Tarefas comportamentais para examinar o reconhecimento de identidade em camundongos

Resumo

Ao emparelhar experiências de valência negativa ou positiva com alvos sociais individuais, desenvolvemos tarefas de comportamento para examinar o reconhecimento de identidade de camundongos C57BL / 6. Essas tarefas permitem o estudo dos mecanismos de memória social de alvos sociais individuais em modelos de camundongos saudáveis e relacionados a doenças com cognição social prejudicada.

Resumo

Animais sociais, como roedores, são capazes de reconhecer e diferenciar a identidade de indivíduos familiares. Reconhecer a identidade de indivíduos familiares é importante para o desenvolvimento de estruturas sociais, como hierarquia, parentesco e família. No entanto, os mecanismos subjacentes ao reconhecimento da identidade social permanecem obscuros. A maioria dos estudos de reconhecimento social de roedores é baseada na propensão dos roedores a interagir com um novo alvo social, um fenômeno conhecido como novidade social. No entanto, as tarefas comportamentais para examinar a novidade social não podem revelar o reconhecimento de coespecíficos familiares com base em suas identidades. Aqui são apresentadas tarefas comportamentais que permitem o exame do reconhecimento de identidade em camundongos C57BL / 6, associando dois camundongos familiares com ou sem uma experiência de valência. Os indivíduos tiveram interações com dois camundongos sem (neutro) ou com uma experiência de valência (negativa ou positiva) e se familiarizaram com esses camundongos. O camundongo com valência negativa foi associado a choques, enquanto o camundongo com valência positiva foi associado a uma recompensa alimentar. Após o treinamento, o reconhecimento da identidade desses camundongos familiares pode ser revelado em um teste de discriminação social, que é representado como a preferência pelo camundongo com valência positiva e evitação do camundongo com valência negativa em comparação com o camundongo neutro. Tarefas comportamentais para reconhecimento de identidade podem ser úteis para sondar os mecanismos de memória social e a fisiopatologia de distúrbios com cognição social prejudicada, como transtorno do espectro do autismo ou esquizofrenia.

Introdução

O reconhecimento de identidade, ou a capacidade de identificar indivíduos familiares com base em experiências anteriores, é fundamental para a sobrevivência dos animais sociais¹. Em roedores, a hierarquia social, o reconhecimento de parceiros e descendentes, a defesa territorial e o estabelecimento e manutenção de grupos são comportamentos incumbentes ao reconhecimento de identidade bem-sucedido ^2,3. A compreensão atual da memória social é baseada em estudos com roedores enraizados na capacidade de identificar coespecíficos novos versus familiares. Essas tarefas têm sido úteis para descobrir regiões cerebrais que se acredita mediarem a memória social, como as regiões CA2⁴ do hipocampo e CA1 ventral⁵. No entanto, tais estudos permanecem limitados na elucidação dos mecanismos subjacentes ao reconhecimento de identidade, uma vez que se restringem ao reconhecimento categórico da novidade social.

O reconhecimento de identidade foi demonstrado independentemente da novidade social por meio de paradigmas de aprendizagem associativa, onde experiências salientes valorizadas estão associadas a um dos dois (ou mais) alvos sociais familiares. Essas tarefas são baseadas na noção de que as interações sociais estão frequentemente ligadas ao significado emocional, onde experiências negativas resultam em comportamentos de prevenção de conflitos, enquanto interações lúdicas ou estimulantes são geralmente recompensadoras. O afeto emocional ligado às interações é denominado valência social. Hamsters dourados machos foram capazes de discriminar entre dois alvos coespecíficos familiares quando um os atacou anteriormente⁶. A memória de reconhecimento de ratos Wistar machos individuais também foi importante para o estabelecimento da classificação social⁷.

Recentemente, o reconhecimento de identidade foi examinado em camundongos C57BL / 6, a cepa de camundongo mais amplamente usada na pesquisa em neurociência, associando camundongos C57BL / 6 individuais com ou sem estímulos apetitivos⁸. Essa abordagem usou camundongos com cabeça fixa para passar por centenas de testes de treinamento, o que limitou seu uso para examinar comportamentos naturalistas em camundongos que se moviam livremente. Em outros estudos, o reconhecimento de identidade de camundongos C57BL / 6 foi apoiado pela preferência de coespecíficos administrados com etanol ^9,10. No entanto, a administração de substâncias pode introduzir confusão. Finalmente, poucos desses estudos foram usados para examinar o reconhecimento de identidade em roedores de ambos os sexos. Um método facilmente adotável que é aplicável a camundongos C57BL / 6 machos e fêmeas é uma ferramenta crucial para promover o estudo do reconhecimento de identidade.

Apresentados aqui são paradigmas de reconhecimento de identidade que podem ser empregados em camundongos machos e fêmeas. Para estudar a identidade independente dos efeitos da novidade, dois alvos sociais familiares são usados, e um desses alvos está associado a uma experiência emocional saliente que se presume informar o comportamento de interação. Para a associação de valência social negativa, uma abordagem semelhante ao condicionamento do medo social foi adaptada para provocar evitação em relação a um alvo social específico¹¹. Se uma valência social negativa, como um choque aversivo no pé, estiver associada a um indivíduo, seria esperada uma diminuição da interação com o alvo social. Por outro lado, se uma valência social positiva, como uma recompensa apetitiva, estiver associada a um indivíduo específico, o aumento da interação com esse camundongo seria antecipado em testes subsequentes. Juntas, as tarefas comportamentais descritas podem ser facilmente aplicadas na maioria dos laboratórios para o estudo do reconhecimento de identidade em camundongos C57BL / 6 e outras linhagens de camundongos.

Protocolo

Camundongos machos adultos C57BL/6 (8-10 semanas de idade; peso corporal: 18-25 g) foram usados neste estudo. Os camundongos usados como alvos sociais foram obtidos de uma fonte diferente (ver Tabela de Materiais) para garantir que fossem de ninhadas diferentes e anteriormente desconhecidas para os camundongos em questão. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais de Instalações do Centro de Pesquisa Douglas e seguiram as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (protocolo nº: DOUG-5935).

1. Materiais (ver figura 1)

1. Configure uma grande gaiola transparente (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) para ser o contexto neutro no experimento de valência social negativa
2. Use uma caixa de choque triangular de paredes pretas (comprimento de cada lado = 46 cm; altura = 29 cm) como contexto de valência negativa. Certifique-se de que o piso da caixa de choque consista em grades de metal conectadas a um gerador de corrente de rede embaralhada.
3. Use uma gaiola grande e transparente (26 cm x 47 cm x 21 cm) como contexto de habituação alimentar no experimento de valência social positiva.
4. Use uma grande gaiola de paredes pretas (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) como contexto neutro no experimento de valência social positiva.
5. Use uma gaiola grande de paredes brancas (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) com uma porta de alimentação como contexto de valência social positiva. Como porta de alimentação, use um tubo de plástico (0.5 cm de diâmetro) que passe por um lado da parede e coloque um prato de plástico branco embaixo do tubo.
6. Papéis de cavalete brancos pré-cortados para usar como piso do contexto neutro (treinamento neutro em experimentos de valência social negativa e positiva) e contextos de valência social positiva. Corte a almofada um pouco menor do que a superfície inferior do contexto para evitar que o mouse em questão se enterre sob o papel. Substitua as almofadas de cavalete entre os mouses em questão.
7. Use pellets de precisão sem poeira (20 mg, sabor chocolate) como uma sugestão de recompensa na interação com o alvo social com valência positiva.
8. Use uma balança para pesar camundongos sujeitos diariamente durante os experimentos de valência social positiva.
9. Use uma caixa de três câmaras (81 cm x 23 cm x 23 cm), com aberturas na câmara do meio que se conectam às câmaras esquerda e direita, para testes de discriminação social. Use portas de câmara removíveis para conter o mouse sujeito na câmara do meio entre as sessões, evitando o estresse de manuseio.
10. Use dois gabinetes retangulares idênticos de plexiglass (10 cm x 5 cm x 30 cm) para treinamento de valência social negativa e positiva.
11. Use quatro copos circulares de arame (8 cm x 8 cm x 10 cm) para testes de discriminação social. Mantenha dois copos de arame vazios durante a sessão 1 do teste de discriminação social. Na sessão 2, coloque as metas sociais usadas no treinamento de valência social positiva ou negativa nos outros dois copos de arame.
    NOTA: Rotule os copos de arame (por exemplo, usando fita adesiva) para diferenciar entre copos de arame idênticos. Dentro de um experimento, use os copos de arame para a mesma finalidade durante toda a duração do experimento. Se um alvo social diferente precisar ser colocado dentro do copo de arame, limpe-o completamente com sabão, água e um desinfetante de ação rápida à base de peróxido de hidrogênio.
12. Coloque duas garrafas de vidro em cima dos copos de arame virados durante o teste de discriminação social para evitar que os ratos subam em cima dos copos de arame.
13. Certifique-se de que os recintos em treinamento tenham pisos de um material não condutor para experimentos de valência social negativa. Por exemplo, use plástico ou papelão coberto com fita isolante para garantir que o alvo social com valência negativa não receba choques durante o treinamento.
14. Use um temporizador silencioso para evitar pistas externas que possam interferir no comportamento animal.
15. Use uma webcam de alta resolução (1.080 p/30 fps) conectada a um laptop para capturar o comportamento do mouse durante o treinamento e o teste de discriminação social.
16. Use um gerador de ruído branco que gere ruído branco estático a 60 dB medido no centro do contexto.
    NOTA: Todos os procedimentos comportamentais devem ser conduzidos com ruído branco estático a 60 dB medido no centro do contexto para mascarar os sons ambientais que podem afetar o comportamento animal.
17. Use lâmpadas de luz vermelha para todos os procedimentos comportamentais.
    NOTA: Isso fornece condições ambientais escuras, que incentivam a exploração em camundongos e permitem a visualização do comportamento animal em gravações de vídeo.
18. Limpe os compartimentos, vazios e contendo animais, entre os camundongos sujeitos com etanol a 70%, que é de secagem rápida. Limpe os contextos de treinamento e teste entre camundongos sujeitos com um desinfetante de ação rápida à base de peróxido de hidrogênio para eliminar possíveis influências no comportamento devido a pistas olfativas de camundongos sujeitos anteriores.

2. Procedimentos comportamentais

1. Valência social negativa
   1. Habituação ao contexto
      1. Equipar a sala experimental com ruído branco e luz vermelha ambiente durante a experiência.
      2. Prepare a caixa de choque colocando um invólucro de plexiglass vazio com piso não condutor no centro.
      3. Coloque o mouse em um canto da caixa de choque e deixe o mouse explorar livremente por 5 min.
      4. Retorne o mouse sujeito à sua gaiola inicial.
      5. Repita a habituação da caixa de choque com os ratos restantes.
      6. Pelo menos 1 h depois, repita o procedimento de habituação ao contexto (etapas 2.1.1.1-2.1.1.5) no contexto neutro.
   2. Treinamento de valência negativa
      1. Inicie o treinamento de valência negativa pelo menos 1 h após a habituação a ambos os contextos.
      2. Prepare a caixa de choque ajustando a corrente para 0.3 mA.
         NOTA: A configuração de corrente recomendada é baseada na caixa de choque que usamos e em nosso projeto experimental (3 dias de treinamento). Essa configuração pode ser modificada para se adequar a outros experimentos experimentais (por exemplo, uma corrente mais forte pode ser usada com projetos de menos tentativas de treinamento).
      3. Coloque o alvo social com valência negativa no gabinete de plexiglass com um fundo não condutor no centro da caixa de choque.
      4. Inicie a gravação de vídeo e coloque o mouse do assunto em um canto da caixa de choque.
      5. Inicie o cronômetro e permita que o mouse em questão explore livremente.
      6. Aos 4 e 4,5 min, aplique um choque elétrico de 1 s de duração.
         NOTA: Isso permite tempo de interação suficiente entre o mouse em questão e o alvo social antes de sofrer choques aversivos.
      7. Remova o mouse do assunto em 5 minutos e pare a gravação e o cronômetro.
      8. Retorne o mouse sujeito à sua gaiola inicial.
      9. Desinfete a caixa de choque e repita o treinamento de valência negativa com os camundongos restantes.
   3. Treinamento neutro
      1. Comece o treinamento neutro pelo menos 2 h após o treinamento de valência negativa.
      2. Coloque o alvo social neutro no gabinete com um fundo não condutor no centro do contexto.
         NOTA: Um fundo não condutor é usado para garantir que os contextos negativo e neutro tenham indicações de contexto idênticas. Nenhum choque é aplicado no treinamento neutro.
      3. Inicie a gravação de vídeo e coloque o mouse do assunto em um canto do contexto neutro.
      4. Inicie o cronômetro e permita que o mouse em questão explore livremente.
      5. Remova o mouse do assunto em 5 minutos e pare a gravação e o cronômetro.
      6. Retorne o mouse sujeito à sua gaiola inicial.
   4. Ordem de treinamento
      1. Dia 1: Após a habituação de ambos os contextos (passo 2.1.1), realize o treino neutro (passo 2.1.3) 2 h após o treino de valência negativa (passo 2.1.2).
      2. Dia 2: Repita o treinamento no dia 2 com uma ordem de treinamento invertida (etapas 2.1.3 e 2.1.2; ou seja, execute o treinamento neutro e, em seguida, o treinamento de valência negativa 2 h depois).
      3. Dia 3: Repita o treinamento no dia 3 com uma ordem de treinamento invertida (etapas 2.1.2 e 2.1.3; ou seja, treinamento de valência negativa seguido de treinamento neutro 2 h depois).
2. Valência social positiva
   1. Privação alimentar
      1. Pese cada rato sujeito diariamente durante o experimento.
         NOTA: Se, a qualquer momento, um camundongo perder mais de 15% de seu peso corporal original, a privação de alimentos deve ser interrompida e o camundongo deve ser descartado de outros experimentos.
      2. Forneça 1 g de ração normal para camundongos por rato na gaiola doméstica.
         NOTA: Os camundongos sujeitos são alojados em grupo com 1 g de alimento disponível por camundongo. Por exemplo, se quatro camundongos são alojados em grupo, então 4 g de comida são colocados na gaiola.
      3. Repita a privação de alimentos diariamente durante o experimento de valência social positiva (ou seja, após cada dia de habituação de pellets de alimentos, habituação de contexto e treinamento de valência positiva).
   2. Habituação de pellets de alimentos de sacarose
      1. Comece a habituação de pellets de alimentos 12 h após o início da privação alimentar.
      2. Equipar a sala experimental com ruído branco e luz vermelha ambiente durante a experiência.
      3. Coloque o rato em um canto do contexto de habituação alimentar.
      4. Inicie o cronômetro e entregue 1 pellet de alimento de sacarose/min ao longo de 10 min.
      5. Remova o assunto em 10 min e retorne o mouse para sua gaiola doméstica.
      6. Registre o número de pellets de comida de sacarose consumidos pelo camundongo sujeito.
      7. Repita a habituação de pellets de sacarose por um total de 3 dias.
         NOTA: Mais dias de habituação podem ser adicionados se os ratos não consumirem nenhum pellet de alimento de sacarose após 3 dias.
      8. Remova do estudo os indivíduos que não consomem pellets de sacarose durante a habituação dos pellets de alimentos.
   3. Habituação ao contexto
      1. Um dia após a habituação do pellet de alimento de sacarose (dia 4), prepare o contexto de valência positiva colocando um invólucro de plexiglass vazio em um canto do contexto.
      2. Coloque o mouse em um canto do contexto de valência positiva e permita que o mouse explore livremente por 10 minutos.
      3. Retorne o mouse sujeito à sua gaiola inicial.
      4. Repita a habituação do contexto de valência positiva com os camundongos restantes.
      5. Pelo menos 1 h depois, repita o procedimento de habituação ao contexto no contexto neutro.
   4. Treinamento de valência positiva
      1. Inicie o treinamento de valência positiva pelo menos 1 h após a habituação a ambos os contextos.
      2. Colocar o alvo social com valência positiva no recinto no centro do contexto de valência positiva.
      3. Inicie a gravação do vídeo e coloque o mouse do assunto em um canto do contexto de valência positiva.
      4. Inicie o cronômetro e permita que o mouse explore livremente por 10 minutos.
      5. Em cada sessão de interação com a meta social que é de >2 s, entregue 1 pellet de alimento de sacarose através da porta de alimentação. A interação é definida como períodos em que o nariz do rato em questão está a <2 cm de distância da periferia do invólucro de plexiglass. O ângulo da cabeça do sujeito deve ser posicionado em direção ao gabinete.
         NOTA: Podem ocorrer cutucadas e cheiradas no nariz, mas não são necessárias para a entrega de pellets de sacarose.
      6. Remova o mouse do assunto em 10 minutos e pare a gravação e o cronômetro.
      7. Retorne o mouse sujeito à sua gaiola inicial.
      8. Registre o número de pellets de comida de sacarose entregues pela porta de alimentação e o número de pellets consumidos pelo mouse em questão.
      9. Substitua o piso do cavalete, desinfete o contexto positivo e repita o treinamento de valência positiva com os camundongos restantes.
   5. Treinamento neutro
      1. Comece o treinamento neutro pelo menos 2 h após o treinamento de valência positiva.
      2. Coloque o destino social neutro no recinto em um canto do contexto neutro.
      3. Inicie a gravação de vídeo e coloque o mouse do assunto em um canto do contexto neutro.
      4. Inicie o cronômetro e permita que o mouse explore livremente por 10 minutos.
      5. Remova o mouse do assunto em 10 minutos e pare a gravação e o cronômetro.
      6. Retorne o mouse sujeito à sua gaiola inicial.
      7. Substitua o piso do cavalete, desinfete o equipamento e repita o treinamento neutro com os ratos restantes.
   6. Ordem de treinamento
      1. Dias 1-3: Realize a habituação de pellets de alimentos (etapa 2.2.2).
      2. Dia 4: Após a habituação de ambos os contextos (passo 2.2.3), primeiro realize o treino de valência positiva (passo 2.2.4) seguido de treino neutro (passo 2.2.5) 2 h depois.
      3. Dia 5: Repita o treinamento no dia 5 com uma ordem de treinamento invertida (etapas 2.2.5 e 2.2.4; ou seja, treinamento neutro seguido de treinamento de valência positiva 2 h depois).
3. Teste de discriminação social
   1. Equipe a sala experimental com ruído branco e luz vermelha ambiente.
   2. Transportar os sujeitos para a sala experimental e permitir a habituação sem perturbações à sala durante pelo menos 1 h.
      NOTA: Certifique-se de que os alvos sociais permaneçam fora da sala experimental durante o período de habituação.
   3. Na sessão 1, coloque dois copos de arame vazios nos cantos opostos das câmaras esquerda e direita da caixa de discriminação social de três câmaras.
      NOTA: Objetos grandes e pesados idênticos (por exemplo, garrafas de vidro) são colocados em cima dos copos de arame para garantir que o mouse em questão não suba em cima do copo de arame.
   4. Inicie a gravação do vídeo, coloque o mouse do assunto no centro da câmara do meio e inicie o cronômetro.
      NOTA: Se possível, saia da sala para minimizar a interferência do experimentador nos mouses sujeitos.
   5. Após 8 min, retorne à sala de testes e, sem tocar no mouse do sujeito, use as portas da câmara para colocar o assunto na câmara do meio.
   6. Substitua os copos de arame vazios por um conjunto idêntico, mas diferente, de copos contendo os alvos sociais.
      NOTA: As metas sociais são aquelas usadas no treinamento de valência social negativa ou positiva.
   7. Remova as portas da câmara e inicie o cronômetro enquanto o mouse explora na sessão 2.
   8. Após 8 min, pare a gravação e retorne o mouse em questão e os alvos sociais para suas respectivas gaiolas.
   9. Limpe os copos com etanol 70% e limpe a arena com desinfetante.
   10. Repita o teste de discriminação social (etapas 2.3.3-2.3.9) com os camundongos restantes.
   11. Depois que metade da coorte concluir o teste, contrabalanceie a localização do copo de arame.
       NOTA: Os alvos sociais devem ser movidos com seus respectivos copos de arame para evitar pistas olfativas conflitantes.
   12. Limpe todos os copos de arame com sabão, água e desinfetante. Limpe a caixa de discriminação social de três câmaras com desinfetante.

3. Análise comportamental

1. Formação
   1. Analise o tempo de interação com cada alvo social e marque o número de ataques de interação.
      NOTA: A análise pode ser pontuada manualmente (cabeça do animal a <2 cm de distância da periferia do recinto e ângulo da cabeça de 180°) ou usando um programa automatizado.
   2. Registre o número de pellets de alimentos consumidos durante o treinamento de valência social positiva para garantir que as mudanças nos comportamentos sociais não sejam devidas a diferenças na motivação para consumir recompensas alimentares.
2. Teste de discriminação social
   1. Meça a quantidade de tempo que o mouse investiga cada xícara. Uma duração ininterrupta de 8 minutos do teste começa assim que o experimentador sai da sala.
      NOTA: A análise pode ser pontuada manualmente (cabeça do animal a <2 cm de distância da periferia do copo de arame e ângulo da cabeça de 180°) ou usando um programa automatizado.
   2. Calcule análises em pares para capturar melhor as alterações individuais nas sessões de teste. Além disso, execute ANOVA de medidas repetidas bidirecionais (com os fatores de sessão e xícara) para detectar diferenças entre as sessões na exploração.

Resultados

Usamos as tarefas de valência social positiva e negativa para avaliar o reconhecimento de identidade em camundongos C57BL / 6 (Figura 2). Em comparação com o dia 1 da habituação de pellets de sacarose (H1, Figura 2B), a maioria dos camundongos consumiu todos os pellets fornecidos no último dia de habituação alimentar (H3). Durante as sessões de treinamento (T1 e T2), os camundongos sujeitos se familiarizaram com dois camundongos CD1: neutro (Neu) e camundongo associado à valência positiva (PV), interagindo com eles separadamente em diferentes contextos. Recompensas alimentares foram dadas aos camundongos sujeitos somente após a interação com o PV do camundongo. Durante a tarefa de discriminação social, descobrimos que os camundongos treinados preferiram interagir com o camundongo PV quando comparados ao camundongo neutro (* p < 0,05, teste t de Student pareado). A razão entre as sessões do tempo de interação da sessão 2 versus a interação da sessão 1 também revelou uma preferência pelo camundongo PV (* p < 0,05, teste t de Student pareado).

Também usamos a tarefa de valência social negativa para examinar o reconhecimento de identidade (Figura 2C). Os camundongos sujeitos se familiarizaram com dois camundongos CD1: Neu e camundongo associado à valência negativa (NV), interagindo com eles separadamente em diferentes contextos. Dois choques elétricos foram dados perto do final da sessão de interação com o camundongo NV, enquanto nenhum choque foi dado após a interação com o camundongo Neu. Não encontramos diferenças nos tempos de interação entre os camundongos sujeitos e os camundongos Neu ou NV em cada dia de treinamento. No entanto, descobrimos que os camundongos sujeitos reduziram o tempo de interação com o camundongo NV durante o teste de discriminação social (* p < 0,05, teste t de Student pareado). A razão entre as sessões do tempo de interação da sessão 2 versus a interação da sessão 1 também revelou uma preferência pelo camundongo Neu (* p < 0,05, teste t de Student pareado).

Figura 1: Aparelho para tarefas de reconhecimento de identidade. (A) Contexto de valência neutra para testes de valência social negativos. Um bloco de cavalete branco é colocado na parte inferior do contexto. (B) Contexto de valência social positiva. Observe a porta de alimentação (seta) na parte inferior central da caixa. (C) Contexto de valência neutra para teste de valência social positivo. (D) Contexto de habituação alimentar. Uma porta de entrega de comida é instalada no lado direito da caixa, conforme mostrado em E (círculo tracejado) e F (ampliado). (G) Caixa de choque. (H) Invólucro de acrílico. (I) Copo de arame. (J) Caixa de discriminação social de três câmaras para o teste de discriminação social. As portas da câmara removíveis para conter o mouse sujeito na câmara central são mostradas em K (pontas de seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Design e resultados esperados das tarefas de reconhecimento de identidade. (A) Diagramas esquemáticos de versões de valência social positiva (superior) e negativa de tarefas de reconhecimento de identidade (inferior). Camundongos C57BL / 6 foram treinados para interagir diariamente com os alvos sociais neutros (camundongo Neu) e associados à valência (camundongo PV ou NV). Um dia após o treinamento, os camundongos foram colocados em um aparelho de três câmaras para o teste de discriminação social. Esperamos que, após o treinamento de valência social positiva e negativa, os camundongos sujeitos exibam preferência e evitação em relação a camundongos com valência positiva (verde, PV de camundongo) e com valência negativa (vermelho, NV de camundongo), respectivamente. (B) Dados representativos de um experimento de treinamento de valência social positiva. Os camundongos sujeitos foram treinados para interagir com o camundongo com valência positiva (camundongo PV) e o camundongo neutro (camundongo Neu) diariamente por 2 dias. A ordem de interação foi invertida no dia 2. Esquerda: Os histogramas mostram a porcentagem de pellets de alimentos de sacarose consumidos durante a habituação (H1–3 que representam os dias de habituação 1–3) e treinamento (T1–2 que representam os dias de treinamento 1–2) com PV de camundongo. Direita: Os histogramas mostram o aumento no tempo de interação social com o PV de camundongo com valência positiva durante o teste de discriminação social. A razão entre sessões (tempo de interação da sessão 2/tempo de interação da sessão 1) revelou a preferência pelo PV de camundongo com valência positiva. * p < 0,05, teste t de Student pareado. (C) Dados representativos de um experimento de treinamento de valência social negativa. Os camundongos sujeitos foram treinados para interagir com o camundongo com valência negativa (camundongo NV) e o camundongo neutro (camundongo Neu) diariamente por 3 dias. A ordem de interação foi invertida diariamente. Esquerda: Os histogramas mostram o tempo de interação com o camundongo Neu e NV durante diferentes dias de treinamento. Direita: Os histogramas mostram a diminuição do tempo de interação social com o NV de camundongo com valência negativa durante o teste de discriminação social. A razão de intersessão revelou a evitação da NV de camundongo com valência negativa. * p < 0,05, teste t de Student pareado. Abreviaturas: Neu = neutro; PV = valência positiva; NV = valência negativa; H = habituação; T = treinamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os paradigmas de reconhecimento de identidade foram projetados para serem facilmente implementados em laboratórios com equipamentos especializados mínimos e poucas sessões de treinamento em uma semana. Experiências alternativas de valência podem ser utilizadas dependendo dos recursos disponíveis e da questão de pesquisa desejada. Por exemplo, o reconhecimento de identidade com valência negativa após ataques de um alvo social agressivo foi descrito pela primeira vez em hamsters dourados e adaptado a camundongos em nosso modelo ^6,12.

Os paradigmas de reconhecimento de identidade valência podem ter aplicações mais amplas no campo da memória social. Essas tarefas não apenas podem ser usadas para estudar mais a memória social ou os mecanismos de valência social, mas também podem ajudar no estudo de modelos de doenças conhecidos por terem deficiências de reconhecimento social. Prejuízos no reconhecimento de identidade estão subjacentes a déficits de comportamento social em transtornos como esquizofrenia 13,14,15 e transtorno do espectro autista 16,17,18, onde estima-se que um terço dos adultos com autismo tenha dificuldades em enfrentar o reconhecimento da identidade individual¹⁹. Por exemplo, camundongos knockout para Shank3 e Df(16)A^+/- são modelos de camundongos com transtorno do espectro do autismo e esquizofrenia conhecidos por exibir cognição social prejudicada 20,21,22. Nossos novos paradigmas podem recapitular déficits de memória social e ser adotados para a caracterização de modelos de doenças e a identificação de manipulações ou tratamentos que melhorem os déficits de comportamento social. Objetos inanimados também podem ser estudados em substituição a alvos sociais para analisar ainda mais os mecanismos de suporte do objeto, em comparação com o reconhecimento social¹².

Os alvos sociais usados na Figura 1 são camundongos da linhagem CD1 do mesmo sexo, mas alcançamos o reconhecimento de identidade com valência comparável usando alvos C57BL / 6 da mesma cepa. Assim, desenvolvemos um método facilmente adotável, que pode ser empregado para o estudo posterior do processamento de valência social, identidade social e déficits dessas funções cognitivas sociais em modelos animais de doenças cerebrais.

Os paradigmas de reconhecimento de identidade analisam a memória de indivíduos específicos. Ao projetar os experimentos, deve-se ter o cuidado de garantir que as sessões de treinamento e teste sejam totalmente diferentes e que a única pista mantida constante seja a identidade dos alvos sociais. Por exemplo, as salas onde o treinamento e o teste são realizados, os recintos que contêm as metas sociais e as dicas associadas aos contextos de treinamento e teste devem ser diferentes.

Os quatro copos de arame devem ser idênticos entre si, mas o mais diferentes possível dos invólucros de plexiglass. Os copos e invólucros de arame devem ser diferentes em termos de material (por exemplo, plexiglass vs. metal), forma (por exemplo, retangular vs. circular) e cor (por exemplo, transparente vs. ouro rosa). Isso é feito para garantir que a única pista que informa o comportamento exploratório durante o teste seja a identidade dos alvos sociais.

A habituação ao contexto é realizada no dia 1 do treinamento. Isso é feito para incentivar a exploração de metas sociais durante o treinamento, e não o contexto, que já será conhecido pelo rato em questão. Além disso, recomenda-se pelo menos 2 h de tempo de espera entre as sessões de treinamento com valência e neutro. Acredita-se que fornecer ao sujeito tempo entre as sessões de treinamento reduza a generalização, pois as experiências alocadas mais próximas no tempo têm maior probabilidade de serem vinculadas²³. Por esse mesmo motivo, o treinamento é repetido, mas contrabalançado em ordem, nos dias subsequentes. Acredita-se que a repetição encoraje a associação adicional da experiência com o respectivo alvo social. Idealmente, mais tempo entre as sessões de treinamento pode permitir que os ratos em questão aprendam a associar o alvo social à sua respectiva experiência de valência. Para fins práticos, o período de espera foi decidido ser de 2 h, pois permitia que as sessões de treinamento neutras e com valência ocorressem em 1 dia em uma coorte de 8 a 12 camundongos. Por exemplo, o treinamento de 12 camundongos pode levar aproximadamente 2 horas, momento em que o camundongo que foi treinado primeiro estaria pronto para iniciar a próxima sessão de treinamento. Obviamente, aumentar o período de espera pode melhorar o desempenho dos camundongos, mas consumirá mais tempo para o experimentador.

Os camundongos sujeitos e os alvos sociais devem chegar ao biotério pelo menos 7 dias antes do início do treinamento comportamental para minimizar a influência do estresse de transporte. As metas sociais devem ser alojadas individualmente, pois as pistas olfativas dos companheiros de gaiola podem prejudicar o reconhecimento de identidade. Os mesmos dois alvos sociais podem ser usados para uma coorte de até 12 camundongos sujeitos. É importante ressaltar que os alvos sociais devem ser devolvidos à sua gaiola durante cada período de limpeza e configuração entre os camundongos sujeitos. É importante devolver os alvos sociais às suas gaiolas, pois o confinamento prolongado nos recintos pode alterar seu comportamento e, por sua vez, influenciar a decisão dos camundongos sujeitos de interagir.

Camundongos sujeitos e alvos sociais podem ser coespecíficos da mesma cepa ou de cepas diferentes. Se forem usados alvos sociais da mesma linhagem, é fundamental que eles não sejam da mesma ninhada que os camundongos sujeitos e os alvos sociais não sejam familiares uns aos outros. Isso pode ser garantido solicitando camundongos sujeitos e alvos sociais de diferentes fornecedores de animais ou encomendando animais de idades ligeiramente diferentes (ou seja, camundongos sujeitos de 8 semanas e alvos sociais de 7 semanas). Se forem necessários procedimentos de marcação auricular, eles devem ser realizados pelo menos 24 horas antes do início do treinamento comportamental. Isso é para minimizar a influência de estressores externos sobre o comportamento do rato do sujeito. Para todos os treinamentos e testes comportamentais, é recomendável trabalhar com um mouse de cada vez. Embora o treinamento e o teste simultâneos de camundongos com vários indivíduos possam economizar tempo, também aumentam as pistas olfativas na sala experimental que podem influenciar a codificação ou a recuperação do reconhecimento de identidade. Como tal, recomendamos coortes de 8 a 12 camundongos. Para experimentos de valência social positiva, recomenda-se manusear os animais diariamente antes do treinamento para minimizar o estresse de manuseio, o que pode desencorajar o consumo de novos alimentos. Também é recomendado colocar 2-3 pellets de alimento de sacarose por camundongo na gaiola doméstica por 3 dias antes da habituação para facilitar o processo de habituação.

Embora os dados apresentados tenham sido pontuados manualmente, existem opções fáceis de usar e automatizadas para análise comportamental e podem ser aplicadas para a pontuação mais eficiente das interações sociais em vídeos de treinamento e teste. Por exemplo, o DeepLabCut é um software que emprega redes neurais treinadas pelo usuário para a anotação sem marcadores da posição do animal e pode ser otimizado para a identificação precisa de quadros que satisfazem o comportamento investigativo²⁴.

Outros experimentos de controle podem ser empregados para verificar se os protocolos de reconhecimento de identidade bem-sucedidos foram alcançados¹². A inversão da ordem de treinamento deve continuar a provocar o reconhecimento de identidade e confirmar que os resultados não são devidos à ordem de treinamento com valência e neutro. O treinamento também pode ser conduzido conforme descrito, mas o teste pode ocorrer com o alvo neutro e um novo alvo social, onde o aumento da interação com o novo alvo sugeriria que os camundongos sujeitos têm uma memória social para o alvo neutro e reconheceram que é familiar. Da mesma forma, testes com dois novos camundongos sujeitos podem ser feitos para confirmar que os comportamentos de evitação ou abordagem são, de fato, específicos para os alvos sociais com valência negativa e positiva, respectivamente. Embora atualmente não tenha sido testado se o mesmo camundongo sujeito pode passar por treinamento de valência social negativa e positiva, acreditamos que é possível se os experimentadores tiverem acesso a várias linhagens-alvo sociais ou contextos de treinamento. Usar a mesma linhagem de alvos sociais para experimentos de valência positiva e negativa pode complicar a associação de uma cepa com uma valência específica. Se possível, o uso de diferentes linhagens-alvo sociais pode encorajar a exploração e evitar a generalização entre experiências positivas e negativas. Da mesma forma, a reutilização dos mesmos contextos de treinamento aumentaria a generalização entre experiências de valência oposta e seria minimizada com o uso de contextos distintos para treinamento. Se o cronograma experimental permitir, separar os experimentos de valência positiva e negativa por algumas semanas também seria recomendado.

No caso de haver dificuldades em estabelecer os protocolos de reconhecimento de identidade, sugerimos soluções para problemas comumente encontrados que enfrentamos. Camundongos sujeitos a alojamento em grupo podem funcionar como treinamento de extinção, pois a valência associada a um alvo social se extingue após a interação normal do companheiro^{de gaiola 25}, mas é necessário, pois o isolamento social prejudica a memória social e altera o comportamento social^26,27. Na verdade, descobrimos que o alojamento único não eliminou o reconhecimento de identidade em camundongos machos. No entanto, um alojamento individual pode ser necessário se os animais estiverem se recuperando de cirurgias estereotáxicas ou tiverem implantes intracranianos que possam ser sensíveis ao descolamento. Nesses casos, alojamos com sucesso camundongos emparelhados em grandes gaiolas, separados por uma partição perfurada, e replicamos o reconhecimento de identidade nessa condição¹².

Para a tarefa de valência social positiva, é comum que os camundongos mostrem hesitação em consumir novos pellets de sacarose. Para resolver esse problema, é útil aumentar o tempo de privação de comida ou familiarizar os ratos com os pellets, colocando alguns pellets em sua gaiola doméstica por 2-3 dias antes da sessão de habituação. Em algumas situações em que a maioria dos ratos não consome pellets de comida, também pode ser útil aumentar o número de sessões de habituação. Embora tenhamos notado que os camundongos machos geralmente comeram menos durante a habituação de pellets de comida do que os camundongos fêmeas, isso não afeta sua capacidade de reconhecer o alvo social de valência positiva.

Finalmente, os parâmetros das tarefas de reconhecimento de identidade podem ser modificados para reduzir ou aumentar a dificuldade da tarefa. Por exemplo, para revelar o impacto sutil de fatores biológicos no reconhecimento de identidade, o tempo de treinamento e o número de sessões de treinamento podem ser reduzidos para aumentar a dificuldade da tarefa.

As tarefas comportamentais que apresentamos neste protocolo são simples, facilmente configuradas e adaptáveis a camundongos machos e fêmeas para estudar o reconhecimento de identidade. O uso flexível de estímulos apetitivos ou aversivos nessas tarefas também permite o exame do papel da valência social no reconhecimento da identidade. Essas tarefas serão úteis para estudar mecanismos biológicos de reconhecimento de identidade em camundongos saudáveis, ou déficits nesses mecanismos em modelos de camundongos relacionados a doenças que apresentam comprometimento social.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol
Black-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			neutral context, positive social valence experiment
C57BL/6 mice	Charles River, Jackson Laboratory		Social targets from Jackson Laboratory
Dustless precision pellets	BioServ	F05301	20 mg, chocolate flavor
Electric tape
Glass bottles (2)
hydrogen peroxide-based disinfectant
Plastic or cardboard			Non-conductive material for enclosure floor
Rectangular plexiglass enclosures (2, 10 cm x 5 cm x 30 cm)			Identical
Shock box (triangular, length of each side = 46 cm; height = 29 cm)
Silent timer
Single Output Scrambled Animal Shocker	Lafayette Instrument	HSCK100AP
three-chamber box (81 cm x 23 cm x 23 cm), with openings in the middle chamber that connect to the left and the right chambers			social discrimination testing
Transparent cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			Negative social valence
Transparent cage (26 cm x 47 cm x 21 cm)			Food habituation (positive social valence)
Webcam	Logitech	C920x
Weighing scale
white easel pad papers			floor of the neutral context
White noise generator			60 dB
White, plastic dish
White-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm) with a 1 cm diameter plastic tube as food port			positive social valence context
Wire cups (circular, four, 8 cm x 8 cm x 10 cm)