콜을 저장하고 이름을 "Kir 프로토콜"로 지정합니다.
        참고: 프로토콜 설정은 특정 현재 녹음에 맞게 조정되며 저장 후 재사용할 수 있습니다. 출력 인터페이스가 기기의 배선(예: 채널 #0)과 일치하는지 확인합니다.
    5. 데이터 수집 소프트웨어의 Tools 메뉴에서 Membrane Test 기능을 활성화합니다.
    6. 측정할 셀을 현미경의 카메라 뷰 중앙에 배치합니다.
    7. 기준 와이어 팁을 수조 용액에 담그십시오. 마이크로피펫(3.1단계에서 제작)의 20%를 세포 내 용액으로 채우고 기록 전극 홀더에 고정합니다.
      1. 주사기를 사용하여 양압을 가하고, 피펫 팁을 수조 용액으로 이동하고, 신호 증폭기 소프트웨어에서 피펫 오프셋을 조정하여 현재 기준선을 0pA로 설정합니다( 그림 3A 참조).
        참고: Ag/AgCl 참조선을 사용하십시오. 피펫 저항은 4-6MΩ이어야 합니다.
    8. 피펫을 세포막에 부드럽게 누릅니다. 밀봉 저항(Rt)이 최소 1MΩ으로 증가하는 것을 관찰합니다(그림 3B). 양압을 제거하고 음압을 가하여 Rt≥ 1GΩ으로 높은 저항을 설정합니다(그림 3C).
      1. 유지 전압을 -60mV로 설정하고 Cp Fast 및 Cp Slow를 사용하여 전극 커패시턴스를 보상합니다(그림 3D).
        알림: Rt가 1GΩ 이상으로 유지되면 다음 단계로 진행하십시오. 그렇지 않으면 셀 또는 피펫을 교체하고 3.2.6-3.2.8 단계를 반복합니다.
    9. 짧은 음압을 가하여 세포막을 파열시켜 전체 세포 구성을 형성합니다(그림 3E). 신호 증폭기 소프트웨어에서 Whole Cell 을 선택하고, 멤브레인 커패시턴스 보상을 위해 Auto를 클릭하고(그림 3F), Kir 프로토콜을 로드하고, 데이터 기록을 시작합니다. 처리된 세포에 대해 3.2.6-3.2.9단계를 반복합니다.
      참고: 직렬 저항(Ra)이 >30MΩ인 경우 새 셀을 선택합니다. 30MΩ > Ra > 10MΩ인 경우 기록하기 전에 직렬 저항 보상을 적용하십시오. 이 프로토콜에는 Ra < 10MΩ이 필요합니다.
  3. 데이터 분석
    1. 데이터 분석 소프트웨어를 열고 기록된 데이터를 로드합니다. 커서를 사용하여 현재 트레이스를 분석하고 I-V 곡선 플로팅을 위해 데이터를 내보냅니다.
    2. Edit > Create Stimulus Waveform Signal을 선택하여 자극 파형 신호를 생성하고 확인합니다.
    3. Edit > Transfer Traces를 선택하고, 전체 추적 영역 및 신호(A0 #0)를 지정하고, 추가 분석을 위해 데이터를 복사하여 Kir 프로토콜 추적을 내보냅니다.
    4. Edit > Transfer Traces를 선택하고, 전체 추적 영역 및 신호(IN 0)를 지정하고, 데이터를 복사하여 현재 추적 플롯을 생성하여 대표 Kir 현재 추적을 내보냅니다.
      참고: 다양한 크기의 셀을 정확하게 비교하기 위해 전류 밀도(pA/pF)를 사용하여 현재 데이터를 정규화합니다. 실험17 동안 멤브레인 커패시턴스(Cm)가 기록되었는지 확인합니다.

결과

동맥 평활근 세포의 분리
절차의 첫 번째 섹션은 쥐의 대뇌 기저 동맥에서 평활근 세포를 분리하는 과정을 자세히 설명합니다. 이 프로세스는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 절차에는 동맥에서 평활근 세포를 방출하기 위한 효소 소화 및 세포 분리 단계가 포함됩니다.

분리된 평활근 세포의 대표 이미지

토론

갓 분리된 세포를 사용한 전체 세포 기록은 1980년대 초반으로 거슬러 올라가며, 18 설치류 기저 평활근 세포의 채널 전류 기록은 1990년대에 널리 시행되었습니다19. 기술이 발전함에 따라 연구자들은 이러한 기술을 통해 얻은 결과에 점점 더 집중하고 있습니다. 그러나 기술적 방법을 업데이트하고 요약하는 데 대한 관심은 점차 줄어들?...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 "Xinglin Scholars and Discipline Talents Research Promotion Plan"(33002324)을 위한 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine의 특별 인재 프로그램과 Luliang시에 고급 과학 기술 인재를 소개하기 위한 핵심 연구 개발 프로젝트(2022RC28)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine serum albuminSigma, USAB2064
Barium chlorideMacklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA501330
CameraHamamatsu, JapanC11440
Camera softwareImage J, USAMicro-manager 2.0.0-gammal
Collagenase FSigma, USAC7926
Collagenase HSigma, USAC8051
ComputerLenovo, China~
Data acquisition softwareMolecular Devices, USAClampex 10.4
Data analysis softwareAxon, USAclampfit 10.4
D-glucoseSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610219
Digital-analog converterMolecular Devices, USAAxon digidata 1550B
DithiothreitolSigma, USAD0632
Drawing softwareSan Diego, California, USAGraphPad 
EGTASangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600077
Glass tubeDL Naturegene Life Sciences.USAB150-86-10
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100781
MgCl2·6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100288
Micromanipulatorsutter, USAMP285A
Micropipette pullersutter, USAP1000
MicroscopeOlympus, JapanIX73
Na2-ATPSigma, USAA26209
Na2HPO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610404
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100241
NaH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600878
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100865
NaOHSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100173
PapainSigma, USAP4762
Potassium-D-gluconateSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA507810
Signal amplifierMolecular Devices, USAAxon MutiClamp 700B
Signal amplifier softwareMolecular Devices, USAMultiClamp Commander software
Sodium nitroprussideSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600867
Statistical analysis softwareSan Diego, California, USAGraphPad 

참고문헌

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