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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo rapido ed efficiente per isolare le cellule muscolari lisce dall'arteria basilare di ratto e registrare le correnti del canale del potassio che rettificano verso l'interno in queste cellule utilizzando la tecnica del patch clamp a cellula intera. Offre un nuovo approccio per i ricercatori che studiano l'arteria basilare e i canali ionici.

Abstract

La malattia cerebrovascolare è una condizione prevalente tra gli anziani, con la sua incidenza in costante aumento. L'arteria basilare è un vaso cerebrale critico che irrora il ponte, il cervelletto, le regioni cerebrali posteriori e l'orecchio interno. L'attività del canale del potassio (K+) svolge un ruolo significativo nel determinare il tono vascolare regolando il potenziale di membrana cellulare. L'attivazione dei canali K+ (Kir) che rettificano verso l'interno, come altri canali K+ , porta all'iperpolarizzazione e alla vasodilatazione della membrana cellulare. In questo studio, le cellule muscolari lisce appena isolate dall'arteria basilare sono state utilizzate per registrare le correnti Kir tramite la tecnica del patch clamp a cellula intera. Sono stati studiati gli effetti di 100 μmol/L di BaCl2, un inibitore del canale Kir, e di 10 μmol/L di nitroprusside di sodio (SNP), un nitrovasodilatatore, sulle correnti del canale Kir. I risultati hanno dimostrato che BaCl2 ha inibito le correnti del canale Kir nelle cellule muscolari lisce dell'arteria basilare, mentre lo SNP ha potenziato queste correnti. Questo protocollo fornisce una guida completa per la preparazione di cellule muscolari lisce arteriose appena isolate e per la registrazione delle correnti del canale Kir utilizzando la tecnica del patch clamp, offrendo una risorsa preziosa per i ricercatori che cercano di padroneggiare questo metodo.

Introduzione

La malattia cerebrovascolare è una condizione prevalente nella popolazione anziana. Con il miglioramento del tenore di vita, l'aumento dell'aspettativa di vita e l'invecchiamento della popolazione, l'incidenza delle malattie cerebrovascolari è in costante aumento1. L'arteria basilare, un vaso spaiato formato dalla fusione delle arterie vertebrali bilaterali, corre sotto il ponte all'interno del cranio e si divide in due arterie cerebrali posteriori. Fornisce il ponte, il cervelletto, le regioni posteriori del cervello e l'orecchio interno. Un insufficiente afflusso di sangue all'arteria basilare può portare a vertigini episodiche, spesso accompagnate da nausea e vomito. I pazienti possono anche manifestare sintomi come acufene, perdita dell'udito e altri problemi correlati. Questi sintomi sono spesso associati a condizioni come la spondilosi cervicale, l'aterosclerosi cerebrale e la pressione sanguigna anormale. La malattia cerebrovascolare, particolarmente diffusa tra gli individui di mezza età e gli anziani, è spesso collegata a queste condizioni di base 2,3,4.

Le arterie di resistenza svolgono un ruolo vitale nella funzione cardiovascolare e nel mantenimento dell'omeostasi corporea. Come sito primario di resistenza vascolare, regolano la pressione sanguigna e la gittata cardiaca, garantendo un flusso sanguigno sufficiente a soddisfare le richieste metaboliche e fisiologiche di tessuti e organi5. L'arteria basilare, classificata come arteria di resistenza, regola principalmente il flusso sanguigno al tronco encefalico6. Le cellule muscolari lisce, che formano le pareti delle arterie di resistenza, sono mediatori chiave della resistenza vascolare attraverso la regolazione della contrazione allo stato stazionario o della tensione vascolare. Queste cellule ospitano numerosi canali ionici, tra cui i canali K+, i canali Ca2+ e i canali Cl-, che sono fondamentali per la modulazione del tono vascolare 5,7.

I canali K+ sono fondamentali per stabilire il potenziale di membrana e regolare il tono contrattile delle cellule muscolari lisce arteriose8. Esistono quattro tipi di canali K+ nella muscolatura liscia arteriosa: K+ voltaggio-dipendente (Kᴠ), K+ dipendente dal Ca2+ (KCa), K+ ATP-dipendente (KATP) e i canali K+ (Kir) del raddrizzatore verso l'interno 9,10,11. I canali Kir sono classificati in sette sottotipi, con Kir2.x che sono canali Kir classici. Tra queste, le sottofamiglie Kir2.x sono le più rilevanti nel sistema vascolare. Le correnti Kir mostrano una rettifica verso l'interno a tensioni negative, indicando un afflusso netto di K+ nella cella, mentre a tensioni positive,il flusso di corrente K+ netto 5 è minimo o nullo. Nel sistema cardiovascolare, i canali Kir sono essenziali per stabilizzare il potenziale di membrana. La loro attivazione induce iperpolarizzazione e vasodilatazione della membrana cellulare 12,13,14.

Esperimenti di patch-clamp su cellule muscolari lisce appena isolate sono stati condotti in varie arterie, tra cui arterie coronarie, cerebrali, renali e mesenteriche15,16. Sebbene alcuni metodi utilizzino lo stesso tipo di collagenasi per l'isolamento cellulare, le procedure precise variano. Pochi studi hanno riassunto in modo completo i metodi per isolare le cellule muscolari lisce vascolari. Pertanto, questo studio si concentra sul nuovo isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari primarie dall'arteria basilare di ratto e sulla registrazione delle correnti del canale Kir in queste cellule utilizzando la tecnica del patch clamp a cellula intera, fornendo un protocollo dettagliato e completo per i ricercatori in campi correlati.

Protocollo

Il protocollo sugli animali è stato approvato dal Comitato Etico per il Benessere degli Animali del Laboratorio di Medicina Tradizionale Cinese dell'Università di Chengdu (Record No. 2024035). In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley (SD), del peso di 260-300 g e di età compresa tra 8 e 10 settimane. Agli animali è stata fornita acqua e cibo (mangime sperimentale SPF) ad libitum. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Dissezione dell'arteria basilare di ratto

  1. Preparazione della soluzione
    1. Preparare le soluzioni come descritto nella Tabella 1.
  2. Anestetizzare il ratto mediante inalazione di isoflurano al 2%. Confermare l'anestesia profonda con un pizzico per le dita dei piedi. Se necessario, somministrare ulteriori anestetici. Procedere immediatamente all'apertura del cranio e all'esposizione del cervello sul tavolo operatorio portatile.
  3. Trasferire rapidamente il cervello in una capsula di Petri contenente PSS satura con il 95% di O2 e il 5% di CO2 a 4 °C. Assicurarsi che la soluzione abbia un pH di 7,40.
  4. Posiziona il cervello ventralmente verso l'alto in una capsula di Petri e fissalo con degli aghi. Al microscopio ottico, individuare l'arteria basilare e rimuovere con cura il tessuto circostante utilizzando pinzette e forbici autoclavate (vedi Figura 1A).
  5. Inserire un filo lungo 2 cm con un diametro di 25 μm nell'arteria basilare isolata. Strofinare delicatamente la parete interna con il filo per rimuovere efficacemente l'endotelio vascolare.
    NOTA: L'arteria basilare nei ratti è situata all'interno dei solchi basali del tronco encefalico alla base del cervello ed è formata dalla confluenza delle arterie vertebrali sinistra e destra2. Durante il processo di isolamento, maneggiare l'arteria con cura per evitare un eccessivo stiramento o compressione che potrebbe causare danni.

2. Isolamento delle cellule muscolari lisce

  1. Preriscaldare 1 mL di soluzione di separazione cellulare, 1 mL di idrolizzato enzimatico I e 1 mL di idrolizzato enzimatico II a 37 °C rispettivamente nelle provette 1, 2 e 3 (vedere la Figura 1B).
  2. Trasferire l'arteria basilare isolata nella provetta 2. Iniettare continuamente una miscela di 95% di O2 e 5% di CO2 nella provetta e mantenere il trattamento enzimatico per 30 minuti (vedere Figura 1C).
  3. Trasferire l'arteria basilare dalla provetta 2 alla provetta 3. Continuare a iniettare il 95% di O2 e il 5% di CO2 nel tubo e mantenere il trattamento enzimatico per 5 minuti (vedere Figura 1D).
  4. Aggiungere 1 mL di soluzione di separazione cellulare a 37 °C dalla provetta 1 alla provetta 3. Continuare a iniettare il 95% di O2 e il 5% di CO2 mantenendo il trattamento enzimatico per 3 minuti. Triturare la preparazione dell'arteria basilare per rilasciare le cellule (vedi Figura 1E).
  5. Aggiungere una soluzione di separazione a 4 °C alla provetta 3 per terminare il processo enzimatico (vedere Figura 1F). Centrifugare il composto a 59 × g per 6 min. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta, aggiungere nuovamente la soluzione di separazione a 4 °C (vedere Figura 1G) e ripetere la centrifugazione due volte per rimuovere gli enzimi residui.
  6. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta e conservare 1 mL di sospensione cellulare a 4 °C per un massimo di 6-8 ore.
  7. Prelevare 100 μl della sospensione cellulare e metterla nella vasca da bagno (cfr. figura 1H). Aggiungere 1 mL di liquido extracellulare al bagno e lasciare che le cellule si stabilizzino per 40 minuti per attaccarsi al fondo (vedere la Figura 2).
    NOTA: Per le cellule del gruppo di trattamento (ad es. BaCl2 o nitroprussiato di sodio), preincubare con le rispettive sostanze a temperatura ambiente (22-26°C) per 40 minuti durante il periodo di fissaggio.

3. Registrazione della corrente Kir utilizzando il patch clamp a cella intera

  1. Fabbricazione di micropipette
    1. Accendere l'estrattore per micropipette (fare riferimento alla Tabella dei materiali).
    2. Inserire un tubo di vetro (diametro esterno: 1,5 mm, diametro interno: 1,10 mm, lunghezza: 10 cm) nell'estrattore. Seleziona Programma 1, fai clic su Invio e accedi al Programma 1. Eseguire un test di rampa facendo clic su Rampa sul pannello di controllo per misurare il valore termico del tubo di vetro.
      NOTA: Modificare il programma 1 con i seguenti parametri: Calore: Rampa, Trazione: 0, Velocità: 25, Ritardo: 1, Pressione: 500, Modalità: Ritardo, Calore sicuro abilitato. Il test di rampa deve essere eseguito quando si cambiano i tipi di filamenti o pipette in vetro. Le micropipette devono avere un diametro del puntale di ~1-2 μm e una lunghezza del cono di circa 5 mm. I diametri dei puntali più piccoli e i coni più lunghi si traducono in una maggiore resistenza delle pipette.
    3. Inserire un nuovo tubo di vetro e selezionare Programma 1. Fare clic su Invio per fabbricare la micropipetta.
  2. Registrazione della corrente Kir
    1. Accendi i dispositivi hardware in sequenza: convertitore digitale-analogico, amplificatore di segnale, micromanipolatore, microscopio, fotocamera e computer.
    2. Avviare il software nel seguente ordine: fotocamera, amplificatore di segnale e software di acquisizione dati.
      NOTA: Se un microscopio non è dotato di una fotocamera, è necessario attivare solo il software dello strumento. Assicurarsi che il software sia aperto dopo l'inizializzazione dell'hardware per abilitare il corretto funzionamento.
    3. Nel software di acquisizione dati, selezionare File > Imposta nomi file di dati per stabilire un percorso di archiviazione dei dati.
    4. Modificare il protocollo per la registrazione delle correnti Kir come segue:
      1. Interfaccia forma d'onda: Epoca A & D: Tipo = passo; Primo livello = −60 mV; Livello delta = 0 mV; Prima durata = 100 ms; Durata delta = 0 ms. Epoca B: Tipo = passo; Primo livello = −160 mV; Livello delta = 0 mV; Prima durata = 1 ms; Durata delta = 0 ms. Epoca C: Tipo = rampa; Primo livello = 40 mV; Livello delta = 20 mV; Prima durata = 500 ms; Durata delta = 0 ms.
      2. Interfaccia modalità/velocità: ritardo di prova = 0 s; Corse = 1; Spazzate = 1; Durata dello sweep = 0,8 s.
      3. Interfaccia uscite: Canale #0; Livello di mantenimento = −60 mV. Salvare e denominare il protocollo come "Protocollo Kir".
        NOTA: L'impostazione del protocollo è personalizzata per registrazioni correnti specifiche e può essere riutilizzata dopo il salvataggio. Assicurarsi che l'interfaccia di uscita corrisponda al cablaggio dello strumento (ad esempio, il canale #0).
    5. Abilitare la funzione Membrane Test nel menu Strumenti del software di acquisizione dati.
    6. Posizionare la cella per la misurazione al centro della vista della fotocamera del microscopio.
    7. Immergere la punta del filo di riferimento nella soluzione del bagno. Riempire il 20% della micropipetta (realizzata al punto 3.1) con la soluzione intracellulare e fissarla sul supporto dell'elettrodo di registrazione.
      1. Applicare una pressione positiva utilizzando una siringa, spostare la punta della pipetta nella soluzione del bagno e regolare l'offset della pipetta sul software dell'amplificatore di segnale per impostare la linea di base corrente su 0 pA (vedere la Figura 3A).
        NOTA: Utilizzare cavi di riferimento Ag/AgCl. La resistenza della pipetta deve essere di 4-6 MΩ.
    8. Premere delicatamente la pipetta contro la membrana cellulare. Osservare un aumento della resistenza della tenuta (Rt) ad almeno 1 MΩ (Figura 3B). Rimuovere la pressione positiva e applicare una pressione negativa per stabilire un'elevata resistenza con Rt ≥ 1 GΩ (Figura 3C).
      1. Impostare la tensione di mantenimento su -60 mV e compensare la capacità dell'elettrodo utilizzando Cp Fast e Cp Slow (Figura 3D).
        NOTA: Se Rt rimane superiore a 1 GΩ, procedere al passaggio successivo; In caso contrario, sostituire la cella o la pipetta e ripetere i passaggi 3.2.6-3.2.8.
    9. Applicare una breve pressione negativa per rompere la membrana cellulare, formando una configurazione dell'intera cellula (Figura 3E). Selezionare Whole Cell nel software dell'amplificatore di segnale, fare clic su Auto per la compensazione della capacità della membrana (Figura 3F), caricare il protocollo Kir e iniziare la registrazione dei dati. Ripetere i passaggi 3.2.6-3.2.9 per le cellule trattate.
      NOTA: Se la resistenza in serie (Ra) è >30 MΩ, selezionare una nuova cella. Se 30 MΩ > Ra > 10 MΩ, applicare la compensazione della resistenza in serie prima della registrazione. Questo protocollo richiede Ra < 10 MΩ.
  3. Analisi dei dati
    1. Aprire il software di analisi dei dati e caricare i dati registrati. Utilizzare i cursori per analizzare le tracce correnti ed esportare i dati per la rappresentazione grafica delle curve I-V.
    2. Creare un segnale della forma d'onda dello stimolo selezionando Modifica > Crea segnale della forma d'onda dello stimolo e confermare.
    3. Esportare la traccia del protocollo Kir selezionando Modifica > Trasferisci tracce, specificando la regione di traccia completa e il segnale (A0 #0) e copiando i dati per ulteriori analisi.
    4. Esporta le tracce correnti Kir rappresentative selezionando Modifica > Trasferisci tracce, specificando la regione di traccia completa e il segnale (IN 0) e copiando i dati per generare grafici di traccia correnti.
      NOTA: Normalizza i dati correnti utilizzando la densità di corrente (pA/pF) per un confronto accurato tra celle di varie dimensioni. Assicurarsi che la capacità della membrana (Cm) sia registrata durante l'esperimento17.

Risultati

Isolamento delle cellule muscolari lisce arteriose
La prima sezione della procedura descrive in dettaglio il processo di isolamento delle cellule muscolari lisce dall'arteria basilare cerebrale del ratto. Questo processo è illustrato nella Figura 1. La procedura prevede la digestione enzimatica e le fasi di separazione cellulare per rilasciare le cellule muscolari lisce dall'arteria.

Immagini rappresen...

Discussione

La registrazione di intere cellule utilizzando cellule appena isolate risale ai primi anni '8018 e la registrazione delle correnti di canale dalle cellule muscolari lisce basilari dei roditori è diventata ampiamente praticata negli anni '9019. Con i progressi tecnologici, i ricercatori si concentrano sempre più sui risultati ottenuti attraverso queste tecnologie. Tuttavia, l'attenzione prestata all'aggiornamento e alla sintesi dei metodi ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dallo Special Talent Program dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu per "Xinglin Scholars and Discipline Talents Research Promotion Plan" (33002324) e dal Key Research and Development Project for Introducing High-Level Scientific and Technological Talents, in Luliang City (2022RC28).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine serum albuminSigma, USAB2064
Barium chlorideMacklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA501330
CameraHamamatsu, JapanC11440
Camera softwareImage J, USAMicro-manager 2.0.0-gammal
Collagenase FSigma, USAC7926
Collagenase HSigma, USAC8051
ComputerLenovo, China~
Data acquisition softwareMolecular Devices, USAClampex 10.4
Data analysis softwareAxon, USAclampfit 10.4
D-glucoseSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610219
Digital-analog converterMolecular Devices, USAAxon digidata 1550B
DithiothreitolSigma, USAD0632
Drawing softwareSan Diego, California, USAGraphPad 
EGTASangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600077
Glass tubeDL Naturegene Life Sciences.USAB150-86-10
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100781
MgCl2·6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100288
Micromanipulatorsutter, USAMP285A
Micropipette pullersutter, USAP1000
MicroscopeOlympus, JapanIX73
Na2-ATPSigma, USAA26209
Na2HPO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610404
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100241
NaH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600878
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100865
NaOHSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100173
PapainSigma, USAP4762
Potassium-D-gluconateSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA507810
Signal amplifierMolecular Devices, USAAxon MutiClamp 700B
Signal amplifier softwareMolecular Devices, USAMultiClamp Commander software
Sodium nitroprussideSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600867
Statistical analysis softwareSan Diego, California, USAGraphPad 

Riferimenti

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