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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rapide et efficace pour isoler les cellules musculaires lisses de l’artère basilaire du rat et enregistrer les courants des canaux potassiques rectificatifs vers l’intérieur dans ces cellules à l’aide de la technique du patch clamp de cellules entières. Il offre une nouvelle approche aux chercheurs qui étudient l’artère basilaire et les canaux ioniques.

Résumé

Les maladies cérébrovasculaires sont une affection répandue chez les personnes âgées, dont l’incidence ne cesse d’augmenter. L’artère basilaire est un vaisseau cérébral essentiel qui alimente le pont, le cervelet, les régions postérieures du cerveau et l’oreille interne. L’activité des canaux potassiques (K+) joue un rôle important dans la détermination du tonus vasculaire en régulant le potentiel de la membrane cellulaire. L’activation des canaux K+ rectificatifs vers l’intérieur (Kir), comme les autres canaux K+ , entraîne une hyperpolarisation et une vasodilatation de la membrane cellulaire. Dans cette étude, des cellules musculaires lisses fraîchement isolées de l’artère basilaire ont été utilisées pour enregistrer les courants de Kir via la technique du patch clamp à cellules entières. Les effets de 100 μmol/L de BaCl2, un inhibiteur du canal Kir, et de 10 μmol/L de nitroprussiate sodilatateur de sodium (SNP), un nitrovasodilatateur, sur les courants du canal Kir ont été étudiés. Les résultats ont démontré que BaCl2 inhibait les courants du canal Kir dans les cellules musculaires lisses de l’artère basilaire, tandis que le SNP augmentait ces courants. Ce protocole fournit un guide complet pour la préparation de cellules musculaires lisses artérielles fraîchement isolées et l’enregistrement des courants du canal Kir à l’aide de la technique du patch clamp, offrant une ressource précieuse pour les chercheurs cherchant à maîtriser cette méthode.

Introduction

Les maladies cérébrovasculaires sont une affection répandue chez les personnes âgées. Avec l’amélioration du niveau de vie, l’augmentation de l’espérance de vie et le vieillissement de la population, l’incidence des maladies cérébrovasculaires ne cesse d’augmenter1. L’artère basilaire, un vaisseau non apparié formé par la fusion des artères vertébrales bilatérales, passe sous les boutons à l’intérieur du crâne et se divise en deux artères cérébrales postérieures. Il alimente le pont, le cervelet, les régions postérieures du cerveau et l’oreille interne. Un apport sanguin insuffisant à l’artère basilaire peut entraîner des vertiges épisodiques, souvent accompagnés de nausées et de vomissements. Les patients peuvent également présenter des symptômes tels que des acouphènes, une perte auditive et d’autres problèmes connexes. Ces symptômes sont fréquemment associés à des affections telles que la spondylose cervicale, l’athérosclérose cérébrale et une pression artérielle anormale. Les maladies cérébrovasculaires, particulièrement répandues chez les personnes d’âge moyen et les personnes âgées, sont souvent liées à ces affections sous-jacentes 2,3,4.

Les artères de résistance jouent un rôle essentiel dans la fonction cardiovasculaire et le maintien de l’homéostasie corporelle. En tant que principal site de résistance vasculaire, ils régulent la pression artérielle et le débit cardiaque, assurant un flux sanguin suffisant pour répondre aux exigences métaboliques et physiologiques des tissus et des organes5. L’artère basilaire, classée comme artère de résistance, régule principalement le flux sanguin vers le tronc cérébral6. Les cellules musculaires lisses, qui forment les parois des artères de résistance, sont des médiateurs clés de la résistance vasculaire par la régulation de la contraction à l’état d’équilibre ou de la tension vasculaire. Ces cellules hébergent de nombreux canaux ioniques, notamment les canaux K+, les canaux Ca2+ et les canaux Cl-, qui sont essentiels à la modulation du tonus vasculaire 5,7.

Les canaux K+ sont essentiels à l’établissement du potentiel membranaire et à la régulation du tonus contractile des cellules musculaires lisses artérielles8. Il existe quatre types de canaux K+ dans le muscle lisse artériel : K+ dépendant du voltage (Kᴠ), K+ dépendant de Ca2+ (KCa), K+ dépendant de l’ATP (KATP) et les canaux9, 10, 11 du redresseur vers l’intérieur K+ (Kir). Les chaînes Kir sont classées en sept sous-types, Kir2.x étant des chaînes Kir classiques. Parmi celles-ci, les sous-familles Kir2.x sont les plus pertinentes dans le système vasculaire. Les courants Kir présentent une rectification vers l’intérieur aux tensions négatives, indiquant un afflux net de K+ dans la cellule, tandis qu’aux tensions positives, il y a peu ou pas de flux de courant net K+ 5. Dans le système cardiovasculaire, les canaux Kir sont essentiels pour stabiliser le potentiel membranaire. Leur activation induit une hyperpolarisation et une vasodilatation de la membrane cellulaire 12,13,14.

Des expériences de patch-clamp sur des cellules musculaires lisses fraîchement isolées ont été menées dans diverses artères, notamment les artères coronaires, cérébrales, rénales et mésentériques15,16. Bien que certaines méthodes utilisent le même type de collagénase pour l’isolement cellulaire, les procédures précises varient. Peu d’études ont résumé de manière exhaustive les méthodes d’isolement des cellules musculaires lisses vasculaires. Par conséquent, cette étude se concentre sur l’isolement frais de cellules musculaires lisses vasculaires primaires de l’artère basilaire du rat et l’enregistrement des courants du canal Kir dans ces cellules à l’aide de la technique de patch clamp de cellules entières, fournissant un protocole détaillé et complet pour les chercheurs dans des domaines connexes.

Protocole

Le protocole animal a été approuvé par le Comité d’éthique du bien-être animal de laboratoire de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (enregistrement n° 2024035). Des rats Sprague-Dawley mâles, pesant de 260 à 300 g et âgés de 8 à 10 semaines, ont été utilisés dans cette étude. Les animaux ont reçu de l’eau et de la nourriture (SPF, alimentation expérimentale pour animaux) ad libitum. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Dissection de l’artère basilaire chez le rat

  1. Préparation de la solution
    1. Préparez les solutions comme décrit dans le tableau 1.
  2. Anesthésier le rat par inhalation de 2 % d’isoflurane. Confirmez l’anesthésie profonde à l’aide d’un pincement des orteils. Si nécessaire, administrez des anesthésiques supplémentaires. Procédez immédiatement à l’ouverture du crâne et exposez le cerveau sur la table d’opération portable.
  3. Transférez rapidement le cerveau dans une boîte de Pétri contenant du PSS saturé de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2 à 4 °C. Assurez-vous que la solution a un pH de 7,40.
  4. Positionnez le cerveau ventralement vers le haut dans une boîte de Pétri et fixez-le avec des aiguilles. Au microscope optique, localisez l’artère basilaire et retirez soigneusement le tissu environnant à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux autoclavés (voir Figure 1A).
  5. Insérez un fil de 2 cm de long et d’un diamètre de 25 μm dans l’artère basilaire isolée. Frottez doucement la paroi interne avec le fil pour éliminer efficacement l’endothélium vasculaire.
    REMARQUE : L’artère basilaire chez le rat est située dans les sillons basaux du tronc cérébral à la base du cerveau et est formée par la confluence des artères vertébrales gauche et droite2. Pendant le processus d’isolement, manipulez l’artère avec soin pour éviter un étirement ou une compression excessifs qui pourraient entraîner des dommages.

2. Isolement des cellules musculaires lisses

  1. Préchauffer 1 mL de solution de séparation cellulaire, 1 mL d’hydrolysat enzymatique I et 1 mL d’hydrolysat enzymatique II à 37 °C dans des tubes à essai 1, 2 et 3, respectivement (voir la figure 1B).
  2. Transférez l’artère basilaire isolée dans le tube à essai 2. Injecter en continu un mélange de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2 dans le tube et maintenir le traitement enzymatique pendant 30 min (voir Figure 1C).
  3. Transférez l’artère basilaire du tube à essai 2 vers le tube à essai 3. Continuer à injecter 95 % d’O2 et 5 % de CO2 dans le tube et maintenir le traitement enzymatique pendant 5 min (voir Figure 1D).
  4. Ajouter 1 mL de solution de séparation cellulaire à 37 °C du tube à essai 1 dans le tube à essai 3. Poursuivre l’injection de 95 % d’O2 et 5 % de CO2 tout en maintenant le traitement enzymatique pendant 3 min. Triturez la préparation de l’artère basilaire pour libérer les cellules (voir Figure 1E).
  5. Ajouter une solution de séparation à 4 °C dans le tube à essai 3 pour terminer le processus enzymatique (voir Figure 1F). Centrifuger le mélange à 59 × g pendant 6 min. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, ajouter à nouveau une solution de séparation à 4 °C (voir figure 1G) et répéter la centrifugation deux fois pour éliminer les enzymes résiduelles.
  6. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et conserver 1 mL de suspension cellulaire à 4 °C pendant 6 à 8 h au maximum.
  7. Prélever 100 μL de suspension cellulaire et les placer dans le bain (voir Figure 1H). Ajoutez 1 ml de liquide extracellulaire dans le bain et laissez les cellules se stabiliser pendant 40 minutes pour se fixer au fond (voir la figure 2).
    REMARQUE : Pour les cellules du groupe de traitement (par exemple, BaCl2 ou nitroprussiate de sodium), pré-incuber avec les substances respectives à température ambiante (22-26 °C) pendant 40 min pendant la période de fixation.

3. Enregistrement du courant Kir à l’aide d’une pince patch à cellules entières

  1. Fabrication de micropipettes
    1. Allumez l’extracteur de micropipette (reportez-vous à la table des matériaux).
    2. Placez un tube en verre (diamètre extérieur : 1,5 mm, diamètre intérieur : 1,10 mm, longueur : 10 cm) dans l’extracteur. Sélectionnez Programme 1, cliquez sur Entrer et accédez au Programme 1. Effectuez un test de rampe en cliquant sur Rampe sur le panneau de commande pour mesurer la valeur thermique du tube de verre.
      REMARQUE : Modifiez le programme 1 avec les paramètres suivants : Chaleur : Rampe, Traction : 0, Vitesse : 25, Retard : 1, Pression : 500, Mode : Retard, Chauffage de sécurité activé. Le test de rampe doit être effectué lors du changement de filaments ou de types de pipettes en verre. Les micropipettes doivent avoir un diamètre de pointe de ~1-2 μm et une longueur de cône d’environ 5 mm. Des diamètres de pointe plus petits et des cônes plus longs permettent d’augmenter la résistance des pipettes.
    3. Insérez un nouveau tube en verre et sélectionnez Programme 1. Cliquez sur Entrer pour fabriquer la micropipette.
  2. Enregistrement de Kir Current
    1. Allumez les périphériques matériels de manière séquentielle : convertisseur numérique-analogique, amplificateur de signal, micromanipulateur, microscope, appareil photo et ordinateur.
    2. Lancez le logiciel dans l’ordre suivant : caméra, amplificateur de signal et logiciel d’acquisition de données.
      REMARQUE : Si un microscope n’est pas équipé d’une caméra, seul le logiciel de l’instrument doit être activé. Assurez-vous que le logiciel est ouvert après l’initialisation du matériel pour permettre une fonctionnalité correcte.
    3. Dans le logiciel d’acquisition de données, sélectionnez Fichier > Définir les noms de fichiers de données pour établir un chemin de stockage de données.
    4. Modifiez le protocole d’enregistrement des courants Kir comme suit :
      1. Interface de forme d’onde : Epoch A & D : Type = pas ; Premier niveau = −60 mV ; Niveau delta = 0 mV ; Première durée = 100 ms ; Durée du delta = 0 ms. Époque B : Type = pas ; Premier niveau = −160 mV ; Niveau delta = 0 mV ; Première durée = 1 ms ; Durée du delta = 0 ms. Époque C : Type = rampe ; Premier niveau = 40 mV ; Niveau delta = 20 mV ; Première durée = 500 ms ; Durée delta = 0 ms.
      2. Interface mode/débit : Délai d’essai = 0 s ; Runs = 1 ; Balayages = 1 ; Durée du balayage = 0,8 s.
      3. Interface de sortie : Canal #0 ; Niveau de maintien = −60 mV. Enregistrez et nommez le protocole « Protocole Kir ».
        REMARQUE : La configuration du protocole est adaptée à des enregistrements en cours spécifiques et peut être réutilisée après la sauvegarde. Assurez-vous que l’interface de sortie correspond au câblage de l’instrument (par exemple, le canal #0).
    5. Activez la fonction Test de membrane dans le menu Outils du logiciel d’acquisition de données.
    6. Positionnez la cellule de mesure au centre de la vue de la caméra du microscope.
    7. Plongez l’embout du fil de référence dans la solution du bain. Remplissez 20 % de la micropipette (fabriquée à l’étape 3.1) avec la solution intracellulaire et fixez-la sur le porte-électrode d’enregistrement.
      1. Appliquez une pression positive à l’aide d’une seringue, déplacez la pointe de la pipette dans la solution du bain et ajustez le décalage de la pipette sur le logiciel de l’amplificateur de signal pour régler la ligne de base actuelle à 0 pA (voir Figure 3A).
        REMARQUE : Utilisez des fils de référence Ag/AgCl. La résistance de la pipette doit être de 4 à 6 MΩ.
    8. Appuyez doucement la pipette contre la membrane cellulaire. Observez une augmentation de la résistance d’étanchéité (Rt) à au moins 1 MΩ (Figure 3B). Supprimez la pression positive et appliquez une pression négative pour établir une résistance élevée avec Rt ≥ 1 GΩ (Figure 3C).
      1. Réglez la tension de maintien à −60 mV et compensez la capacité de l’électrode à l’aide de Cp Fast et Cp Slow (Figure 3D).
        REMARQUE : Si Rt reste supérieur à 1 GΩ, passez à l’étape suivante ; Sinon, remplacez la pile ou la pipette et répétez les étapes 3.2.6 à 3.2.8.
    9. Appliquez une brève pression négative pour rompre la membrane cellulaire, formant une configuration de cellules entières (Figure 3E). Sélectionnez Whole Cell dans le logiciel de l’amplificateur de signal, cliquez sur Auto pour la compensation de capacité membranaire (Figure 3F), chargez le protocole Kir et lancez l’enregistrement des données. Répéter les étapes 3.2.6 à 3.2.9 pour les cellules traitées.
      REMARQUE : Si la résistance série (Ra) est de >30 MΩ, sélectionnez une nouvelle cellule. Si 30 MΩ > Ra > 10 MΩ, appliquez une compensation de résistance série avant l’enregistrement. Ce protocole nécessite une < Ra de 10 MΩ.
  3. Analyse des données
    1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données et chargez les données enregistrées. Utilisez les curseurs pour analyser les traces actuelles et exporter les données pour le traçage des courbes I-V.
    2. Créez un signal de forme d’onde de stimulus en sélectionnant Modifier > Créer un signal de forme d’onde de stimulus et confirmez.
    3. Exportez la trace du protocole Kir en sélectionnant Modifier > Transférer les traces, en spécifiant la région de trace et le signal complets (A0 #0) et en copiant les données pour une analyse plus approfondie.
    4. Exportez des traces de courant Kir représentatives en sélectionnant Modifier > Transférer les traces, en spécifiant la région de trace et le signal complets (IN 0) et en copiant les données pour générer les tracés de trace actuels.
      REMARQUE : Normalisez les données de courant à l’aide de la densité de courant (pA/pF) pour une comparaison précise entre des cellules de tailles différentes. Assurez-vous que la capacité de la membrane (Cm) est enregistrée pendant l’expérience17.

Résultats

Isolement des cellules musculaires lisses artérielles
La première section de la procédure détaille le processus d’isolement des cellules musculaires lisses de l’artère basilaire cérébrale du rat. Ce processus est illustré à la figure 1. La procédure implique une digestion enzymatique et des étapes de séparation cellulaire pour libérer les cellules musculaires lisses de l’artère.

Imag...

Discussion

L’enregistrement de cellules entières à l’aide de cellules fraîchement isolées remonte au début des années 198018, et l’enregistrement des courants de canal à partir de cellules musculaires lisses basilaires de rongeurs est devenu largement pratiqué dans les années 199019. Avec les progrès technologiques, les chercheurs se concentrent de plus en plus sur les résultats obtenus grâce à ces technologies. Cependant, l’atten...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme de talents spéciaux de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu pour le « Plan de promotion de la recherche sur les chercheurs et les talents disciplinaires de Xinglin » (33002324) et le projet clé de recherche et de développement pour l’introduction de talents scientifiques et technologiques de haut niveau dans la ville de Luliang (2022RC28).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine serum albuminSigma, USAB2064
Barium chlorideMacklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaB861682
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA501330
CameraHamamatsu, JapanC11440
Camera softwareImage J, USAMicro-manager 2.0.0-gammal
Collagenase FSigma, USAC7926
Collagenase HSigma, USAC8051
ComputerLenovo, China~
Data acquisition softwareMolecular Devices, USAClampex 10.4
Data analysis softwareAxon, USAclampfit 10.4
D-glucoseSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610219
Digital-analog converterMolecular Devices, USAAxon digidata 1550B
DithiothreitolSigma, USAD0632
Drawing softwareSan Diego, California, USAGraphPad 
EGTASangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600077
Glass tubeDL Naturegene Life Sciences.USAB150-86-10
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ChinaS3872
KClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100781
MgCl2·6H2OSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100288
Micromanipulatorsutter, USAMP285A
Micropipette pullersutter, USAP1000
MicroscopeOlympus, JapanIX73
Na2-ATPSigma, USAA26209
Na2HPO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA610404
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100241
NaH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600878
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100865
NaOHSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA100173
PapainSigma, USAP4762
Potassium-D-gluconateSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA507810
Signal amplifierMolecular Devices, USAAxon MutiClamp 700B
Signal amplifier softwareMolecular Devices, USAMultiClamp Commander software
Sodium nitroprussideSangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, ChinaA600867
Statistical analysis softwareSan Diego, California, USAGraphPad 

Références

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