检查小鼠身份识别的行为任务

摘要

通过将消极或积极价值的经验与个体社会目标配对，我们开发了用于检查 C57BL/6 小鼠身份识别的行为任务。这些任务允许研究社会认知受损的健康和疾病相关小鼠模型中个体社会目标的社会记忆机制。

摘要

群居动物，如啮齿动物，能够识别和区分熟悉个体的身份。识别熟悉个体的身份对于发展社会结构（如等级制度、亲属关系和家庭）非常重要。然而，承认社会身份的机制仍不清楚。大多数啮齿动物对社会认可的研究都是基于啮齿动物与新的社会目标互动的倾向，这种现象被称为社会新奇性。然而，检查社会新奇性的行为任务不能根据它们的身份揭示对熟悉的同种动物的识别。这里介绍的是行为任务，允许通过将两只熟悉的小鼠与或没有有效经验相关联来检查 C57BL/6 小鼠的身份识别。受试者与两只小鼠进行了互动，要么没有（中性）或有有价值体验（消极或积极），并熟悉了这些小鼠。负价小鼠与休克相关，而正价小鼠与食物奖励相关。训练后，可以在社会歧视测试中揭示对这些熟悉小鼠身份的识别，这表示为与中性小鼠相比，对正价小鼠的偏好和对负价小鼠的回避。身份识别的行为任务可能有助于探索社会记忆机制和社会认知受损障碍（如自闭症谱系障碍或精神分裂症）的病理生理学。

引言

身份识别，或根据先前的经验识别熟悉个体的能力，对于社会性动物的生存至关重要¹。在啮齿动物中，社会等级、配偶和后代识别、领土防御以及群体的建立和维护是成功识别身份的行为 ^2,3。目前对社会记忆的理解是基于啮齿动物的研究，这些研究植根于识别新同种动物与熟悉同种动物的能力。这些任务对于揭示被认为介导社会记忆的大脑区域很有用，例如海马 CA2⁴ 和腹侧 CA1 区域⁵。然而，此类研究在阐明身份识别的潜在机制方面仍然有限，因为它们仅限于对社会新颖性的分类识别。

身份识别已经通过联想学习范式独立于社会新奇事物得到证明，其中有价值的突出经验与两个（或多个）熟悉的社会目标之一相关联。这些任务基于这样一种观念，即社交互动通常与情感意义有关，其中负面经历会导致预防冲突的行为，而嬉戏或培养性的互动通常是有益的。与互动相关的情感影响称为社会效价。雄性金仓鼠能够区分两个熟悉的同种目标，而其中一个目标之前曾攻击过它们⁶。个体雄性 Wistar 大鼠的识别记忆对于建立社会等级⁷ 也很重要。

最近，通过将单个 C57BL/6 小鼠与或不具有食欲刺激相关联，在神经科学研究中使用最广泛的小鼠品系 C57BL/6 小鼠中检查了身份识别⁸。这种方法使用头部固定的小鼠进行了数百次训练试验，这限制了其用于检查自由移动小鼠的自然行为。在其他研究中，乙醇给药的同种动物的偏好支持 C57BL/6 小鼠的身份识别 ^9,10。尽管如此，物质的管理可能会带来混杂。最后，这些研究中很少有用于检查两性啮齿动物的身份识别。一种适用于雄性和雌性 C57BL/6 小鼠的易于采用的方法是进一步研究身份识别的关键工具。

这里介绍的是可用于雄性和雌性小鼠的身份识别范式。为了独立于新奇事物的影响来研究身份，使用了两个熟悉的社会目标，其中一个目标与突出的情感体验有关，该情感体验被认为为交互行为提供信息。对于消极的社会效价关联，采用了一种类似于社交恐惧条件反射的方法，以引发对特定社会目标的回避¹¹。如果消极的社会效价（例如厌恶性足部休克）与个体相关，则预计与社会目标的互动会减少。相反，如果积极的社会效价（例如食欲奖励）与特定个体相关，则在随后的测试中预计与该小鼠的互动会增加。综上所述，概述的行为任务可以很容易地应用于大多数实验室，用于研究 C57BL/6 小鼠和其他小鼠品系的身份识别。

研究方案

本研究使用雄性成年 C57BL/6 小鼠 （8-10 周龄;体重：18-25 g）。用作社会目标的小鼠是从不同的来源获得的（参见 材料表），以确保它们来自不同的窝并且以前对主题小鼠不熟悉。所有方案均由道格拉斯研究中心的设施动物护理委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会的指导方针（方案编号：DOUG-5935）。

1. 材料（见 图 1）

1. 设置一个大的透明笼子（24 cm x 36 cm x 19.5 cm），作为负社会效价实验中的中性上下文
2. 使用黑壁三角形激波箱（每边长度 = 46 cm;高度 = 29 cm）作为负价上下文。确保电击箱的地板由连接到加扰电网电流发生器的金属栅组成。
3. 在积极的社会效价实验中使用一个大的透明笼子 （26 cm x 47 cm x 21 cm） 作为食物习惯化背景。
4. 使用一个大的黑壁笼子 （24 cm x 36 cm x 19.5 cm） 作为积极社会效价实验中的中性上下文。
5. 使用带有食物端口的大型白壁笼子（24 厘米 x 36 厘米 x 19.5 厘米）作为积极的社会效价环境。作为食品端口，使用穿过墙壁一侧的塑料管（直径 0.5 厘米），并在管子下方放置一个白色塑料盘。
6. 预切的白色画架垫纸用作中性语境（消极和积极社会效价实验中的中性训练）和积极社会效价语境的地板。将 pad 剪得略小于上下文的底面，以防止主题鼠标在纸张下钻洞。更换主题小鼠之间的画架垫。
7. 使用无尘精确颗粒（20 毫克，巧克力味）作为与积极价值社交目标互动时的奖励提示。
8. 在阳性社会效价实验期间，每天使用秤称量受试者小鼠。
9. 使用三腔盒 （81 cm x 23 cm x 23 cm），中间腔室有开口，连接左右腔室，用于社会歧视测试。在会话之间使用可拆卸的腔室门将主题鼠标包含在中间腔室中，以防止作压力。
10. 使用两个相同的矩形有机玻璃外壳 （10 cm x 5 cm x 30 cm） 进行消极和积极的社交效价训练。
11. 使用四个圆形金属丝杯 （8 cm x 8 cm x 10 cm） 进行社会歧视测试。在社会歧视测试的第 1 节期间，保持两个空的金属丝杯。在第 2 节课中，将正或负社交效价训练中使用的社交目标放在其他两个钢丝杯中。
    注意：给金属丝杯贴上标签（例如，使用胶带）以区分相同的金属丝杯。在实验中，在整个实验期间将金属丝杯用于相同的目的。如果必须在金属丝杯内放置不同的社交目标，请用肥皂、水和基于过氧化氢的快速起效消毒剂彻底清洁金属丝杯。
12. 在社会歧视测试时，将两个玻璃瓶放在倒置的金属丝杯顶部，以防止被试小鼠爬上金属丝杯的顶部。
13. 确保训练中的围栏具有非导电材料的地板，用于负社会效价实验。例如，使用塑料或纸板覆盖有电工胶带，以确保负价值的社会目标在训练期间不会受到电击。
14. 使用静音计时器以避免可能干扰动物行为的外部提示。
15. 使用连接到笔记本电脑的高分辨率 （1,080 p/30 fps） 网络摄像头来捕捉训练和社会歧视测试期间的鼠标行为。
16. 使用白噪声发生器，该发生器在上下文中心测量时生成 60 dB 的静态白噪声。
    注意：所有行为程序都应在环境中心测量 60 dB 的静态白噪声进行，以掩盖可能影响动物行为的环境声音。
17. 对所有行为程序使用红光灯。
    注意：这提供了黑暗的环境条件，鼓励小鼠进行探索，并允许在视频记录中可视化动物行为。
18. 用 70% 乙醇清洁实验鼠之间的空围栏和含动物的围栏，这是快干的。使用基于过氧化氢的快速起效消毒剂在受试者小鼠之间进行清洁的训练和测试环境，以消除由于先前受试者小鼠的嗅觉线索而对行为的潜在影响。

2. 行为程序

1. 消极的社会效价
   1. 上下文习惯化
      1. 在实验期间，为实验室配备白噪声和环境红光。
      2. 通过放置一个空的有机玻璃外壳来准备冲击箱，并在中心放置非导电地板。
      3. 将主题鼠标放在冲击箱的一角，让鼠标自由探索 5 分钟。
      4. 将主题鼠标放回其 HomeCage。
      5. 对剩余的小鼠重复休克盒习惯化。
      6. 至少 1 小时后，在中性上下文中重复上下文习惯化程序（步骤 2.1.1.1-2.1.1.5）。
   2. 负价训练
      1. 在适应这两种情况后至少 1 小时开始负效价训练。
      2. 通过将电流设置为 0.3 mA 来准备电击箱。
         注意：推荐的电流设置基于我们使用的电击箱和我们的实验设计（3 个训练日）。可以修改此设置以适应其他实验设计（例如，对于较少训练试验的设计，可能会使用更强的电流）。
      3. 将负价社交目标放在有机玻璃外壳中，并在电击箱中心有一个不导电的底部。
      4. 开始视频录制并将主题鼠标放在 shock box 的一角。
      5. 启动计时器并允许主题鼠标自由探索。
      6. 在 4 和 4.5 分钟时，进行 1 秒长的电击。
         注意：这允许在经历厌恶性电击之前，主题小鼠和社会目标之间有足够的互动时间。
      7. 在 5 分钟后取下主题鼠标并停止录制和计时器。
      8. 将主题鼠标放回其 HomeCage。
      9. 对休克盒进行消毒，并用剩余的受试者小鼠重复负价训练。
   3. 中立训练
      1. 在负价训练后至少 2 小时开始中性训练。
      2. 将中立的社交目标放在围栏中，并在上下文的中心放置一个不导电的底部。
         注意：使用非导电底部来确保否定上下文和中性上下文具有相同的上下文提示。在中立训练中不会产生电击。
      3. 开始视频录制并将主题鼠标放在中性上下文的一角。
      4. 启动计时器并允许主题鼠标自由探索。
      5. 在 5 分钟后取下主题鼠标并停止录制和计时器。
      6. 将主题鼠标放回其 HomeCage。
   4. 训练顺序
      1. 第 1 天：在两种环境习惯化后（步骤 2.1.1），在负价训练（步骤 2.1.2）后 2 小时进行中性训练（步骤 2.1.3）。
      2. 第 2 天：在第 2 天以相反的训练顺序重复训练（步骤 2.1.3 然后是 2.1.2;即，进行中性训练，然后在 2 小时后进行负效价训练）。
      3. 第 3 天：在第 3 天以相反的训练顺序重复训练（步骤 2.1.2 然后是 2.1.3;即负价训练，然后 2 小时后进行中性训练）。
2. 积极的社会效价
   1. 食物匮乏
      1. 在实验期间每天称量每只实验小鼠。
         注意：如果在任何时候，受试者小鼠的体重减轻了 15% 以上，则必须停止食物剥夺，并且应将小鼠从进一步的实验中丢弃。
      2. 在巢笼中为每只主题小鼠提供 1 克常规小鼠食物。
         注：受试者小鼠被分组饲养，每只小鼠提供 1 克食物。例如，如果四只小鼠被分组饲养，则将 4 克食物放入笼子中。
      3. 在积极社会效价实验期间（即，在每天的食物颗粒习惯化、情境习惯化和正效价训练之后），每天重复食物剥夺。
   2. 蔗糖食物颗粒习惯化
      1. 在食物剥夺开始后 12 小时开始食物颗粒习惯化。
      2. 在实验期间，为实验室配备白噪声和环境红光。
      3. 将主题鼠标放在食物习惯上下文的一角。
      4. 启动计时器，在 10 分钟内每分钟输送 1 个蔗糖食物颗粒。
      5. 在 10 分钟时删除主题，然后将鼠标放回其 Homecage。
      6. 记录主题小鼠消耗的蔗糖食物颗粒的数量。
      7. 重复蔗糖食物颗粒习惯化总共 3 天。
         注意：如果小鼠在 3 天后不食用任何蔗糖食物颗粒，则可以增加更多的适应天数。
      8. 从研究中删除在食物颗粒习惯化期间不食用任何蔗糖食物颗粒的受试者。
   3. 上下文习惯化
      1. 蔗糖食物颗粒习惯化后一天（第 4 天），通过在环境的一角放置一个空的有机玻璃外壳来准备正价环境。
      2. 将主题鼠标放在正价上下文的一角，让鼠标自由探索 10 分钟。
      3. 将主题鼠标放回其 HomeCage。
      4. 对剩余的小鼠重复正价上下文习惯化。
      5. 至少 1 小时后，在中性上下文中重复上下文习惯化程序。
   4. 正效价训练
      1. 在适应这两种情况后至少 1 小时开始正效价训练。
      2. 将正价社会目标放在正价上下文中心的外壳中。
      3. 开始视频录制并将主题鼠标放在正价上下文的一角。
      4. 启动计时器，让被摄鼠标自由探索 10 分钟。
      5. 每次与社交目标互动 >2 秒时，通过食物端口运送 1 个蔗糖食物颗粒。交互定义为实验小鼠的鼻子距离有机玻璃外壳外围 <2 cm 的时间段。拍摄对象的头部角度必须朝向外壳。
         注意：可能会出现鼻子戳和嗅探，但对于蔗糖食品颗粒的输送不是必需的。
      6. 在 10 分钟后取下主题鼠标并停止录制和计时器。
      7. 将主题鼠标放回其 HomeCage。
      8. 记录通过食品端口输送的蔗糖食物颗粒的数量和主题小鼠消耗的颗粒数量。
      9. 更换画架垫地板，对阳性环境进行消毒，并用剩余的受试者小鼠重复阳性效价训练。
   5. 中立训练
      1. 在正效价训练后至少 2 小时开始中性训练。
      2. 将中性社交目标放在中性上下文一角的围栏中。
      3. 开始视频录制并将主题鼠标放在中性上下文的一角。
      4. 启动计时器，让被摄鼠标自由探索 10 分钟。
      5. 在 10 分钟后取下主题鼠标并停止录制和计时器。
      6. 将主题鼠标放回其 HomeCage。
      7. 更换画架垫地板，对设备进行消毒，并用剩余的受试者小鼠重复中性训练。
   6. 训练顺序
      1. 第 1-3 天：进行食物颗粒习惯化（步骤 2.2.2）。
      2. 第 4 天：习惯了两种环境后（步骤 2.2.3），首先进行正效价训练（步骤 2.2.4），然后在 2 小时后进行中性训练（步骤 2.2.5）。
      3. 第 5 天：在第 5 天以相反的训练顺序重复训练（步骤 2.2.5 然后是 2.2.4;即，中性训练，然后 2 小时后进行正效价训练）。
3. 社会歧视测试
   1. 为实验室配备白噪声和环境红光。
   2. 将受试者运送到实验室，并允许不受干扰地适应房间至少 1 小时。
      注意：确保社交目标在适应期间保持在实验室外。
   3. 在会话 1 中，将两个空的金属丝杯放在三室社会歧视框的左右腔的对角。
      注意： 将相同的大型重物（例如玻璃瓶）放置在金属丝杯顶部，以确保被摄鼠标不会爬到金属丝杯顶部。
   4. 开始视频录制，将主题鼠标放在中间腔室的中央，然后启动计时器。
      注意：如果可能，请离开房间，以尽量减少实验人员对实验小鼠的干扰。
   5. 8 分钟后，返回测试室，在不接触实验对象鼠标的情况下，使用实验室门将实验对象封闭在中间实验室中。
   6. 将空的金属丝杯换成一组相同但不同的包含社会目标的杯子。
      注意：社会目标是那些用于消极或积极的社会效价训练的目标。
   7. 移除腔室门并启动计时器，因为主题鼠标在会话 2 中探索。
   8. 8 分钟后，停止录制并将主题小鼠和社会目标放回各自的 homecages。
   9. 用 70% 乙醇清洁杯子，并用消毒剂清洁竞技场。
   10. 对剩余的受试者小鼠重复社会歧视测试（步骤 2.3.3-2.3.9）。
   11. 一旦一半的队列完成测试，就平衡金属丝杯的位置。
       注意：社交目标应使用各自的金属丝杯移动，以防止嗅觉线索冲突。
   12. 用肥皂、水和消毒剂清洁所有金属丝杯。用消毒剂清洁三室社会歧视箱。

3. 行为分析

1. 训练
   1. 分析与每个社交目标的交互时间，并对交互较量进行评分。
      注意：分析可以手动评分（动物头部距离围栏外围 <2 cm，头部角度为 180°）或使用自动程序。
   2. 记录在积极的社会效价训练期间消耗的食物颗粒数量，以确保社交行为的变化不是由于消费食物奖励的动机差异造成的。
2. 社会歧视测试
   1. 测量被主题鼠标研究每个杯子的时间量。实验者离开房间后，开始为期 8 分钟的不间断测试。
      注意：分析可以手动评分（动物头部距离线杯外围 <2 cm，头部角度为 180°）或使用自动程序。
   2. 计算成对分析以更好地捕获测试会话中的单个更改。此外，执行双向重复测量 ANOVA（使用 session 和 cup 因子）来检测探索中的会话间差异。

结果

我们使用积极和消极的社会效价任务来评估 C57BL/6 小鼠的身份识别 （图 2）。与蔗糖食物颗粒习惯化的第 1 天 （H1， 图 2B） 相比，大多数小鼠在食物习惯化的最后一天 （H3） 消耗了所有给定的颗粒。在训练期间（T1 和 T2），受试者小鼠通过在不同的环境中分别与它们互动，熟悉了两只 CD1 小鼠：中性 （Neu） 和正价相关小鼠 （PV）。只有在与小鼠 PV 相互作用后，才对受试者小鼠给予食物奖励。在社会歧视任务中，我们发现与中性小鼠相比，训练有素的小鼠更喜欢与 PV 小鼠互动 （* p < 0.05，配对学生 t 检验）。会话 2 交互时间与会话 1 交互的会话间隔比也揭示了对 PV 小鼠的偏好 （* p < 0.05，配对学生 t 检验）。

我们还使用负社会效价任务来检查身份识别（图 2C）。受试者小鼠通过在不同的环境中分别与它们互动，熟悉了两种 CD1 小鼠：Neu 和负价相关小鼠 （NV）。在与鼠标 NV 的交互会话接近结束时进行了两次电击，而在与 Neu 鼠标交互后没有进行电击。我们没有发现受试者小鼠与 Neu 或 NV 小鼠在每个训练日的交互时间存在差异。然而，我们发现在社会歧视测试期间，受试者小鼠减少了与 NV 小鼠的互动时间（* p < 0.05，配对学生 t 检验）。会话 2 交互时间与会话 1 交互的会话间比也揭示了对 Neu 鼠标的偏好（* p < 0.05，配对学生 t 检验）。

图 1：用于身份识别任务的设备。 （A） 负社会效价检验的中性效价上下文。白色的画架垫纸放在上下文的底部。（B） 积极的社会效价背景。请注意框底部中间的食品端口（箭头）。（C） 阳性社会效价测试的中性效价上下文。（D） 食物习惯背景。食品配送口安装在箱子的右侧，如 E （虚线圆圈）和 F （放大）所示。（G） 减震箱。（H） 有机玻璃外壳。（I） 钢丝杯。（J） 用于社会歧视测试的三室社会歧视箱。用于将主题鼠标包含在中央腔室中的可拆卸腔室门以 K （箭头）显示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：身份识别任务的设计和预期结果。 （A） 身份识别任务的积极（上）和消极社会效价版本（下）的示意图。C57BL/6 小鼠被训练每天与中性 （小鼠 Neu） 和价相关的社会目标 （小鼠 PV 或 NV） 相互作用。训练后一天，将受试者小鼠放入三室装置中进行社会歧视测试。我们预计，在正和负社会效价训练后，受试者小鼠将分别表现出对正价 （绿色，小鼠 PV） 和负价小鼠 （红色，小鼠 NV） 的偏好和回避。（B） 来自积极社会效价训练实验的代表性数据。训练受试者小鼠每天与正价小鼠 （小鼠 PV） 和中性小鼠 （小鼠 Neu） 相互作用，持续 2 天。第 2 天交互顺序颠倒。左：直方图显示了小鼠 PV 在习惯化（H1-3 代表习惯化第 1-3 天）和训练（T1-2 代表训练第 1-2 天）期间消耗的蔗糖食物颗粒的百分比。右图：直方图显示在社会歧视测试期间与正价小鼠 PV 的社交互动时间增加。会话间比 （会话 2 交互时间/会话 1 交互时间） 揭示了对正价小鼠 PV 的偏好。* p < 0.05，配对学生 t 检验。（C） 来自负社会效价训练实验的代表性数据。受试者小鼠被训练每天与负价小鼠 （小鼠 NV） 和中性小鼠 （小鼠 Neu） 相互作用，持续 3 天。交互顺序每天颠倒。左：直方图显示了不同训练日与小鼠 Neu 和 NV 的交互时间。右图：直方图显示社交歧视测试期间与负效价小鼠 NV 的社交互动时间减少。会话间隔比揭示了对负价小鼠 NV 的回避。* p < 0.05，配对学生 t 检验。缩写： Neu = 中性;PV = 正价;NV = 负价;H = 习惯化;T = 训练。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

身份识别范式旨在以最少的专用设备和一周内很少的培训课程在实验室中轻松实施。根据可用资源和所需的研究问题，可以使用其他价值经验。例如，来自攻击性社交目标的攻击后负价身份识别首先在金仓鼠中被描述，并在我们的模型中适应了小鼠 ^6,12。

价值身份识别范式可以在社会记忆领域内有更广泛的应用。这些任务不仅可以用于进一步研究社会记忆或社会效价机制，还可以帮助研究已知具有社会识别障碍的疾病模型。身份识别障碍是精神分裂症 13,14,15 和自闭症谱系障碍 16,17,18 等疾病的社会行为缺陷的基础，据估计，三分之一的自闭症成年人难以面对个人身份识别¹⁹。例如，Shank3 敲除小鼠和 Df（16）A^+/- 是已知表现出社交认知受损的自闭症谱系障碍和精神分裂症小鼠模型 20,21,22。我们的新范式可以概括社会记忆缺陷，并用于描述疾病模型的特征以及识别改善社会行为缺陷的作或治疗。与社会认可相比，无生命的物体也可以被研究为替代社会目标，以进一步解析支持物体的机制¹²。

图 1 中使用的社会目标是同性 CD1 品系小鼠，但我们使用相同品系 C57BL/6 靶标实现了相当的效价身份识别。因此，我们开发了一种易于采用的方法，可用于进一步研究脑部疾病动物模型中的社会价加工、社会身份和这些社会认知功能的缺陷。

身份识别范式着眼于特定个体的记忆。在设计实验时，必须注意确保训练和测试过程完全不同，并且唯一保持不变的线索是社会目标的身份。例如，进行训练和测试的房间、容纳社交目标的围栏以及与训练和测试环境相关的线索都必须不同。

四个金属丝杯必须彼此相同，但要尽可能不同于有机玻璃外壳。金属丝杯和外壳在材料（例如，有机玻璃与金属）、形状（例如，矩形与圆形）和颜色（例如，透明与玫瑰金）方面必须不同。这样做是为了确保在测试期间通知探索行为的唯一线索是社交目标的身份。

环境习惯化在训练的第 1 天进行。这样做是为了鼓励在训练期间探索社会目标，而不是研究对象小鼠已经知道的背景。此外，建议在有效训练和中性训练之间至少等待 2 小时。在训练之间为受试者小鼠提供时间被认为可以减少泛化，因为在时间上分配得更近的经验更有可能被联系起来²³。出于同样的原因，在随后的日子里，训练会重复进行，但会按顺序进行平衡。这种重复被认为鼓励了经验与相应的社会目标的进一步联系。理想情况下，训练之间的更多时间可以进一步让受试者小鼠学会将社交目标与它们各自的价值经验联系起来。出于实际目的，等待期决定为 2 小时，因为它允许在 8-12 只小鼠的队列中在 1 天内进行中性和有效训练。例如，训练 12 只小鼠可能需要大约 2 小时，此时首先接受训练的受试者小鼠将准备好开始下一次训练。当然，增加等待时间可能会提高受试者小鼠的表现，但对实验者来说会更耗时。

受试者小鼠和社会目标应在行为训练开始前至少 7 天到达动物设施，以尽量减少运输压力的影响。社会目标应该是单身的，因为来自猫嗅的嗅觉线索可能会损害身份识别。相同的两个社交目标可用于最多 12 只受试者小鼠的队列。重要的是，在主题小鼠之间的每个清洁和设置期间，社会目标必须返回它们的巢箱。将社会目标送回它们的巢箱很重要，因为长时间被关在围栏内可能会改变它们的行为，进而影响实验小鼠互动的决定。

实验小鼠和社会目标可以是相同或不同菌株的同种动物。如果使用相同品系的社会目标，那么至关重要的是它们与主题小鼠不属于同一窝，并且社会目标必须彼此不熟悉。这可以通过从不同的动物供应商处订购主题小鼠和社会目标或订购年龄略有不同的动物（即 8 周龄的受试者小鼠和 7 周龄的社会目标）来确保。如果需要耳标程序，则应在行为训练开始前至少 24 小时进行。这是为了最大限度地减少外部压力源对受试者小鼠行为的影响。对于所有行为训练和测试，建议一次使用一只受试者小鼠。虽然同时训练和测试多个受试者小鼠可能会节省时间，但它也会增加实验室中的嗅觉线索，这可能会影响身份识别的编码或回忆。因此，我们建议使用 8-12 只受试者小鼠的队列。对于积极的社会效价实验，建议每天在训练前处理动物，以尽量减少处理压力，这可能会阻止新奇的食物消费。还建议在习惯化前将每只小鼠 2-3 个蔗糖食物颗粒放入家笼中 3 天，以促进习惯化过程。

尽管提供的数据是手动评分的，但存在用户友好的自动化行为分析选项，可用于在培训和测试视频中更有效地对社交互动进行评分。例如，DeepLabCut 是一种采用用户训练的神经网络对动物位置进行无标记注释的软件，并且可以针对满足调查行为的帧的精确识别进行优化²⁴。

可以采用进一步的对照实验来验证已经成功实现了身份识别协议¹²。颠倒训练顺序应继续引发身份识别，并确认结果不是由于有效训练和中性训练的顺序。训练也可以如前所述进行，但可以使用中性和新的社交目标进行测试，其中与新目标的互动增加表明受试者小鼠对中性目标具有社会记忆，并且已经认识到它是熟悉的。同样，可以用两只新的实验小鼠进行测试，以确认回避或接近行为实际上分别特定于消极和积极评价的社会目标。虽然目前尚未测试同一主题小鼠是否可以同时接受消极和积极的社会效价训练，但我们相信，如果实验者能够获得多个社会目标菌株或训练环境，这是可能的。将相同的社会目标菌株用于正和负效价实验可能会使菌株与特定效价的关联复杂化。如果可能，使用不同的社会目标菌株可能会鼓励探索并避免将积极和消极体验一概而论。同样，重复使用相同的训练环境将增加相反价值的经验之间的泛化，并且会因使用不同的培训环境而最小化。如果实验时间表允许，还建议将正价和负价实验分开几周。

如果难以建立身份识别协议，我们会针对我们遇到的常见问题提出解决方案。群居受试者小鼠可能起到灭绝训练的作用，因为与社会目标相关的效价在正常的 cagemate 相互作用后消失²⁵，但这是必要的，因为社会孤立会损害社会记忆并改变社会行为^26,27。事实上，我们发现单个住房不会在雄性小鼠中引起身份识别。然而，如果动物正在从立体定向手术中恢复或具有可能对脱离敏感的颅内植入物，则可能需要单个住房。在这种情况下，我们已经成功地将小鼠配对饲养在大笼子中，由多孔隔板隔开，并在这种条件下复制了身份识别¹²。

对于积极的社会效价任务，小鼠通常会对食用新型蔗糖颗粒表现出犹豫。为了解决这个问题，增加食物剥夺时间或通过在习惯化会议前 2-3 天将一些颗粒放入家笼中来让小鼠熟悉颗粒是有帮助的。在大多数小鼠不食用任何食物颗粒的某些情况下，增加习惯化的次数也可能有所帮助。尽管我们注意到雄性小鼠在食物颗粒习惯化期间通常比雌性小鼠吃得更少，但这并不影响它们识别积极价值的社会目标的能力。

最后，可以修改身份识别任务的参数，以降低或增强任务的难度。例如，为了揭示生物因素对身份识别的微妙影响，可以减少训练时间和训练次数，以增加任务的难度。

我们在该协议中提出的行为任务简单、易于设置，并且适用于雄性和雌性小鼠研究身份识别。在这些任务中灵活使用食欲或厌恶刺激也允许检查社会效价在身份识别中的作用。这些任务将有助于研究健康小鼠身份识别的生物学机制，或表现出社交障碍的疾病相关小鼠模型中这些机制的缺陷。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol
Black-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			neutral context, positive social valence experiment
C57BL/6 mice	Charles River, Jackson Laboratory		Social targets from Jackson Laboratory
Dustless precision pellets	BioServ	F05301	20 mg, chocolate flavor
Electric tape
Glass bottles (2)
hydrogen peroxide-based disinfectant
Plastic or cardboard			Non-conductive material for enclosure floor
Rectangular plexiglass enclosures (2, 10 cm x 5 cm x 30 cm)			Identical
Shock box (triangular, length of each side = 46 cm; height = 29 cm)
Silent timer
Single Output Scrambled Animal Shocker	Lafayette Instrument	HSCK100AP
three-chamber box (81 cm x 23 cm x 23 cm), with openings in the middle chamber that connect to the left and the right chambers			social discrimination testing
Transparent cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			Negative social valence
Transparent cage (26 cm x 47 cm x 21 cm)			Food habituation (positive social valence)
Webcam	Logitech	C920x
Weighing scale
white easel pad papers			floor of the neutral context
White noise generator			60 dB
White, plastic dish
White-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm) with a 1 cm diameter plastic tube as food port			positive social valence context
Wire cups (circular, four, 8 cm x 8 cm x 10 cm)