Compiti comportamentali per l'esame del riconoscimento dell'identità nei topi

Riepilogo

Accoppiando esperienze con valenza negativa o positiva con obiettivi sociali individuali, abbiamo sviluppato compiti comportamentali per esaminare il riconoscimento dell'identità dei topi C57BL/6. Questi compiti consentono lo studio dei meccanismi di memoria sociale di bersagli sociali individuali in modelli murini sani e correlati alla malattia con cognizione sociale compromessa.

Abstract

Gli animali sociali, come i roditori, sono in grado di riconoscere e distinguere l'identità di individui familiari. Riconoscere l'identità di individui familiari è importante per lo sviluppo di strutture sociali come la gerarchia, la parentela e la famiglia. Tuttavia, i meccanismi alla base del riconoscimento dell'identità sociale rimangono poco chiari. La maggior parte degli studi sui roditori sul riconoscimento sociale si basano sulla propensione dei roditori a interagire con un nuovo bersaglio sociale, un fenomeno noto come novità sociale. Tuttavia, i compiti comportamentali per esaminare la novità sociale non possono rivelare il riconoscimento di conspecifici familiari in base alle loro identità. Vengono presentati qui compiti comportamentali che consentono l'esame del riconoscimento dell'identità nei topi C57BL/6 associando due topi familiari con o senza un'esperienza di valenza. I soggetti hanno avuto interazioni con due topi senza (neutro) o con un'esperienza di valenza (negativa o positiva) e hanno acquisito familiarità con questi topi. Il topo con valenza negativa era associato a shock, mentre il topo con valenza positiva era associato a una ricompensa in cibo. Dopo l'addestramento, il riconoscimento dell'identità di questi topi familiari può essere rivelato in un test di discriminazione sociale, che è rappresentato come la preferenza per il topo con valenza positiva e l'evitamento del topo con valenza negativa rispetto al topo neutro. I compiti comportamentali per il riconoscimento dell'identità potrebbero essere utili per sondare i meccanismi di memoria sociale e la fisiopatologia dei disturbi con cognizione sociale compromessa, come il disturbo dello spettro autistico o la schizofrenia.

Introduzione

Il riconoscimento dell'identità, o la capacità di identificare individui familiari sulla base di esperienze precedenti, è fondamentale per la sopravvivenza degli animali sociali¹. Nei roditori, la gerarchia sociale, il riconoscimento del compagno e della prole, la difesa territoriale e la creazione e il mantenimento di gruppi sono comportamenti che incombono sul successo del riconoscimento dell'identità ^2,3. L'attuale comprensione della memoria sociale si basa su studi sui roditori radicati nella capacità di identificare conspecifici nuovi rispetto a quelli familiari. Questi compiti sono stati utili per scoprire le regioni del cervello che si pensa medino la memoria sociale, come le regioni CA2⁴ dell'ippocampo e le regioni CA1 ventrali⁵. Tuttavia, tali studi rimangono limitati nel chiarire i meccanismi alla base del riconoscimento dell'identità in quanto sono limitati al riconoscimento categoriale della novità sociale.

Il riconoscimento dell'identità è stato dimostrato indipendentemente dalla novità sociale attraverso paradigmi di apprendimento associativo in cui le esperienze salienti valenzate sono associate a uno dei due (o più) obiettivi sociali familiari. Questi compiti si basano sull'idea che le interazioni sociali sono spesso legate a un significato emotivo, in cui le esperienze negative si traducono in comportamenti che prevengono i conflitti, mentre le interazioni ludiche o di cura sono generalmente gratificanti. L'affetto emotivo legato alle interazioni è chiamato valenza sociale. I criceti dorati maschi erano in grado di discriminare tra due bersagli conspecifici familiari quando uno li aveva precedentemente attaccati⁶. Anche la memoria di riconoscimento dei singoli ratti Wistar maschi è stata importante per l'istituzione del rango sociale⁷.

Recentemente, il riconoscimento dell'identità è stato esaminato nei topi C57BL/6, il ceppo di topo più utilizzato nella ricerca neuroscientifica, associando singoli topi C57BL/6 con o senza stimoli appetitivi⁸. Questo approccio ha utilizzato topi con la testa fissa per sottoporsi a centinaia di prove di addestramento, che ne hanno limitato l'uso per esaminare i comportamenti naturalistici nei topi che si muovevano liberamente. In altri studi, il riconoscimento dell'identità dei topi C57BL/6 è stato supportato dalla preferenza dei conspecifici somministrati con etanolo ^9,10. Tuttavia, la somministrazione di sostanze potrebbe creare confusione. Infine, pochi di questi studi sono stati utilizzati per esaminare il riconoscimento dell'identità nei roditori di entrambi i sessi. Un metodo facilmente adottabile e applicabile sia ai topi maschi che alle femmine C57BL/6 è uno strumento cruciale per approfondire lo studio del riconoscimento dell'identità.

Qui vengono presentati i paradigmi di riconoscimento dell'identità che possono essere impiegati sia nei topi maschi che nelle femmine. Per studiare l'identità indipendentemente dagli effetti della novità, vengono utilizzati due bersagli sociali familiari, e uno di questi bersagli è associato a un'esperienza emotiva saliente che si presume informi il comportamento di interazione. Per l'associazione di valenza sociale negativa, è stato adattato un approccio simile al condizionamento della paura sociale per suscitare l'evitamento verso uno specifico obiettivo sociale¹¹. Se una valenza sociale negativa, come uno shock avversivo del piede, è associata a un individuo, ci si aspetterebbe una diminuzione dell'interazione con il bersaglio sociale. Al contrario, se una valenza sociale positiva, come una ricompensa appetitiva, è associata a un individuo specifico, si prevede un aumento dell'interazione con questo topo nei test successivi. Nel loro insieme, i compiti comportamentali delineati possono essere facilmente applicati nella maggior parte dei laboratori per lo studio del riconoscimento dell'identità nei topi C57BL/6 e in altri ceppi di topi.

Protocollo

In questo studio sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6 (8-10 settimane di età; peso corporeo: 18-25 g). I topi utilizzati come bersagli sociali sono stati ottenuti da una fonte diversa (vedi Tabella dei materiali) per garantire che provenissero da cucciolate diverse e precedentemente sconosciuti ai topi soggetti. Tutti i protocolli sono stati approvati dal Facility Animal Care Committee presso il Douglas Research Centre e hanno seguito le linee guida del Canadian Council on Animal Care (protocollo n.: DOUG-5935).

1. Materiali (vedi Figura 1)

1. Allestisci una grande gabbia trasparente (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) che sia il contesto neutro nell'esperimento della valenza sociale negativa
2. Utilizzare una scatola di shock triangolare con pareti nere (lunghezza di ciascun lato = 46 cm; altezza = 29 cm) come contesto di valenza negativa. Assicurati che il pavimento della scatola di scossa sia costituito da griglie metalliche collegate a un generatore di corrente di rete criptata.
3. Utilizzare una grande gabbia trasparente (26 cm x 47 cm x 21 cm) come contesto di assuefazione alimentare nell'esperimento di valenza sociale positiva.
4. Usa una grande gabbia con pareti nere (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) come contesto neutro nell'esperimento di valenza sociale positiva.
5. Usa una grande gabbia con pareti bianche (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) con una porta per il cibo come contesto di valenza sociale positiva. Come porta per il cibo, utilizzare un tubo di plastica (0,5 cm di diametro) che passi attraverso un lato del muro e posizionare un piatto di plastica bianca sotto il tubo.
6. Fogli da cavalletto bianchi pretagliati da utilizzare come pavimento del contesto neutro (formazione neutra in esperimenti di valenza sociale sia negativa che positiva) e contesti di valenza sociale positiva. Taglia il pad leggermente più piccolo della superficie inferiore del contesto per evitare che il mouse del soggetto si nasconda sotto la carta. Sostituire i cuscinetti del cavalletto tra i mouse del soggetto.
7. Usa pellet di precisione senza polvere (20 mg, gusto cioccolato) come spunto di ricompensa quando interagisci con il target sociale con valenza positiva.
8. Utilizzare una bilancia per pesare quotidianamente i topi soggetti per tutta la durata degli esperimenti di valenza sociale positiva.
9. Utilizzare una scatola a tre camere (81 cm x 23 cm x 23 cm), con aperture nella camera centrale che si collegano alle camere sinistra e destra, per i test di discriminazione sociale. Utilizzare le porte della camera rimovibili per contenere il mouse del soggetto nella camera centrale tra una sessione e l'altra, evitando lo stress da manipolazione.
10. Utilizzare due recinzioni rettangolari in plexiglass identiche (10 cm x 5 cm x 30 cm) sia per l'allenamento alla valenza sociale negativa che a quella positiva.
11. Utilizzare quattro tazze di filo circolare (8 cm x 8 cm x 10 cm) per i test di discriminazione sociale. Tenere vuote due tazze di filo metallico durante la sessione 1 del test di discriminazione sociale. Nella sessione 2, posizionare i bersagli sociali utilizzati nell'allenamento di valenza sociale positiva o negativa nelle altre due coppette metalliche.
    NOTA: Etichettare le coppe dei fili (ad esempio, usando del nastro adesivo) per distinguere tra coppe dei fili identiche. All'interno di un esperimento, utilizzare le coppe di filo per lo stesso scopo per tutta la durata dell'esperimento. Se all'interno della tazza di filo deve essere posizionato un obiettivo sociale diverso, pulire accuratamente la tazza di filo metallico con sapone, acqua e un disinfettante ad azione rapida a base di perossido di idrogeno.
12. Posizionare due bottiglie di vetro sopra le tazze di filo rovesciate durante i test di discriminazione sociale per evitare che i topi soggetti si arrampichi sopra le tazze di filo.
13. Assicurarsi che i recinti in formazione abbiano pavimenti di materiale non conduttivo per esperimenti di valenza sociale negativa. Ad esempio, utilizzare plastica o cartone ricoperti di nastro isolante per garantire che il bersaglio sociale con valenza negativa non riceva scosse durante l'allenamento.
14. Usa un timer silenzioso per evitare segnali esterni che potrebbero interferire con i comportamenti degli animali.
15. Utilizza una webcam ad alta risoluzione (1.080 p/30 fps) collegata a un computer portatile per acquisire il comportamento del mouse durante l'allenamento e il test di discriminazione sociale.
16. Utilizza un generatore di rumore bianco che generi rumore bianco statico a 60 dB misurato al centro del contesto.
    NOTA: Tutte le procedure comportamentali devono essere condotte con rumore bianco statico a 60 dB misurato al centro del contesto per mascherare i suoni ambientali che possono influenzare il comportamento degli animali.
17. Utilizzare lampade a luce rossa per tutte le procedure comportamentali.
    NOTA: Ciò fornisce condizioni ambientali buie, che incoraggiano l'esplorazione nei topi e consentono la visualizzazione del comportamento animale nelle registrazioni video.
18. Pulisci i recinti, sia vuoti che contenenti animali, tra i topi soggetti con etanolo al 70%, che si asciuga rapidamente. Pulisci i contesti di addestramento e test tra i topi soggetti con un disinfettante ad azione rapida a base di perossido di idrogeno per eliminare le potenziali influenze sul comportamento dovute a segnali olfattivi di topi soggetti precedenti.

2. Procedure comportamentali

1. Valenza sociale negativa
   1. Assuefazione al contesto
      1. Dotare la stanza sperimentale di rumore bianco e luce rossa ambientale per tutta la durata dell'esperimento.
      2. Preparare la scatola di scossa posizionando un involucro di plexiglass vuoto con un pavimento non conduttivo al centro.
      3. Posiziona il mouse soggetto in un angolo della scatola dello shock e lascia che il mouse esplori liberamente per 5 minuti.
      4. Rimetti il mouse in questione nella sua gabbia.
      5. Ripeti l'assuefazione alla scatola di shock con i topi rimanenti.
      6. Almeno 1 ora dopo, ripetere la procedura di assuefazione al contesto (passaggi 2.1.1.1-2.1.1.5) nel contesto neutro.
   2. Allenamento a valenza negativa
      1. Iniziare l'allenamento con valenza negativa almeno 1 ora dopo l'assuefazione ad entrambi i contesti.
      2. Preparare la scatola dell'ammortizzatore impostando la corrente su 0,3 mA.
         NOTA: L'impostazione della corrente consigliata si basa sulla scatola dello shock che abbiamo utilizzato e sul nostro progetto sperimentale (3 giorni di formazione). Questa impostazione può essere modificata per adattarsi ad altri disegni sperimentali (ad esempio, una corrente più forte può essere utilizzata con progetti di meno prove di addestramento).
      3. Posizionare il bersaglio sociale con valenza negativa nell'involucro di plexiglass con un fondo non conduttivo al centro della scatola di shock.
      4. Avvia la registrazione video e posiziona il mouse in un angolo della scatola di shock.
      5. Avvia il timer e consenti al mouse di esplorare liberamente.
      6. A 4 e 4,5 minuti, erogare una scossa elettrica lunga 1 s.
         NOTA: Ciò consente un tempo di interazione sufficiente tra il mouse soggetto e il target sociale prima di sperimentare shock avversivi.
      7. Rimuovere il mouse del soggetto a 5 minuti e interrompere la registrazione e il timer.
      8. Rimetti il mouse in questione nella sua gabbia.
      9. Disinfettare la scatola di scossa e ripetere l'allenamento di valenza negativa con i restanti topi soggetti.
   3. Formazione neutra
      1. Iniziare l'allenamento neutro almeno 2 ore dopo l'allenamento a valenza negativa.
      2. Posizionare il bersaglio sociale neutro nell'involucro con un fondo non conduttivo al centro del contesto.
         NOTA: Un fondo non conduttivo viene utilizzato per garantire che i contesti negativo e neutro abbiano spunti di contesto identici. Nell'allenamento neutro non viene erogato alcuno shock.
      3. Avvia la registrazione video e posiziona il mouse del soggetto in un angolo del contesto neutro.
      4. Avvia il timer e consenti al mouse di esplorare liberamente.
      5. Rimuovere il mouse del soggetto a 5 minuti e interrompere la registrazione e il timer.
      6. Rimetti il mouse in questione nella sua gabbia.
   4. Ordine di formazione
      1. Giorno 1: Dopo l'assuefazione di entrambi i contesti (passaggio 2.1.1), eseguire l'allenamento neutro (passaggio 2.1.3) 2 ore dopo l'allenamento a valenza negativa (passaggio 2.1.2).
      2. Giorno 2: Ripetere l'allenamento il giorno 2 con un ordine di allenamento invertito (passaggi 2.1.3 e poi 2.1.2; cioè, eseguire l'allenamento neutro e poi l'allenamento con valenza negativa 2 ore dopo).
      3. Giorno 3: Ripetere l'allenamento il giorno 3 con un ordine di allenamento invertito (passaggi 2.1.2 poi 2.1.3; cioè, allenamento a valenza negativa seguito da allenamento neutro 2 ore dopo).
2. Valenza sociale positiva
   1. Privazione alimentare
      1. Pesare ogni topo soggetto ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento.
         NOTA: Se in qualsiasi momento, un topo soggetto perde più del 15% del suo peso corporeo originale, la privazione del cibo deve essere interrotta e il topo deve essere scartato da ulteriori esperimenti.
      2. Fornire 1 g di cibo normale per topi per ogni topo soggetto nella gabbia domestica.
         NOTA: I topi soggetti sono alloggiati in gruppo con 1 g di cibo disponibile per topo. Ad esempio, se quattro topi sono alloggiati in gruppo, 4 g di cibo vengono messi nella gabbia domestica.
      3. Ripetere la privazione alimentare ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento di valenza sociale positiva (cioè, dopo ogni giorno di assuefazione al pellet di cibo, assuefazione al contesto e addestramento alla valenza positiva).
   2. Assuefazione al pellet alimentare di saccarosio
      1. Iniziare l'assuefazione al pellet di cibo 12 ore dopo l'inizio della privazione alimentare.
      2. Dotare la stanza sperimentale di rumore bianco e luce rossa ambientale per tutta la durata dell'esperimento.
      3. Posiziona il mouse soggetto in un angolo del contesto di assuefazione alimentare.
      4. Avvia il timer ed eroga 1 pellet di saccarosio/min nel corso di 10 minuti.
      5. Rimuovi il soggetto dopo 10 minuti e riporta il mouse nella sua gabbia.
      6. Registrare il numero di pellet alimentari di saccarosio consumati dal topo soggetto.
      7. Ripetere l'assuefazione al pellet alimentare di saccarosio per un totale di 3 giorni.
         NOTA: È possibile aggiungere più giorni di assuefazione se i topi non consumano pellet di saccarosio dopo 3 giorni.
      8. Rimuovere dallo studio i soggetti che non consumano pellet di saccarosio durante l'assuefazione al pellet alimentare.
   3. Assuefazione al contesto
      1. Un giorno dopo l'assuefazione al pellet alimentare di saccarosio (giorno 4), preparare il contesto di valenza positiva posizionando un involucro di plexiglass vuoto in un angolo del contesto.
      2. Posiziona il mouse soggetto in un angolo del contesto di valenza positiva e lascia che il mouse esplori liberamente per 10 minuti.
      3. Rimetti il mouse in questione nella sua gabbia.
      4. Ripetere l'assuefazione al contesto di valenza positiva con i topi rimanenti.
      5. Almeno 1 ora dopo, ripetere la procedura di assuefazione al contesto nel contesto neutro.
   4. Allenamento della valenza positiva
      1. Iniziare l'allenamento alla valenza positiva almeno 1 ora dopo l'assuefazione ad entrambi i contesti.
      2. Collocare il target sociale a valenza positiva nel recinto al centro del contesto di valenza positiva.
      3. Avvia la registrazione video e posiziona il mouse soggetto in un angolo del contesto di valenza positiva.
      4. Avvia il timer e consenti al mouse di esplorare liberamente per 10 minuti.
      5. Ad ogni incontro di interazione con l'obiettivo sociale che è di >2 s, consegna 1 pellet di cibo al saccarosio attraverso la porta del cibo. L'interazione è definita come periodi in cui il naso del topo soggetto si trova a <2 cm di distanza dalla periferia dell'involucro di plexiglass. L'angolo della testa del soggetto deve essere posizionato verso l'involucro.
         NOTA: Possono verificarsi colpi e sniffing del naso, ma non sono necessari per l'erogazione di pellet di saccarosio.
      6. Rimuovere il mouse del soggetto a 10 minuti e interrompere la registrazione e il timer.
      7. Rimetti il mouse in questione nella sua gabbia.
      8. Registrare il numero di pellet alimentari di saccarosio consegnati tramite la porta alimentare e il numero di pellet consumati dal topo in questione.
      9. Sostituisci il pavimento del cavalletto, disinfetta il contesto positivo e ripeti l'allenamento della valenza positiva con i restanti topi soggetti.
   5. Formazione neutra
      1. Iniziare l'allenamento neutro almeno 2 ore dopo l'allenamento a valenza positiva.
      2. Posizionare l'obiettivo sociale neutro nell'involucro in un angolo del contesto neutro.
      3. Avvia la registrazione video e posiziona il mouse del soggetto in un angolo del contesto neutro.
      4. Avvia il timer e consenti al mouse di esplorare liberamente per 10 minuti.
      5. Rimuovere il mouse del soggetto a 10 minuti e interrompere la registrazione e il timer.
      6. Rimetti il mouse in questione nella sua gabbia.
      7. Sostituire il pavimento del cavalletto, disinfettare l'attrezzatura e ripetere l'allenamento neutro con i restanti mouse soggetti.
   6. Ordine di formazione
      1. Giorni 1-3: Eseguire l'assuefazione al pellet di cibo (passaggio 2.2.2).
      2. Giorno 4: Dopo l'assuefazione di entrambi i contesti (passaggio 2.2.3), eseguire prima l'allenamento di valenza positiva (passaggio 2.2.4) seguito da un allenamento neutro (passaggio 2.2.5) 2 ore dopo.
      3. Giorno 5: Ripetere l'allenamento il giorno 5 con un ordine di allenamento invertito (passaggi 2.2.5 e 2.2.4; cioè, allenamento neutro seguito da un allenamento con valenza positiva 2 ore dopo).
3. Test di discriminazione sociale
   1. Equipaggia la sala sperimentale con rumore bianco e luce rossa ambientale.
   2. Trasportare i soggetti nella sala sperimentale e lasciare che la stanza si abitui indisturbata per almeno 1 ora.
      NOTA: Assicurarsi che gli obiettivi sociali rimangano al di fuori della stanza sperimentale durante il periodo di assuefazione.
   3. Nella sessione 1, posiziona due tazze di filo vuote negli angoli opposti delle camere sinistra e destra della scatola di discriminazione sociale a tre camere.
      NOTA: Oggetti identici di grandi dimensioni (ad es. bottiglie di vetro) sono posizionati sopra le coppe metalliche per garantire che il mouse in questione non si arrampichi sopra la coppa metallica.
   4. Avvia la registrazione video, posiziona il mouse del soggetto al centro della camera centrale e avvia il timer.
      NOTA: Se possibile, uscire dalla stanza per ridurre al minimo l'interferenza dello sperimentatore sui mouse soggetti.
   5. Dopo 8 minuti, torna alla stanza di prova e senza toccare il mouse del soggetto, usa le porte della camera per racchiudere il soggetto nella camera centrale.
   6. Sostituisci le tazze di filo vuote con un set di tazze identico ma diverso contenente gli obiettivi sociali.
      NOTA: I bersagli sociali sono quelli utilizzati nell'addestramento alla valenza sociale negativa o positiva.
   7. Rimuovi le porte della camera e avvia il timer mentre il mouse del soggetto esplora nella sessione 2.
   8. Dopo 8 minuti, interrompi la registrazione e riporta il mouse soggetto e gli obiettivi sociali nelle rispettive gabbie.
   9. Pulisci le tazze con etanolo al 70% e pulisci l'arena con disinfettante.
   10. Ripetere i test di discriminazione sociale (passaggi 2.3.3-2.3.9) con i restanti topi soggetti.
   11. Una volta che metà della coorte ha completato il test, controbilanciare la posizione della coppa del filo.
       NOTA: Gli obiettivi sociali dovrebbero essere spostati con le rispettive coppe metalliche per evitare segnali olfattivi contrastanti.
   12. Pulisci tutte le coppe metalliche con sapone, acqua e disinfettante. Pulisci la scatola di discriminazione sociale a tre camere con disinfettante.

3. Analisi comportamentale

1. Formazione
   1. Analizza il tempo di interazione con ciascun target sociale e assegna un punteggio al numero di periodi di interazione.
      NOTA: L'analisi può essere valutata manualmente (testa dell'animale a <2 cm di distanza dalla periferia del recinto e angolo della testa di 180°) o utilizzando un programma automatizzato.
   2. Registrare il numero di pellet alimentari consumati durante l'addestramento a valenza sociale positiva per garantire che i cambiamenti nei comportamenti sociali non siano dovuti a differenze nella motivazione a consumare ricompense alimentari.
2. Test di discriminazione sociale
   1. Misura la quantità di tempo in cui il topo soggetto indaga su ogni tazza. Una durata ininterrotta del test di 8 minuti inizia una volta che lo sperimentatore lascia la stanza.
      NOTA: L'analisi può essere valutata manualmente (testa dell'animale a <2 cm di distanza dalla periferia della coppa del filo e angolo della testa di 180°) o utilizzando un programma automatizzato.
   2. Calcola le analisi a coppie per acquisire meglio le singole modifiche all'interno delle sessioni di test. Inoltre, eseguire l'ANOVA a misure ripetute a due vie (con i fattori di sessione e coppa) per rilevare le differenze tra le sessioni nell'esplorazione.

Risultati

Abbiamo utilizzato i compiti di valenza sociale positiva e negativa per valutare il riconoscimento dell'identità nei topi C57BL/6 (Figura 2). Rispetto al giorno 1 di assuefazione al pellet alimentare di saccarosio (H1, Figura 2B), la maggior parte dei topi ha consumato tutti i pellet somministrati entro l'ultimo giorno di assuefazione al cibo (H3). Durante le sessioni di allenamento (T1 e T2), i topi soggetti hanno familiarizzato con due topi CD1: neutro (Neu) e un topo positivo associato alla valenza (PV) interagendo con loro separatamente in contesti diversi. Le ricompense alimentari sono state date ai topi soggetti solo dopo l'interazione con il PV del topo. Durante il compito di discriminazione sociale, abbiamo scoperto che i topi addestrati preferivano interagire con il topo PV rispetto al topo neutro (* p < 0,05, t-test di Student accoppiato). Il rapporto di intersessione del tempo di interazione della sessione 2 rispetto all'interazione della sessione 1 ha anche rivelato una preferenza verso il topo PV (* p < 0,05, t-test di Student accoppiato).

Abbiamo anche utilizzato il compito di valenza sociale negativa per esaminare il riconoscimento dell'identità (Figura 2C). I topi soggetti hanno familiarizzato con due topi CD1: Neu e topo associato alla valenza negativa (NV) interagendo con loro separatamente in contesti diversi. Due scosse elettriche sono state somministrate verso la fine della sessione di interazione con il mouse NV, mentre nessuna scossa è stata data dopo l'interazione con il mouse Neu. Non abbiamo riscontrato differenze nei tempi di interazione tra i topi soggetti e i topi Neu o NV in ogni giorno di addestramento. Tuttavia, abbiamo scoperto che i topi soggetti hanno ridotto il tempo di interazione con il topo NV durante il test di discriminazione sociale (* p < 0,05, t-test di Student accoppiato). Il rapporto di intersessione del tempo di interazione della sessione 2 rispetto all'interazione della sessione 1 ha anche rivelato una preferenza verso il topo Neu (* p < 0,05, test t di Student accoppiato).

Figura 1: Apparato per compiti di riconoscimento dell'identità. (A) Contesto di valenza neutro per test di valenza sociale negativi. Un blocco di carta da cavalletto bianco è posizionato nella parte inferiore del contesto. (B) Contesto di valenza sociale positiva. Notare la porta per il cibo (freccia) nella parte inferiore centrale della scatola. (C) Contesto di valenza neutro per test di valenza sociale positivi. (D) Contesto di assuefazione alimentare. Una porta per la consegna del cibo è installata sul lato destro della scatola, come mostrato in E (cerchio tratteggiato) e F (ingrandito). (G) Scatola d'urto. (H) Involucro in plexiglass. (I) Tazza di filo. (J) Casella tricamerale per la discriminazione sociale per il test di discriminazione sociale. Gli sportelli della camera rimovibili per contenere il mouse soggetto nella camera centrale sono mostrati in K (punte di freccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Progettazione e risultati attesi delle attività di riconoscimento dell'identità. (A) Diagrammi schematici di versioni positive (in alto) e negative di valenza sociale di compiti di riconoscimento dell'identità (in basso). I topi C57BL/6 sono stati addestrati a interagire quotidianamente con i bersagli sociali neutri (Neu di topo) e associati alla valenza (PV o NV di topo). Un giorno dopo l'addestramento, i topi soggetti sono stati messi in un apparecchio a tre camere per il test di discriminazione sociale. Ci aspettiamo che dopo l'addestramento alla valenza sociale positivo e negativo, i topi soggetti mostreranno preferenza ed evitamento rispettivamente verso i topi con valenza positiva (verde, PV del topo) e con valenza negativa (rosso, NV del topo). (B) Dati rappresentativi di un esperimento di addestramento alla valenza sociale positiva. I topi soggetti sono stati addestrati a interagire quotidianamente per 2 giorni con il topo con valenza positiva (PV del topo) e con il topo neutro (Neu). L'ordine di interazione è stato invertito il giorno 2. A sinistra: gli istogrammi mostrano la percentuale di pellet alimentari di saccarosio consumati durante l'assuefazione (H1-3 che rappresenta i giorni di assuefazione 1-3) e l'allenamento (T1-2 che rappresenta i giorni di allenamento 1-2) con PV di topo. A destra: gli istogrammi mostrano l'aumento del tempo di interazione sociale con il PV del topo con valenza positiva durante il test di discriminazione sociale. Il rapporto di intersessione (tempo di interazione sessione 2/tempo di interazione sessione 1) ha rivelato la preferenza per il PV di topo con valenza positiva. * p < 0,05, test t di Student accoppiato. (C) Dati rappresentativi da un esperimento di addestramento alla valenza sociale negativa. I topi soggetti sono stati addestrati a interagire quotidianamente per 3 giorni con il topo con valenza negativa (topo NV) e con il topo neutro (Neu). L'ordine di interazione veniva invertito quotidianamente. A sinistra: Gli istogrammi mostrano il tempo di interazione con il topo Neu e NV durante i diversi giorni di formazione. A destra: gli istogrammi mostrano la diminuzione del tempo di interazione sociale con il NV del topo con valenza negativa durante il test di discriminazione sociale. Il rapporto di intersessione ha rivelato l'evitamento del NV di topo con valenza negativa. * p < 0,05, test t di Student accoppiato. Abbreviazioni: Neu = neutro; PV = valenza positiva; NV = valenza negativa; H = assuefazione; T = formazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I paradigmi di riconoscimento dell'identità sono stati progettati per essere facilmente implementati in laboratori con attrezzature specializzate minime e poche sessioni di formazione nell'arco di una settimana. Esperienze alternative di valenza possono essere utilizzate a seconda delle risorse disponibili e della domanda di ricerca desiderata. Ad esempio, il riconoscimento dell'identità con valenza negativa a seguito di attacchi da parte di un bersaglio sociale aggressivo è stato descritto per la prima volta nei criceti dorati e adattato ai topi nel nostro modello ^6,12.

I paradigmi di riconoscimento dell'identità valenzata possono avere applicazioni più ampie nel campo della memoria sociale. Non solo questi compiti possono essere utilizzati per studiare ulteriormente la memoria sociale o i meccanismi di valenza sociale, ma possono anche aiutare nello studio di modelli di malattia noti per avere menomazioni del riconoscimento sociale. I disturbi nel riconoscimento dell'identità sono alla base dei deficit del comportamento sociale in disturbi come la schizofrenia^13,14,15 e il disturbo dello spettro autistico 16,17,18, dove è stato stimato che un terzo degli adulti con autismo ha difficoltà ad affrontare il riconoscimento dell'identità individuale ¹⁹. Ad esempio, i topi knockout Shank3 e Df(16)A^+/- sono modelli murini di disturbo dello spettro autistico e schizofrenia noti per mostrare una cognizione sociale compromessa 20,21,22. I nostri nuovi paradigmi possono ricapitolare i deficit di memoria sociale ed essere adottati per la caratterizzazione di modelli di malattia e l'identificazione di manipolazioni o trattamenti che migliorano i deficit di comportamento sociale. Gli oggetti inanimati possono anche essere studiati in sostituzione degli obiettivi sociali per analizzare ulteriormente i meccanismi che supportano l'oggetto, rispetto al riconoscimento sociale¹².

I bersagli sociali utilizzati nella Figura 1 sono topi dello stesso sesso del ceppo CD1, ma abbiamo ottenuto un riconoscimento dell'identità con valenza comparabile utilizzando bersagli C57BL/6 dello stesso ceppo. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo facilmente adottabile, che può essere impiegato per ulteriori studi sull'elaborazione della valenza sociale, sull'identità sociale e sui deficit di queste funzioni cognitive sociali in modelli animali di malattie cerebrali.

I paradigmi di riconoscimento dell'identità esaminano la memoria di individui specifici. Nel progettare gli esperimenti, bisogna fare attenzione a garantire che le sessioni di formazione e di test siano completamente diverse e che l'unico indizio mantenuto costante sia l'identità dei target sociali. Ad esempio, le stanze in cui vengono condotti la formazione e i test, gli involucri che contengono gli obiettivi sociali e gli spunti associati ai contesti di formazione e test devono essere tutti diversi.

Le quattro coppette in filo metallico devono essere identiche tra loro, ma il più possibile diverse dalle custodie in plexiglass. Le coppe e gli involucri in filo metallico devono essere diversi in termini di materiale (ad esempio, plexiglass o metallo), forma (ad esempio, rettangolare o circolare) e colore (ad esempio, trasparente o oro rosa). Questo viene fatto per garantire che l'unico indizio che informa il comportamento esplorativo durante i test sia l'identità dei target sociali.

L'assuefazione al contesto viene condotta il giorno 1 di formazione. Questo viene fatto per favorire l'esplorazione di target sociali durante l'addestramento piuttosto che del contesto, che sarà già noto al topo soggetto. Inoltre, si consigliano almeno 2 ore di attesa tra le sessioni di allenamento valenzate e neutre. Si ritiene che fornire ai topi soggetti il tempo tra le sessioni di formazione riduca la generalizzazione, poiché è più probabile che le esperienze assegnate più vicine nel tempo siano collegate²³. Per lo stesso motivo, l'allenamento viene ripetuto, ma controbilanciato nell'ordine, nei giorni successivi. La ripetizione è pensata per favorire l'ulteriore associazione dell'esperienza con il rispettivo target sociale. Idealmente, più tempo tra le sessioni di allenamento può ulteriormente consentire ai topi soggetti di imparare ad associare l'obiettivo sociale con la rispettiva esperienza di valenza. Ai fini pratici, il periodo di attesa è stato deciso in 2 ore in quanto consentiva lo svolgimento di sessioni di allenamento sia neutre che valenzate in 1 giorno in una coorte di 8-12 topi. Ad esempio, l'addestramento di 12 topi può richiedere circa 2 ore, a quel punto il topo soggetto che è stato addestrato per primo sarebbe pronto per iniziare la sessione di allenamento successiva. Naturalmente, l'aumento del periodo di attesa può migliorare le prestazioni dei topi soggetti, ma richiederà più tempo per lo sperimentatore.

I topi soggetti e gli obiettivi sociali dovrebbero arrivare alla struttura per animali almeno 7 giorni prima dell'inizio dell'addestramento comportamentale per ridurre al minimo l'influenza dello stress da trasporto. Gli obiettivi sociali dovrebbero essere alloggiati in un unico alloggio, poiché i segnali olfattivi dei cagemati possono compromettere il riconoscimento dell'identità. Gli stessi due bersagli sociali possono essere utilizzati per una coorte di un massimo di 12 topi soggetti. È importante sottolineare che gli obiettivi sociali devono essere restituiti alla loro gabbia durante ogni periodo di pulizia e configurazione tra i topi soggetti. È importante riportare i bersagli sociali nelle loro gabbie domestiche poiché il confinamento prolungato nei recinti può alterare il loro comportamento e, a sua volta, influenzare la decisione dei topi soggetti di interagire.

I topi soggetti e i bersagli sociali possono essere conspecifici dello stesso ceppo o di ceppi diversi. Se vengono utilizzati bersagli sociali dello stesso ceppo, è fondamentale che non appartengano alla stessa cucciolata dei topi soggetti e che i bersagli sociali non siano familiari tra loro. Ciò può essere garantito ordinando topi soggetti e obiettivi sociali da diversi fornitori di animali o ordinando animali di età leggermente diverse (ad esempio, topi soggetti di 8 settimane e obiettivi sociali di 7 settimane). Se sono necessarie procedure di marcatura auricolare, queste devono essere condotte almeno 24 ore prima dell'inizio della formazione comportamentale. Questo per ridurre al minimo l'influenza di fattori di stress esterni sul comportamento del mouse del soggetto. Per tutta la formazione e i test comportamentali, si consiglia di lavorare con un mouse soggetto alla volta. Sebbene l'addestramento e il test simultanei di più topi soggetti possano far risparmiare tempo, aumentano anche i segnali olfattivi nella stanza sperimentale che possono influenzare la codifica o il richiamo del riconoscimento dell'identità. Pertanto, consigliamo coorti di 8-12 topi soggetti. Per esperimenti di valenza sociale positiva, si raccomanda di maneggiare gli animali quotidianamente prima dell'addestramento per ridurre al minimo lo stress da manipolazione, che può scoraggiare il consumo di nuovi alimenti. Si consiglia inoltre di posizionare 2-3 pellet di cibo saccarosio per topo nella gabbia domestica per 3 giorni prima dell'assuefazione per facilitare il processo di assuefazione.

Sebbene i dati presentati siano stati valutati manualmente, esistono opzioni intuitive e automatizzate per l'analisi comportamentale che possono essere applicate per un punteggio più efficiente delle interazioni sociali nei video di formazione e test. Ad esempio, DeepLabCut è un software che impiega reti neurali addestrate dall'utente per l'annotazione senza marcatori della posizione degli animali e può essere ottimizzato per l'identificazione precisa di frame che soddisfano il comportamento investigativo²⁴.

Ulteriori esperimenti di controllo possono essere impiegati per verificare che siano stati raggiunti protocolli di riconoscimento dell'identità di successo¹². L'inversione dell'ordine di addestramento dovrebbe continuare a suscitare il riconoscimento dell'identità e confermare che i risultati non sono dovuti all'ordine di addestramento valenzato e neutro. L'addestramento può anche essere condotto come descritto, ma i test possono avvenire con il bersaglio neutro e un nuovo bersaglio sociale, dove una maggiore interazione con il nuovo bersaglio suggerirebbe che i topi soggetti hanno una memoria sociale per il bersaglio neutro e hanno riconosciuto che è familiare. Allo stesso modo, è possibile eseguire test con due nuovi topi soggetti per confermare che i comportamenti di evitamento o di approccio sono, in effetti, specifici per i bersagli sociali con valenza negativa e positiva, rispettivamente. Sebbene non sia attualmente stato testato se lo stesso topo soggetto possa sottoporsi a un training di valenza sociale sia negativo che positivo, riteniamo che sia possibile se gli sperimentatori hanno accesso a più ceppi di bersagli sociali o contesti di addestramento. L'uso dello stesso ceppo di bersagli sociali per esperimenti di valenza positiva e negativa può complicare l'associazione di un ceppo con una particolare valenza. Se possibile, l'utilizzo di diversi ceppi di target sociali può incoraggiare l'esplorazione ed evitare la generalizzazione tra esperienze positive e negative. Allo stesso modo, il riutilizzo degli stessi contesti formativi aumenterebbe la generalizzazione tra esperienze con valenza opposta e sarebbe minimizzato con l'uso di contesti distinti per la formazione. Se la tempistica sperimentale lo consente, si raccomanda anche di separare gli esperimenti di valenza positiva e negativa di alcune settimane.

Nel caso in cui ci siano difficoltà nello stabilire i protocolli di riconoscimento dell'identità, suggeriamo soluzioni ai problemi più comuni che abbiamo affrontato. I topi soggetti che alloggiano in gruppo possono funzionare come addestramento all'estinzione poiché la valenza associata a un bersaglio sociale si estingue dopo la normale interazione di cagemate²⁵, ma è necessaria poiché l'isolamento sociale compromette la memoria sociale e altera il comportamento sociale^26,27. In effetti, abbiamo scoperto che l'alloggiamento singolo non suscitava il riconoscimento dell'identità nei topi maschi. Tuttavia, può essere necessaria una stabulazione singola se gli animali si stanno riprendendo da interventi chirurgici stereotassici o hanno impianti intracranici che possono essere sensibili al distacco. In tali casi, abbiamo alloggiato con successo topi in coppia in grandi gabbie, separati da un divisorio perforato, e abbiamo replicato il riconoscimento dell'identità in questa condizione¹².

Per il compito di valenza sociale positiva, è comune che i topi mostrino esitazione a consumare nuovi pellet di saccarosio. Per risolvere questo problema, è utile aumentare il tempo di privazione del cibo o familiarizzare i topi con i pellet mettendo alcuni pellet nella loro gabbia domestica per 2-3 giorni prima della sessione di assuefazione. In alcune situazioni in cui la maggior parte dei topi non consuma pellet di cibo, può anche essere utile aumentare il numero di sessioni di assuefazione. Sebbene abbiamo notato che i topi maschi generalmente mangiavano meno durante l'assuefazione ai pellet di cibo rispetto ai topi femmine, ciò non influisce sulla loro capacità di riconoscere il bersaglio sociale con valenza positiva.

Infine, i parametri delle attività di riconoscimento dell'identità possono essere modificati per ridurre o migliorare la difficoltà dell'attività. Ad esempio, per rivelare il sottile impatto dei fattori biologici sul riconoscimento dell'identità, il tempo di formazione e il numero di sessioni di formazione possono essere ridotti per aumentare la difficoltà del compito.

I compiti comportamentali che abbiamo presentato in questo protocollo sono semplici, facilmente configurabili e adattabili a topi maschi e femmine per studiare il riconoscimento dell'identità. L'uso flessibile di stimoli appetitivi o avversivi in questi compiti consente anche di esaminare il ruolo della valenza sociale nel riconoscimento dell'identità. Questi compiti saranno utili per studiare i meccanismi biologici di riconoscimento dell'identità in topi sani, o deficit di questi meccanismi in modelli murini correlati a malattie che mostrano compromissione sociale.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol
Black-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			neutral context, positive social valence experiment
C57BL/6 mice	Charles River, Jackson Laboratory		Social targets from Jackson Laboratory
Dustless precision pellets	BioServ	F05301	20 mg, chocolate flavor
Electric tape
Glass bottles (2)
hydrogen peroxide-based disinfectant
Plastic or cardboard			Non-conductive material for enclosure floor
Rectangular plexiglass enclosures (2, 10 cm x 5 cm x 30 cm)			Identical
Shock box (triangular, length of each side = 46 cm; height = 29 cm)
Silent timer
Single Output Scrambled Animal Shocker	Lafayette Instrument	HSCK100AP
three-chamber box (81 cm x 23 cm x 23 cm), with openings in the middle chamber that connect to the left and the right chambers			social discrimination testing
Transparent cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			Negative social valence
Transparent cage (26 cm x 47 cm x 21 cm)			Food habituation (positive social valence)
Webcam	Logitech	C920x
Weighing scale
white easel pad papers			floor of the neutral context
White noise generator			60 dB
White, plastic dish
White-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm) with a 1 cm diameter plastic tube as food port			positive social valence context
Wire cups (circular, four, 8 cm x 8 cm x 10 cm)