Tareas conductuales para examinar el reconocimiento de identidad en ratones

Resumen

Al emparejar las experiencias de valencia negativa o positiva con objetivos sociales individuales, desarrollamos tareas de comportamiento para examinar el reconocimiento de identidad de ratones C57BL/6. Estas tareas permiten el estudio de los mecanismos de la memoria social de los objetivos sociales individuales en modelos de ratón sanos y relacionados con enfermedades con cognición social deteriorada.

Resumen

Los animales sociales, al igual que los roedores, son capaces de reconocer y diferenciar la identidad de individuos conocidos. Reconocer la identidad de las personas conocidas es importante para desarrollar estructuras sociales como la jerarquía, el parentesco y la familia. Sin embargo, los mecanismos que subyacen al reconocimiento de la identidad social siguen sin estar claros. La mayoría de los estudios de reconocimiento social en roedores se basan en la propensión de los roedores a interactuar con un nuevo objetivo social, un fenómeno conocido como novedad social. Sin embargo, las tareas conductuales para examinar la novedad social no pueden revelar el reconocimiento de congéneres familiares en función de sus identidades. Aquí se presentan tareas conductuales que permiten examinar el reconocimiento de identidad en ratones C57BL/6 mediante la asociación de dos ratones familiares con o sin una experiencia valenciana. Los sujetos tuvieron interacciones con dos ratones, ya sea sin (neutros) o con una experiencia validada (negativa o positiva) y se familiarizaron con estos ratones. El ratón con valencia negativa se asoció con choques, mientras que el ratón con valencia positiva se asoció con una recompensa de comida. Después del entrenamiento, el reconocimiento de la identidad de estos ratones familiares se puede revelar en una prueba de discriminación social, que se representa como la preferencia por el ratón con valencia positiva y la evitación del ratón con valencia negativa en comparación con el ratón neutro. Las tareas conductuales para el reconocimiento de identidad podrían ser útiles para investigar los mecanismos de la memoria social y la fisiopatología de los trastornos con deterioro de la cognición social, como el trastorno del espectro autista o la esquizofrenia.

Introducción

El reconocimiento de la identidad, o la capacidad de identificar a individuos conocidos basándose en experiencias previas, es fundamental para la supervivencia^{de los animales} sociales. En los roedores, la jerarquía social, el reconocimiento de parejas y crías, la defensa territorial y el establecimiento y mantenimiento de grupos son comportamientos que dependen del reconocimiento exitoso de la identidad ^2,3. La comprensión actual de la memoria social se basa en estudios con roedores basados en la capacidad de identificar congéneres nuevos frente a congéneres familiares. Estas tareas han sido útiles para descubrir regiones cerebrales que se cree que median la memoria social, como las regiones CA2⁴ del hipocampo y CA1 ventral⁵. Sin embargo, estos estudios siguen siendo limitados a la hora de dilucidar los mecanismos que subyacen al reconocimiento de la identidad, ya que se limitan al reconocimiento categórico de la novedad social.

El reconocimiento de la identidad se ha demostrado independientemente de la novedad social a través de paradigmas de aprendizaje asociativo en los que las experiencias sobresalientes valenciadas se asocian con uno de dos (o más) objetivos sociales familiares. Estas tareas se basan en la noción de que las interacciones sociales a menudo están vinculadas al significado emocional, donde las experiencias negativas resultan en comportamientos que evitan conflictos, mientras que las interacciones lúdicas o enriquecedoras son generalmente gratificantes. El afecto emocional asociado a las interacciones se denomina valencia social. Los hámsters dorados machos eran capaces de discriminar entre dos objetivos conespecíficos familiares cuando uno de ellos los había atacado previamente⁶. La memoria de reconocimiento de ratas Wistar macho individuales también fue importante para el establecimiento del rango social⁷.

Recientemente, se ha examinado el reconocimiento de identidad en ratones C57BL/6, la cepa de ratón más utilizada en la investigación en neurociencia, mediante la asociación de ratones C57BL/6 individuales con o sin estímulos apetitivos⁸. Este enfoque utilizó ratones con la cabeza fija para someterlos a cientos de ensayos de entrenamiento, lo que limitó su uso para examinar comportamientos naturalistas en ratones que se movían libremente. En otros estudios, el reconocimiento de identidad de los ratones C57BL/6 fue apoyado por la preferencia de los congéneres administrados con etanol ^9,10. No obstante, la administración de sustancias podría introducir factores de confusión. Por último, pocos de estos estudios se han utilizado para examinar el reconocimiento de identidad en roedores de ambos sexos. Un método fácilmente adoptable que es aplicable tanto a ratones machos como hembras C57BL/6 es una herramienta crucial para avanzar en el estudio del reconocimiento de identidad.

Aquí se presentan paradigmas de reconocimiento de identidad que se pueden emplear tanto en ratones machos como hembras. Para estudiar la identidad independientemente de los efectos de la novedad, se utilizan dos objetivos sociales familiares, y uno de estos objetivos se asocia con una experiencia emocional destacada que se supone que informa el comportamiento de interacción. Para la asociación de valencia social negativa, se adaptó un enfoque similar al condicionamiento del miedo social para provocar la evitación hacia un objetivo social específico¹¹. Si una valencia social negativa, como una descarga aversiva en el pie, se asocia con un individuo, se esperaría una disminución de la interacción con el objetivo social. Por el contrario, si una valencia social positiva, como una recompensa apetitiva, se asocia con un individuo específico, se anticiparía una mayor interacción con este ratón en pruebas posteriores. En conjunto, las tareas conductuales descritas se pueden aplicar fácilmente en la mayoría de los laboratorios para el estudio del reconocimiento de identidad en ratones C57BL/6 y otras cepas de ratones.

Protocolo

En este estudio se utilizaron ratones machos adultos C57BL/6 (8-10 semanas de edad; peso corporal: 18-25 g). Los ratones utilizados como objetivos sociales se obtuvieron de una fuente diferente (ver Tabla de Materiales) para asegurarse de que pertenecían a diferentes camadas y que no estaban familiarizados con los ratones en cuestión. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de las Instalaciones del Centro de Investigación Douglas y siguieron las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (n.º de protocolo: DOUG-5935).

1. Materiales (ver Figura 1)

1. Coloca una jaula grande y transparente (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) para que sea el contexto neutro en el experimento de valencia social negativa
2. Utilice una caja de choque triangular de paredes negras (longitud de cada lado = 46 cm; altura = 29 cm) como contexto de valencia negativa. Asegúrese de que el piso de la caja de choque esté formado por rejillas metálicas conectadas a un generador de corriente de red codificada.
3. Utilice una jaula transparente grande (26 cm x 47 cm x 21 cm) como contexto de habituación alimentaria en el experimento de valencia social positiva.
4. Utiliza una jaula grande de paredes negras (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) como contexto neutro en el experimento de valencia social positiva.
5. Utilice una jaula grande de paredes blancas (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) con un puerto de comida como contexto de valencia social positiva. Como puerto de comida, use un tubo de plástico (0,5 cm de diámetro) que pase a través de un lado de la pared y coloque un plato de plástico blanco debajo del tubo.
6. Papeles de caballete blanco precortados para usar como suelo del contexto neutro (entrenamiento neutral en experimentos de valencia social tanto negativa como positiva) y contextos de valencia social positiva. Corta la almohadilla un poco más pequeña que la superficie inferior del contexto para evitar que el ratón del sujeto se esconda debajo del papel. Reemplace las almohadillas de caballete entre los ratones sujetos.
7. Utilice gránulos de precisión sin polvo (20 mg, sabor chocolate) como señal de recompensa al interactuar con el objetivo social con valencia positiva.
8. Utilice una báscula para pesar ratones sujetos diariamente durante la duración de los experimentos de valencia social positiva.
9. Utilice una caja de tres cámaras (81 cm x 23 cm x 23 cm), con aberturas en la cámara central que se conecten a las cámaras izquierda y derecha, para las pruebas de discriminación social. Utilice las puertas de la cámara extraíbles para contener el ratón en cuestión en la cámara central entre sesiones, evitando el estrés de la manipulación.
10. Utilice dos recintos rectangulares de plexiglás idénticos (10 cm x 5 cm x 30 cm) para el entrenamiento de la valencia social negativa y positiva.
11. Use cuatro vasos de alambre circulares (8 cm x 8 cm x 10 cm) para las pruebas de discriminación social. Mantenga dos vasos de alambre vacíos durante la sesión 1 de la prueba de discriminación social. En la sesión 2, coloque los objetivos sociales utilizados en el entrenamiento de valencia social positiva o negativa en las otras dos tazas de alambre.
    NOTA: Etiquete los vasos de alambre (por ejemplo, con cinta adhesiva) para diferenciar entre vasos de alambre idénticos. Dentro de un experimento, use las tazas de alambre para el mismo propósito durante toda la duración del experimento. Si se debe colocar un objetivo social diferente dentro del vaso de alambre, límpialo a fondo con jabón, agua y un desinfectante de acción rápida a base de peróxido de hidrógeno.
12. Coloque dos botellas de vidrio encima de los vasos de alambre volcados durante la prueba de discriminación social para evitar que los ratones sujetos se suban a los vasos de alambre.
13. Asegúrese de que los recintos en formación tengan suelos de un material no conductor para experimentos de valencia social negativa. Por ejemplo, use plástico o cartón cubierto con cinta aislante para asegurarse de que el objetivo social con valencia negativa no reciba descargas durante el entrenamiento.
14. Use un temporizador silencioso para evitar señales externas que puedan intervenir con los comportamientos de los animales.
15. Utilice una cámara web de alta resolución (1.080 p/30 fps) conectada a una computadora portátil para capturar el comportamiento del mouse durante el entrenamiento y la prueba de discriminación social.
16. Utilice un generador de ruido blanco que genere ruido blanco estático a 60 dB medido en el centro del contexto.
    NOTA: Todos los procedimientos conductuales deben realizarse con ruido blanco estático a 60 dB medido en el centro del contexto para enmascarar los sonidos ambientales que puedan afectar el comportamiento animal.
17. Use lámparas de luz roja para todos los procedimientos conductuales.
    NOTA: Esto proporciona condiciones ambientales oscuras, que fomentan la exploración en ratones y permiten la visualización del comportamiento animal en grabaciones de video.
18. Limpie los recintos, tanto vacíos como los que contienen animales, entre los ratones sujetos con etanol al 70%, que es de secado rápido. Limpiar los contextos de entrenamiento y prueba entre ratones sujetos con un desinfectante de acción rápida a base de peróxido de hidrógeno para eliminar las posibles influencias en el comportamiento que se deben a las señales olfativas de ratones sujetos anteriores.

2. Procedimientos conductuales

1. Valencia social negativa
   1. Habituación al contexto
      1. Equipe la sala experimental con ruido blanco y luz roja ambiental durante la duración del experimento.
      2. Prepare la caja de choque colocando un recinto de plexiglás vacío con un piso no conductor en el centro.
      3. Coloque el ratón en cuestión en una esquina de la caja de choque y permita que el ratón explore libremente durante 5 minutos.
      4. Devuelve el ratón en cuestión a su jaula de inicio.
      5. Repita la habituación de la caja de choque con los ratones restantes.
      6. Al menos 1 h después, repita el procedimiento de habituación al contexto (pasos 2.1.1.1-2.1.1.5) en el contexto neutro.
   2. Entrenamiento de valencia negativa
      1. Comience el entrenamiento de valencia negativa al menos 1 h después de la habituación a ambos contextos.
      2. Prepare la caja de choque ajustando la corriente a 0,3 mA.
         NOTA: La configuración de corriente recomendada se basa en la caja de choque que utilizamos y nuestro diseño experimental (3 días de entrenamiento). Esta configuración se puede modificar para que se ajuste a otros diseños experimentales (por ejemplo, se puede usar una corriente más fuerte con diseños de menos ensayos de entrenamiento).
      3. Coloque el objetivo social con valencia negativa en el recinto de plexiglás con un fondo no conductor en el centro de la caja de choque.
      4. Inicie la grabación de video y coloque el mouse del sujeto en una esquina de la caja de choque.
      5. Inicie el temporizador y permita que el mouse del sujeto explore libremente.
      6. A los 4 y 4,5 min, administre una descarga eléctrica de 1 s de largo.
         NOTA: Esto permite suficiente tiempo de interacción entre el ratón sujeto y el objetivo social antes de experimentar choques aversivos.
      7. Retire el mouse del sujeto a los 5 minutos y detenga la grabación y el temporizador.
      8. Devuelve el ratón en cuestión a su jaula de inicio.
      9. Desinfecte la caja de choque y repita el entrenamiento de valencia negativa con los ratones sujetos restantes.
   3. Entrenamiento neutral
      1. Comience el entrenamiento neutro al menos 2 h después del entrenamiento de valencia negativa.
      2. Coloque el objetivo social neutral en el recinto con un fondo no conductor en el centro del contexto.
         NOTA: Se utiliza un fondo no conductor para garantizar que los contextos negativo y neutro tengan señales de contexto idénticas. No se produce ningún choque en el entrenamiento neutral.
      3. Inicie la grabación de video y coloque el mouse del sujeto en una esquina del contexto neutro.
      4. Inicie el temporizador y permita que el mouse del sujeto explore libremente.
      5. Retire el mouse del sujeto a los 5 minutos y detenga la grabación y el temporizador.
      6. Devuelve el ratón en cuestión a su jaula de inicio.
   4. Orden de formación
      1. Día 1: Después de la habituación de ambos contextos (paso 2.1.1), realice el entrenamiento neutro (paso 2.1.3) 2 h después del entrenamiento de valencia negativa (paso 2.1.2).
      2. Día 2: Repita el entrenamiento el día 2 con un orden de entrenamiento inverso (pasos 2.1.3 y luego 2.1.2; es decir, realice un entrenamiento neutro y luego, un entrenamiento de valencia negativa 2 h después).
      3. Día 3: Repita el entrenamiento el día 3 con un orden de entrenamiento invertido (pasos 2.1.2 y luego 2.1.3; es decir, entrenamiento de valencia negativa seguido de entrenamiento neutro 2 horas después).
2. Valencia social positiva
   1. Privación de alimentos
      1. Pesa diariamente a cada ratón sujeto durante la duración del experimento.
         NOTA: Si en algún momento, un ratón en cuestión pierde más del 15% de su peso corporal original, se debe detener la privación de alimentos y el ratón debe descartarse de otros experimentos.
      2. Proporcione 1 g de la comida regular para ratones por ratón sujeto en la jaula de casa.
         NOTA: Los ratones en cuestión se alojan en grupo con 1 g de alimento disponible por ratón. Por ejemplo, si se alojan cuatro ratones en grupo, se colocan 4 g de comida en la jaula doméstica.
      3. Repita la privación de alimentos diariamente durante la duración del experimento de valencia social positiva (es decir, después de cada día de habituación de los gránulos de comida, habituación al contexto y entrenamiento de valencia positiva).
   2. Habituación de los pellets de comida con sacarosa
      1. Comience la habituación de los pellets de comida 12 h después del comienzo de la privación de alimentos.
      2. Equipe la sala experimental con ruido blanco y luz roja ambiental durante la duración del experimento.
      3. Coloque el ratón sujeto en una esquina del contexto de habituación a la comida.
      4. Inicie el temporizador y administre 1 pellet de alimento de sacarosa/min en el transcurso de 10 minutos.
      5. Retire el sujeto a los 10 minutos y devuelva el mouse a su jaula de inicio.
      6. Registre el número de gránulos de alimento de sacarosa consumidos por el ratón en cuestión.
      7. Repita la habituación de los pellets de comida con sacarosa durante un total de 3 días.
         NOTA: Se pueden agregar más días de habituación si los ratones no consumen ningún pellet de alimento de sacarosa después de 3 días.
      8. Retire del estudio a los sujetos que no consumen gránulos de comida con sacarosa durante la habituación de los gránulos de comida.
   3. Habituación al contexto
      1. Un día después de la habituación de los pellets de comida con sacarosa (día 4), prepare el contexto de valencia positiva colocando un recinto de plexiglás vacío en una esquina del contexto.
      2. Coloque el ratón sujeto en una esquina del contexto de valencia positivo y permita que el ratón explore libremente durante 10 minutos.
      3. Devuelve el ratón en cuestión a su jaula de inicio.
      4. Repita la habituación del contexto de valencia positiva con los ratones restantes.
      5. Al menos 1 h más tarde, repita el procedimiento de habituación al contexto en el contexto neutro.
   4. Entrenamiento de valencia positiva
      1. Comience el entrenamiento de valencia positiva al menos 1 h después de la habituación a ambos contextos.
      2. Coloque el objetivo social con valencia positiva en el recinto en el centro del contexto de valencia positiva.
      3. Inicie la grabación de vídeo y coloque el sujeto del ratón en una esquina del contexto de valencia positivo.
      4. Inicie el temporizador y permita que el mouse del sujeto explore libremente durante 10 minutos.
      5. En cada episodio de interacción con el objetivo social que es de > 2 s, entregue 1 pellet de comida de sacarosa a través del puerto de comida. La interacción se define como períodos en los que la nariz del ratón sujeto está a <2 cm de distancia de la periferia del recinto de plexiglás. El ángulo de la cabeza del sujeto debe colocarse hacia el recinto.
         NOTA: Es posible que se pinche la nariz y se huela, pero no son necesarios para la entrega de gránulos de comida con sacarosa.
      6. Retire el mouse del sujeto a los 10 minutos y detenga la grabación y el temporizador.
      7. Devuelve el ratón en cuestión a su jaula de inicio.
      8. Registre el número de gránulos de comida de sacarosa entregados a través del puerto de alimentos y el número de gránulos consumidos por el ratón en cuestión.
      9. Reemplace el piso de la almohadilla de caballete, desinfecte el contexto positivo y repita el entrenamiento de valencia positiva con los ratones sujetos restantes.
   5. Entrenamiento neutral
      1. Comience el entrenamiento neutral al menos 2 horas después del entrenamiento de valencia positiva.
      2. Coloque el objetivo social neutral en el recinto en una esquina del contexto neutral.
      3. Inicie la grabación de video y coloque el mouse del sujeto en una esquina del contexto neutro.
      4. Inicie el temporizador y permita que el mouse del sujeto explore libremente durante 10 minutos.
      5. Retire el mouse del sujeto a los 10 minutos y detenga la grabación y el temporizador.
      6. Devuelve el ratón en cuestión a su jaula de inicio.
      7. Vuelva a colocar el piso de la almohadilla de caballete, desinfecte el equipo y repita el entrenamiento neutro con los ratones sujetos restantes.
   6. Orden de formación
      1. Días 1-3: Realizar la habituación de los pellets de comida (paso 2.2.2).
      2. Día 4: Después de la habituación de ambos contextos (paso 2.2.3), realice primero un entrenamiento de valencia positiva (paso 2.2.4) seguido de un entrenamiento neutro (paso 2.2.5) 2 h después.
      3. Día 5: Repita el entrenamiento el día 5 con un orden de entrenamiento invertido (pasos 2.2.5 y luego 2.2.4; es decir, entrenamiento neutro seguido de entrenamiento de valencia positiva 2 h después).
3. Test de discriminación social
   1. Equipa la sala experimental con ruido blanco y luz roja ambiental.
   2. Transportar a los sujetos a la sala de experimentación y permitir que se habitúen a la sala sin molestias durante al menos 1 hora.
      NOTA: Asegúrese de que los objetivos sociales permanezcan fuera de la sala experimental durante el período de habituación.
   3. En la sesión 1, coloque dos vasos de alambre vacíos en las esquinas opuestas de las cámaras izquierda y derecha de la caja de discriminación social de tres cámaras.
      NOTA: Se colocan objetos grandes y pesados idénticos (por ejemplo, botellas de vidrio) encima de los vasos de alambre para garantizar que el ratón en cuestión no se suba encima del vaso de alambre.
   4. Inicie la grabación de video, coloque el mouse del sujeto en el centro de la cámara central e inicie el temporizador.
      NOTA: Si es posible, salga de la habitación para minimizar la interferencia del experimentador en los ratones en cuestión.
   5. Después de 8 minutos, regrese a la sala de pruebas y, sin tocar el mouse del sujeto, use las puertas de la cámara para encerrar al sujeto en la cámara del medio.
   6. Reemplace los vasos de alambre vacíos por un conjunto de vasos idénticos pero diferentes que contengan los objetivos sociales.
      NOTA: Los objetivos sociales son los que se utilizan en el entrenamiento de valencia social negativa o positiva.
   7. Retire las puertas de la cámara e inicie el temporizador mientras el ratón explora en la sesión 2.
   8. Después de 8 minutos, detenga la grabación y devuelva el ratón sujeto y los objetivos sociales a sus respectivas jaulas domésticas.
   9. Limpie los vasos con etanol al 70% y limpie la arena con desinfectante.
   10. Repita la prueba de discriminación social (pasos 2.3.3-2.3.9) con el resto de los ratones sujetos.
   11. Una vez que la mitad de la cohorte haya completado la prueba, contrarreste la ubicación de la copa de alambre.
       NOTA: Los objetivos sociales deben moverse con sus respectivas tazas de alambre para evitar señales olfativas contradictorias.
   12. Limpie todos los vasos de alambre con jabón, agua y desinfectante. Limpie la caja de discriminación social de tres cámaras con desinfectante.

3. Análisis conductual

1. Adiestramiento
   1. Analice el tiempo de interacción con cada objetivo social y puntúe el número de episodios de interacción.
      NOTA: El análisis se puede marcar manualmente (cabeza del animal a <2 cm de distancia de la periferia del recinto y ángulo de cabeza de 180°) o utilizando un programa automatizado.
   2. Registre el número de gránulos de comida consumidos durante el entrenamiento de valencia social positiva para asegurarse de que los cambios en los comportamientos sociales no se deban a diferencias en la motivación para consumir recompensas de alimentos.
2. Test de discriminación social
   1. Mide la cantidad de tiempo que el ratón en cuestión investiga cada taza. Una duración ininterrumpida de 8 minutos de la prueba comienza una vez que el experimentador abandona la habitación.
      NOTA: El análisis se puede marcar manualmente (cabeza del animal a <2 cm de distancia de la periferia de la copa de alambre y ángulo de cabeza de 180°) o utilizando un programa automatizado.
   2. Calcule análisis por pares para capturar mejor los cambios individuales dentro de las sesiones de prueba. Además, realice mediciones repetidas de dos vías ANOVA (con los factores de sesión y taza) para detectar diferencias entre sesiones en la exploración.

Resultados

Hemos utilizado las tareas de valencia social positiva y negativa para evaluar el reconocimiento de identidad en ratones C57BL/6 (Figura 2). En comparación con el día 1 de habituación de los pellets de alimento con sacarosa (H1, Figura 2B), la mayoría de los ratones consumieron todos los gránulos dados al último día de habituación al alimento (H3). Durante las sesiones de entrenamiento (T1 y T2), los ratones sujetos se familiarizaron con dos ratones CD1: neutros (Neu) y ratones asociados a valencia positiva (PV) al interactuar con ellos por separado en diferentes contextos. Las recompensas de comida se dieron a los ratones sujetos solo después de la interacción con el PV del ratón. Durante la tarea de discriminación social, encontramos que los ratones entrenados preferían interactuar con el ratón PV en comparación con el ratón neutro (* p < 0,05, prueba t de Student pareada). La relación entre sesiones del tiempo de interacción de la sesión 2 frente a la interacción de la sesión 1 también reveló una preferencia hacia el ratón PV (* p < 0,05, prueba t de Student pareada).

También utilizamos la tarea de valencia social negativa para examinar el reconocimiento de identidad (Figura 2C). Los ratones sujetos se familiarizaron con dos ratones CD1: Neu y ratón asociado a valencia negativa (NV) al interactuar con ellos por separado en diferentes contextos. Se administraron dos descargas eléctricas cerca del final de la sesión de interacción con el ratón NV, mientras que no se administraron descargas después de la interacción con el ratón Neu. No encontramos diferencias en los tiempos de interacción entre los ratones sujetos y los ratones Neu o NV en cada día de entrenamiento. Sin embargo, encontramos que los ratones sujetos redujeron el tiempo de interacción con el ratón NV durante la prueba de discriminación social (* p < 0,05, prueba t de Student pareada). La relación entre sesiones del tiempo de interacción de la sesión 2 frente a la interacción de la sesión 1 también reveló una preferencia hacia el ratón Neu (* p < 0,05, prueba t de Student pareada).

Figura 1: Aparato para tareas de reconocimiento de identidad. (A) Contexto de valencia neutral para pruebas de valencia social negativas. En la parte inferior del contexto se coloca un papel de caballete blanco. (B) Contexto de valencia social positivo. Fíjate en el puerto de comida (flecha) en la parte central inferior de la caja. (C) Contexto de valencia neutral para pruebas de valencia social positivas. (D) Contexto de habituación a la alimentación. En el lado derecho de la caja se instala un puerto de entrega de alimentos, como se muestra en E (círculo discontinuo) y F (ampliado). (G) Caja de choque. (H) Cerramiento de plexiglás. (I) Vaso de alambre. J) Caja de discriminación social de tres cámaras para la prueba de discriminación social. Las puertas de la cámara extraíbles para contener el ratón sujeto en la cámara central se muestran en K (puntas de flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diseño y resultados esperados de las tareas de reconocimiento de identidad. (A) Diagramas esquemáticos de las versiones de valencia social positiva (arriba) y negativa de las tareas de reconocimiento de identidad (abajo). Los ratones C57BL/6 fueron entrenados para interactuar diariamente con los objetivos sociales neutros (Neu de ratón) y asociados a la valencia (PV o NV de ratón). Un día después del entrenamiento, los ratones sujetos fueron colocados en un aparato de tres cámaras para la prueba de discriminación social. Esperamos que después del entrenamiento de valencia social positiva y negativa, los ratones sujetos muestren preferencia y evitación hacia ratones con valencia positiva (verde, ratón PV) y negativos (rojo, ratón NV), respectivamente. (B) Datos representativos de un experimento de entrenamiento de valencia social positiva. Los ratones sujetos fueron entrenados para interactuar con el ratón con valencia positiva (ratón PV) y el ratón neutro (ratón Neu) diariamente durante 2 días. El orden de interacción se invirtió el día 2. Izquierda: Los histogramas muestran el porcentaje de gránulos de alimento de sacarosa consumidos durante la habituación (H1-3 que representan los días de habituación 1-3) y el entrenamiento (T1-2 que representan los días de entrenamiento 1-2) con PV de ratón. Derecha: Los histogramas muestran el aumento en el tiempo de interacción social con el ratón PV con valencia positiva durante la prueba de discriminación social. La relación entre sesiones (tiempo de interacción de la sesión 2/tiempo de interacción de la sesión 1) reveló la preferencia por el PV del ratón con valencia positiva. * p < 0,05, prueba t de Student pareada. (C) Datos representativos de un experimento de entrenamiento de valencia social negativa. Los ratones sujetos fueron entrenados para interactuar con el ratón con valencia negativa (ratón NV) y el ratón neutro (ratón Neu) diariamente durante 3 días. El orden de interacción se invertía diariamente. Izquierda: Los histogramas muestran el tiempo de interacción con el ratón Neu y NV durante diferentes días de entrenamiento. Derecha: Los histogramas muestran la disminución del tiempo de interacción social con el ratón NV con valencia negativa durante la prueba de discriminación social. La relación entre sesiones reveló la evitación del ratón NV con valencia negativa. * p < 0.05, prueba t de Student emparejada. Abreviaturas: Neu = neutro; PV = valencia positiva; NV = valencia negativa; H = habituación; T = entrenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los paradigmas de reconocimiento de identidad fueron diseñados para ser fácilmente implementados en laboratorios con un mínimo de equipos especializados y pocas sesiones de capacitación en una semana. Se pueden utilizar experiencias valencianas alternativas dependiendo de los recursos disponibles y de la pregunta de investigación deseada. Por ejemplo, el reconocimiento de identidad con valencia negativa tras los ataques de un objetivo social agresivo se describió por primera vez en hámsters dorados y se adaptó a ratones en nuestro modelo ^6,12.

Los paradigmas de reconocimiento de identidad valenciada pueden tener aplicaciones más amplias dentro del campo de la memoria social. Estas tareas no solo se pueden utilizar para estudiar más a fondo la memoria social o los mecanismos de valencia social, sino que también pueden ayudar en el estudio de modelos de enfermedades que se sabe que tienen deficiencias de reconocimiento social. Las deficiencias en el reconocimiento de la identidad subyacen a los déficits de comportamiento social en trastornos como la esquizofrenia^13,14,15 y el trastorno del espectro autista 16,17,18, donde se ha estimado que un tercio de los adultos con autismo tienen dificultades para enfrentar el reconocimiento de la identidad individual ¹⁹. Por ejemplo, los ratones knockout Shank3 y Df(16)A^+/- son modelos de ratón con trastorno del espectro autista y esquizofrenia que se sabe que muestran un deterioro de la cognición social 20,21,22. Nuestros nuevos paradigmas pueden recapitular los déficits de memoria social y ser adoptados para la caracterización de modelos de enfermedad y la identificación de manipulaciones o tratamientos que mejoren los déficits de comportamiento social. Los objetos inanimados también pueden estudiarse en sustitución de objetivos sociales para analizar aún más los mecanismos que soportan el reconocimiento social de los objetos¹².

Los objetivos sociales utilizados en la Figura 1 son ratones de la cepa CD1 del mismo sexo, pero hemos logrado un reconocimiento de identidad valenciada comparable utilizando objetivos C57BL/6 de la misma cepa. Por lo tanto, hemos desarrollado un método fácilmente adoptable, que puede emplearse para el estudio adicional del procesamiento de la valencia social, la identidad social y los déficits de estas funciones cognitivas sociales en modelos animales de enfermedades cerebrales.

Los paradigmas de reconocimiento de identidad se fijan en la memoria de individuos específicos. Al diseñar los experimentos, hay que tener cuidado de que las sesiones de entrenamiento y prueba sean completamente diferentes y que la única señal que se mantenga constante sea la identidad de los objetivos sociales. Por ejemplo, las salas en las que se llevan a cabo la formación y las pruebas, los recintos que contienen los objetivos sociales y las señales asociadas a los contextos de formación y pruebas deben ser diferentes.

Las cuatro copas de alambre deben ser idénticas entre sí, pero lo más diferentes posible de las cajas de plexiglás. Las copas y los gabinetes de alambre deben ser diferentes en términos de material (por ejemplo, plexiglás frente a metal), forma (por ejemplo, rectangular frente a circular) y color (por ejemplo, transparente frente a oro rosa). Esto se hace para garantizar que la única señal que informa el comportamiento exploratorio durante las pruebas es la identidad de los objetivos sociales.

La habituación al contexto se lleva a cabo el día 1 de entrenamiento. Esto se hace para fomentar la exploración de objetivos sociales durante el entrenamiento en lugar del contexto, que ya será conocido por el ratón sujeto. Además, se recomiendan al menos 2 h de tiempo de espera entre las sesiones de entrenamiento valenciadas y neutras. Se cree que proporcionar tiempo a los ratones sujetos entre las sesiones de entrenamiento reduce la generalización, ya que las experiencias asignadas más cerca en el tiempo tienen más probabilidades de estar vinculadas²³. Por esta misma razón, el entrenamiento se repite, pero se contrarresta en orden, en los días siguientes. Se piensa que la repetición fomenta una mayor asociación de la experiencia con el objetivo social respectivo. Idealmente, más tiempo entre las sesiones de entrenamiento puede permitir que los ratones sujetos aprendan a asociar el objetivo social con su respectiva experiencia valenciada. A efectos prácticos, se decidió que el período de espera fuera de 2 horas, ya que permitía que las sesiones de entrenamiento neutrales y valenciadas tuvieran lugar en 1 día en una cohorte de 8 a 12 ratones. Por ejemplo, el entrenamiento de 12 ratones puede llevar aproximadamente 2 horas, momento en el que el ratón sujeto que fue entrenado primero estaría listo para comenzar la siguiente sesión de entrenamiento. Por supuesto, aumentar el período de espera puede mejorar el rendimiento de los ratones, pero llevará más tiempo para el experimentador.

Los ratones sujetos y los objetivos sociales deben llegar a las instalaciones de animales al menos 7 días antes del inicio del entrenamiento conductual para minimizar la influencia del estrés del transporte. Los objetivos sociales deben ser de una sola casa, ya que las señales olfativas de los compañeros de jaula pueden afectar el reconocimiento de la identidad. Los mismos dos objetivos sociales se pueden utilizar para una cohorte de hasta 12 ratones sujetos. Es importante destacar que los objetivos sociales deben ser devueltos a su jaula doméstica durante cada período de limpieza y configuración entre ratones sujetos. Es importante devolver a los objetivos sociales a sus jaulas domésticas, ya que el confinamiento prolongado en los recintos puede alterar su comportamiento y, a su vez, influir en la decisión de los ratones sujetos de interactuar.

Los ratones sujetos y los objetivos sociales pueden ser conespecíficos de la misma cepa o de cepas diferentes. Si se utilizan objetivos sociales de la misma cepa, es fundamental que no pertenezcan a la misma camada que los ratones objeto de estudio y que los objetivos sociales no se conozcan entre sí. Esto se puede garantizar ordenando ratones sujeto y objetivos sociales de diferentes proveedores de animales o pidiendo animales de edades ligeramente diferentes (es decir, ratones sujeto de 8 semanas de edad y objetivos sociales de 7 semanas de edad). Si se requieren procedimientos de marcaje auricular, deben realizarse al menos 24 horas antes del inicio del entrenamiento conductual. Esto es para minimizar la influencia de los factores estresantes externos sobre el comportamiento del ratón sujeto. Para todo el entrenamiento y las pruebas de comportamiento, se recomienda trabajar con un ratón sujeto a la vez. Aunque el entrenamiento y las pruebas simultáneas de ratones de múltiples sujetos pueden ahorrar tiempo, también aumentan las señales olfativas en la sala experimental que pueden influir en la codificación o el recuerdo del reconocimiento de identidad. Como tal, recomendamos cohortes de 8 a 12 ratones sujetos. Para los experimentos de valencia social positiva, se recomienda manipular a los animales diariamente antes del entrenamiento para minimizar el estrés de manipulación, que puede desalentar el consumo de alimentos novedosos. También se recomienda colocar 2-3 gránulos de comida con sacarosa por ratón en la jaula doméstica durante 3 días antes de la habituación para facilitar el proceso de habituación.

Aunque los datos presentados se calificaron manualmente, existen opciones fáciles de usar y automatizadas para el análisis del comportamiento y se pueden aplicar para la puntuación más eficiente de las interacciones sociales en videos de capacitación y prueba. Por ejemplo, DeepLabCut es un software que emplea redes neuronales entrenadas por el usuario para la anotación sin marcadores de la posición de los animales y puede optimizarse para la identificación precisa de fotogramas que satisfacen el comportamiento de investigación²⁴.

Se pueden emplear otros experimentos de control para verificar que se han logrado protocolos de reconocimiento de identidad exitosos¹². Invertir el orden de entrenamiento debe continuar provocando el reconocimiento de identidad y confirmar que los resultados no se deben al orden de entrenamiento validado y neutral. El entrenamiento también se puede llevar a cabo como se describe, pero las pruebas pueden tener lugar con el objetivo neutral y un objetivo social nuevo, donde una mayor interacción con el objetivo nuevo sugeriría que los ratones sujetos tienen una memoria social para el objetivo neutral y han reconocido que es familiar. Del mismo modo, se pueden realizar pruebas con dos ratones sujetos nuevos para confirmar que las conductas de evitación o acercamiento son, de hecho, específicas de los objetivos sociales con valencia negativa y positiva, respectivamente. Aunque actualmente no se ha probado si el mismo ratón sujeto puede someterse a un entrenamiento de valencia social tanto negativo como positivo, creemos que es posible si los experimentadores tienen acceso a múltiples cepas de objetivos sociales o contextos de entrenamiento. El uso de la misma cepa de objetivos sociales para experimentos de valencia positiva y negativa puede complicar la asociación de una cepa con una valencia particular. Si es posible, el uso de diferentes cepas de objetivos sociales puede fomentar la exploración y evitar la generalización entre experiencias positivas y negativas. Del mismo modo, la reutilización de los mismos contextos de entrenamiento aumentaría la generalización entre experiencias de valencia opuesta y se minimizaría con el uso de contextos distintos para el entrenamiento. Si el cronograma experimental lo permite, también se recomendaría separar los experimentos de valencia positiva y negativa por unas pocas semanas.

En el caso de que haya dificultades para establecer los protocolos de reconocimiento de identidad, sugerimos soluciones a los problemas comunes que hemos enfrentado. Los ratones sujetos de alojamiento en grupo pueden funcionar como entrenamiento de extinción, ya que la valencia asociada con un objetivo social se extingue después de la interacción normal con un compañero de jaula²⁵, pero es necesario ya que el aislamiento social perjudica la memoria social y altera el comportamiento social^26,27. De hecho, descubrimos que la vivienda única no provocaba el reconocimiento de identidad en ratones machos. Sin embargo, puede ser necesario un alojamiento individual si los animales se están recuperando de cirugías estereotáxicas o tienen implantes intracraneales que pueden ser sensibles al desprendimiento. En tales casos, hemos alojado con éxito ratones en parejas en jaulas grandes, separadas por un tabique perforado, y hemos replicado el reconocimiento de identidad en esta condición¹².

Para la tarea de valencia social positiva, es común que los ratones muestren reticencia a consumir nuevos gránulos de sacarosa. Para resolver este problema, es útil aumentar el tiempo de privación de alimentos o familiarizar a los ratones con los gránulos colocando algunos gránulos en su jaula doméstica durante 2-3 días antes de la sesión de habituación. En algunas situaciones en las que la mayoría de los ratones no consumen gránulos de comida, también puede ser útil aumentar el número de sesiones de habituación. Aunque notamos que los ratones machos generalmente comieron menos durante la habituación de los gránulos de comida que los ratones hembra, esto no afecta su capacidad para reconocer el objetivo social con valencia positiva.

Finalmente, los parámetros de las tareas de reconocimiento de identidad se pueden modificar para reducir o mejorar la dificultad de la tarea. Por ejemplo, para revelar el sutil impacto de los factores biológicos en el reconocimiento de la identidad, el tiempo de entrenamiento y el número de sesiones de entrenamiento pueden reducirse para aumentar la dificultad de la tarea.

Las tareas conductuales que presentamos en este protocolo son simples, fáciles de configurar y adaptables a ratones machos y hembras para estudiar el reconocimiento de identidad. El uso flexible de estímulos apetitivos o aversivos en estas tareas también permite examinar el papel de la valencia social en el reconocimiento de la identidad. Estas tareas serán útiles para estudiar los mecanismos biológicos del reconocimiento de identidad en ratones sanos, o los déficits de estos mecanismos en modelos de ratón relacionados con enfermedades que presentan deterioro social.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol
Black-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			neutral context, positive social valence experiment
C57BL/6 mice	Charles River, Jackson Laboratory		Social targets from Jackson Laboratory
Dustless precision pellets	BioServ	F05301	20 mg, chocolate flavor
Electric tape
Glass bottles (2)
hydrogen peroxide-based disinfectant
Plastic or cardboard			Non-conductive material for enclosure floor
Rectangular plexiglass enclosures (2, 10 cm x 5 cm x 30 cm)			Identical
Shock box (triangular, length of each side = 46 cm; height = 29 cm)
Silent timer
Single Output Scrambled Animal Shocker	Lafayette Instrument	HSCK100AP
three-chamber box (81 cm x 23 cm x 23 cm), with openings in the middle chamber that connect to the left and the right chambers			social discrimination testing
Transparent cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			Negative social valence
Transparent cage (26 cm x 47 cm x 21 cm)			Food habituation (positive social valence)
Webcam	Logitech	C920x
Weighing scale
white easel pad papers			floor of the neutral context
White noise generator			60 dB
White, plastic dish
White-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm) with a 1 cm diameter plastic tube as food port			positive social valence context
Wire cups (circular, four, 8 cm x 8 cm x 10 cm)