Поведенческие задачи для изучения распознавания идентичности у мышей

Резюме

Сопоставляя негативные или позитивно валентные переживания с отдельными социальными целями, мы разработали поведенческие задания для изучения распознавания идентичности мышей C57BL/6. Эти задачи позволяют изучить механизмы социальной памяти отдельных социальных мишеней на здоровых и связанных с заболеванием мышах с нарушениями социального познания.

Аннотация

Социальные животные, такие как грызуны, способны распознавать и различать личность знакомых людей. Распознавание идентичности знакомых людей важно для развития социальных структур, таких как иерархия, родство и семья. Однако механизмы, лежащие в основе признания социальной идентичности, остаются неясными. Большинство исследований социального признания на грызунах основаны на склонности грызунов к взаимодействию с новой социальной целью, феномене, известном как социальная новизна. Однако поведенческие задания на изучение социальной новизны не могут выявить узнавание знакомых сородичей на основе их идентичности. Здесь представлены поведенческие задачи, позволяющие изучить распознавание идентичности у мышей C57BL/6 путем связывания двух знакомых мышей с валентным опытом или без него. Испытуемые взаимодействовали с двумя мышами либо без (нейтрального), либо с валентным опытом (отрицательным или положительным) и знакомились с этими мышами. Мышь с отрицательной валентностью была связана с ударами током, в то время как мышь с отрицательной валентностью была связана с вознаграждением за пищу. После обучения распознавание идентичности этих знакомых мышей может быть выявлено в тесте на социальную дискриминацию, который представлен как предпочтение положительно валентной мыши и избегание отрицательно валентной мыши по сравнению с нейтральной мышью. Поведенческие задания на распознавание идентичности могут быть полезны для исследования механизмов социальной памяти и патофизиологии расстройств с нарушениями социального познания, таких как расстройство аутистического спектра или шизофрения.

Введение

Распознавание идентичности, или способность идентифицировать знакомых людей на основе предыдущего опыта, имеет решающее значение для выживания социальных животных¹. У грызунов социальная иерархия, распознавание партнера и потомства, территориальная оборона, а также создание и поддержание групп являются моделями поведения, обусловливающими успешное распознавание идентичности ^2,3. Современное понимание социальной памяти основано на исследованиях на грызунах, основанных на способности отличать новых сородичей от знакомых. Эти задачи были полезны для выявления областей мозга, которые, как считается, опосредуют социальную память, таких как гиппокампальный CA2⁴ и вентральные области CA1⁵. Тем не менее, такие исследования остаются ограниченными в выяснении механизмов, лежащих в основе признания идентичности, поскольку они ограничены категориальным признанием социальной новизны.

Распознавание идентичности было продемонстрировано независимо от социальной новизны с помощью ассоциативных парадигм обучения, в которых валентные значимые переживания связаны с одной из двух (или более) знакомых социальных целей. Эти задачи основаны на представлении о том, что социальные взаимодействия часто связаны с эмоциональным смыслом, где негативный опыт приводит к поведению, предотвращающему конфликты, в то время как игровое или заботливое взаимодействие, как правило, вознаграждается. Эмоциональный аффект, связанный с взаимодействием, называется социальной валентностью. Самцы золотистых хомяков были способны различать две знакомые родственные цели, когда одна из них ранее атаковала^их. Память на узнавание отдельных самцов крыс Вистар также была важна для установления социального ранга⁷.

Недавно распознавание идентичности было изучено на мышах C57BL/6, наиболее широко используемой линии мышей в исследованиях в области нейробиологии, путем связывания отдельных мышей C57BL/6 с^{аппетитными} стимулами или без них. Этот подход использовал мышей с фиксированной головой для прохождения сотен обучающих испытаний, что ограничило его использование для изучения естественного поведения свободно движущихся мышей. В других исследованиях распознавание идентичности мышей C57BL/6 поддерживалось предпочтением сородичей, получавших этанол ^9,10. Тем не менее, введение веществ может привести к путанице. Наконец, лишь немногие из этих исследований были использованы для изучения распознавания идентичности у грызунов обоих полов. Легко внедряемый метод, применимый как к самцам, так и к самкам мышей C57BL/6, является инструментом, имеющим решающее значение для дальнейшего изучения распознавания личности.

Здесь представлены парадигмы распознавания идентичности, которые могут быть использованы как у самцов, так и у самок мышей. Для изучения идентичности, независимой от эффектов новизны, используются две знакомые социальные цели, одна из которых связана с выраженным эмоциональным опытом, который, как предполагается, влияет на поведение взаимодействия. Для негативной ассоциации социальной валентности подход, аналогичный обусловливанию социального страха, был адаптирован для того, чтобы вызвать избегание в направлении конкретной социальной цели^. Если негативная социальная валентность, такая как аверсивный шок ногой, связана с индивидуумом, то следует ожидать снижения взаимодействия с социальной мишенью. И наоборот, если положительная социальная валентность, такая как желаемое вознаграждение, связана с конкретным индивидуумом, то при последующем тестировании можно ожидать увеличения взаимодействия с этой мышью. В совокупности изложенные поведенческие задачи могут быть легко применены в большинстве лабораторий для изучения распознавания идентичности у мышей C57BL/6 и других линий мышей.

протокол

В этом исследовании использовались взрослые самцы мышей C57BL/6 (в возрасте 8-10 недель; масса тела: 18-25 г). Мыши, используемые в качестве социальных мишеней, были получены из другого источника (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что они были из других пометов и ранее были незнакомы испытуемому мыши. Все протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными в Исследовательском центре Дугласа и соответствовали рекомендациям Канадского совета по уходу за животными (протокол No: DOUG-5935).

1. Материалы (см. Рисунок 1)

1. Установите большую прозрачную клетку (24 см x 36 см x 19,5 см) в качестве нейтрального контекста в эксперименте с негативной социальной валентностью
2. Используйте треугольный амортизатор с черными стенками (длина каждой стороны = 46 см; высота = 29 см) в качестве негативного валентного контекста. Убедитесь, что пол шоковой коробки состоит из металлических решеток, подключенных к генератору тока Scrambled Grid.
3. Используйте большую прозрачную клетку (26 см x 47 см x 21 см) в качестве контекста привыкания к пище в эксперименте с положительной социальной валентностью.
4. Используйте большую клетку с черными стенами (24 см x 36 см x 19,5 см) в качестве нейтрального контекста в эксперименте с позитивной социальной валентностью.
5. Используйте большую клетку с белыми стенками (24 см x 36 см x 19,5 см) с портом для еды в качестве положительного социального контекста. В качестве порта для еды используйте пластиковую трубку (диаметром 0,5 см), которая проходит через одну сторону стены, и поместите под нее белую пластиковую тарелку.
6. Предварительно вырезанные белые станковые блокноты для использования в качестве пола нейтрального контекста (нейтрального обучения как в негативных, так и в позитивных социальных валентных экспериментах) и позитивных социальных валентных контекстов. Отрежьте блокнот немного меньше нижней поверхности контекста, чтобы мышь не зарывалась под бумагу. Замените накладки мольберта между мышами о предмете съемки.
7. Используйте беспыльные прецизионные гранулы (20 мг, со вкусом шоколада) в качестве сигнала вознаграждения при взаимодействии с положительно валентной социальной целью.
8. Используйте весы для ежедневного взвешивания испытуемых мышей в течение всего эксперимента с положительной социальной валентностью.
9. Используйте трехкамерный ящик (81 см x 23 см x 23 см) с отверстиями в средней камере, которые соединяются с левой и правой камерами, для тестирования на социальную дискриминацию. Используйте съемные дверцы камеры, чтобы удерживать испытуемую мышь в средней камере между сеансами, предотвращая стресс от обработки.
10. Используйте два одинаковых прямоугольных корпуса из плексигласа (10 см x 5 см x 30 см) как для негативной, так и для позитивной социальной валентности.
11. Используйте четыре круглые проволочные чашки (8 см x 8 см x 10 см) для тестирования на социальную дискриминацию. Держите две проволочные чашки пустыми во время 1-й сессии теста на социальную дискриминацию. На занятии 2 поместите социальные цели, используемые в тренировке положительной или отрицательной социальной валентности, в две другие проволочные чашки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркируйте проволочные стаканчики (например, с помощью ленты), чтобы различать одинаковые проволочные стаканчики. В ходе эксперимента используйте проволочные стаканчики для одной и той же цели на протяжении всего эксперимента. Если внутри проволочного стаканчика необходимо разместить другой социальный объект, тщательно промойте его с мылом, водой и быстродействующим дезинфицирующим средством на основе перекиси водорода.
12. Поместите две стеклянные бутылки на перевернутые проволочные чашки во время тестирования на социальную дискриминацию, чтобы мыши не могли забраться на проволочные чашки.
13. Убедитесь, что в тренировочных помещениях есть полы из непроводящего материала для экспериментов с негативной социальной валентностью. Например, используйте пластик или картон, обмотанный изолентой, чтобы гарантировать, что отрицательно валентный социальный объект не получит ударов током во время тренировки.
14. Используйте тихий таймер, чтобы избежать внешних сигналов, которые могут повлиять на поведение животных.
15. Используйте веб-камеру с высоким разрешением (1 080 p/30 кадров в секунду), подключенную к ноутбуку, для фиксации поведения мыши во время тренировки и теста на социальную дискриминацию.
16. Используйте генератор белого шума, который генерирует статический белый шум с коэффициентом шума 60 дБ, измеренным в центре контекста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все поведенческие процедуры должны проводиться со статическим белым шумом на уровне 60 дБ, измеренным в центре контекста, чтобы замаскировать звуки окружающей среды, которые могут повлиять на поведение животных.
17. Используйте лампы красного света для всех поведенческих процедур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает темные условия окружающей среды, которые стимулируют исследования на мышах и позволяют визуализировать поведение животных на видеозаписях.
18. Очистите вольеры, как пустые, так и животные, между мышами с 70% этанолом, который быстро сохнет. Очистите контексты обучения и тестирования между испытуемыми мышами с помощью быстродействующего дезинфицирующего средства на основе перекиси водорода, чтобы устранить потенциальное влияние на поведение, которое обусловлено обонятельными сигналами от предыдущих испытуемых мышей.

2. Поведенческие процедуры

1. Негативная социальная валентность
   1. Привыкание к контексту
      1. Оборудуйте экспериментальную комнату белым шумом и окружающим красным светом на время эксперимента.
      2. Подготовьте шоковую коробку, поместив в центр пустой корпус из плексигласа с непроводящим полом.
      3. Поместите мышь в угол шоковой коробки и дайте ей свободно исследовать ее в течение 5 минут.
      4. Верните мышь в ее домашнюю клетку.
      5. Повторите приучение к шоковой коробке с оставшимися мышами.
      6. По крайней мере, через 1 час повторите процедуру привыкания к контексту (шаги 2.1.1.1-2.1.1.5) в нейтральном контексте.
   2. Тренировка отрицательной валентности
      1. Начинайте тренировку отрицательной валентности не менее чем через 1 ч после привыкания к обоим контекстам.
      2. Подготовьте амортизатор, установив ток на 0,3 мА.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая текущая настройка основана на используемом нами шоковом боксе и нашем экспериментальном дизайне (3 дня обучения). Эта настройка может быть изменена в соответствии с другими экспериментальными конструкциями (например, более сильный ток может быть использован в конструкциях с меньшим количеством обучающих испытаний).
      3. Поместите отрицательно валентную социальную мишень в корпус из плексигласа с непроводящим дном в центре амортизатора.
      4. Запустите запись видео и поместите мышь в угол шоковой коробки.
      5. Запустите таймер и позвольте мышке свободно исследовать.
      6. Через 4 и 4,5 минуты нанесите удар электрическим током длительностью 1 с.
         Примечание: Это обеспечивает достаточное время взаимодействия между испытуемой мышью и социальной мишенью до того, как вы испытаете аверсивные потрясения.
      7. Уберите мышь на 5 минуте и остановите запись и таймер.
      8. Верните мышь в ее домашнюю клетку.
      9. Продезинфицируйте шокер и повторите тренировку отрицательной валентности с оставшимися испытуемыми мышами.
   3. Нейтральное обучение
      1. Начинайте нейтральную тренировку не менее чем через 2 часа после тренировки отрицательной валентности.
      2. Поместите нейтральную социальную цель в вольер с непроводящим дном в центре контекста.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Непроводящее дно используется для того, чтобы негативный и нейтральный контексты имели идентичные контекстные сигналы. При тренировке на нейтральной трассе удар током не производится.
      3. Запустите запись видео и поместите мышь в угол нейтрального контекста.
      4. Запустите таймер и позвольте мышке свободно исследовать.
      5. Уберите мышь на 5 минуте и остановите запись и таймер.
      6. Верните мышь в ее домашнюю клетку.
   4. Порядок обучения
      1. День 1: После привыкания к обоим контекстам (шаг 2.1.1) проведите нейтральную тренировку (шаг 2.1.3) через 2 часа после тренировки отрицательной валентности (шаг 2.1.2).
      2. День 2: Повторите тренировку на 2-й день с обратным порядком тренировок (шаги 2.1.3, затем 2.1.2; т.е. выполните нейтральную тренировку, а затем тренировку с отрицательной валентностью через 2 часа).
      3. День 3: Повторите тренировку на 3-й день с обратным порядком тренировок (шаги 2.1.2, затем 2.1.3; т.е. тренировка с отрицательной валентностью, за которой следует тренировка нейтральной через 2 часа).
2. Позитивная социальная валентность
   1. Лишение пищи
      1. Взвешивайте каждую испытуемую мышь ежедневно в течение всего эксперимента.
         Примечание: Если в какой-то момент испытуемая мышь теряет более 15% от своей первоначальной массы тела, лишение пищи должно быть прекращено, а мышь должна быть исключена из дальнейших экспериментов.
      2. Обеспечьте 1 г обычного мышиного корма на каждую мышь в домашней клетке.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Испытуемые мыши размещаются в группах с 1 г корма на одну мышь. Например, если четыре мыши содержатся в группе, то в домашнюю клетку помещают 4 г корма.
      3. Повторяйте депривацию пищи ежедневно в течение всего эксперимента с положительной социальной валентностью (т.е. после каждого дня привыкания к пищевым гранулам, привыкания к контексту и тренировки положительной валентности).
   2. Приучение к сахарозе в пищевых гранулах
      1. Приучание к пище в гранулах начинают через 12 ч после начала лишения пищи.
      2. Оборудуйте экспериментальную комнату белым шумом и окружающим красным светом на время эксперимента.
      3. Поместите мышь в угол контекста привыкания к пище.
      4. Запустите таймер и подавайте 1 гранулу сахарозы в минуту в течение 10 минут.
      5. Уберите объект через 10 минут и верните мышь в свою домашнюю клетку.
      6. Запишите количество гранул сахарозы, съеденных испытуемой мышью.
      7. Повторите приучение сахарозы к пищевым гранулам в общей сложности 3 дня.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше дней привыкания, если мыши не будут употреблять гранулы сахарозы в течение 3 дней.
      8. Исключите из исследования субъектов, которые не употребляли сахарозу в гранулах во время привыкания к пищевым гранулам.
   3. Привыкание к контексту
      1. На следующий день после привыкания к сахарозе с помощью гранул сахарозы (день 4) подготовьте положительный валентный контекст, поместив пустой корпус из плексигласа в углу контекста.
      2. Поместите мышь в угол положительного валентного контекста и позвольте мыши свободно исследовать его в течение 10 минут.
      3. Верните мышь в ее домашнюю клетку.
      4. Повторите привыкание к положительному валентному контексту с оставшимися мышами.
      5. По крайней мере, через 1 час повторите процедуру привыкания к контексту в нейтральном контексте.
   4. Тренировка положительной валентности
      1. Начинайте тренировку положительной валентности не менее чем через 1 ч после привыкания к обоим контекстам.
      2. Поместите позитивно валентную социальную цель в оболочке в центр позитивного валентного контекста.
      3. Запустите запись видео и поместите мышь в угол положительного валентного контекста.
      4. Запустите таймер и позвольте мыши свободно исследовать объект в течение 10 минут.
      5. При каждом взаимодействии с социальной целью, которая составляет >2 с, доставляйте через пищевой порт 1 гранулу сахарозы. Взаимодействие определяется как периоды, когда нос мыши находится на расстоянии <2 см от периферии плексигласового корпуса. Угол наклона головы объекта должен быть направлен в сторону вольера.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Тыканье в нос и сопение могут иметь место, но они не являются обязательными для доставки гранул сахарозы.
      6. Уберите мышь на 10 минут и остановите запись и таймер.
      7. Верните мышь в ее домашнюю клетку.
      8. Запишите количество гранул сахарозы, доставленных через порт для пищевых продуктов, и количество гранул, съеденных мышью.
      9. Замените пол мольберта, продезинфицируйте позитивный контекст и повторите тренировку положительной валентности с оставшимися испытуемыми мышами.
   5. Нейтральное обучение
      1. Начните тренировку нейтральной позиции не менее чем через 2 часа после тренировки положительной валентности.
      2. Поместите нейтральную социальную цель в ограждение в углу нейтрального контекста.
      3. Запустите запись видео и поместите мышь в угол нейтрального контекста.
      4. Запустите таймер и позвольте мыши свободно исследовать объект в течение 10 минут.
      5. Уберите мышь на 10 минут и остановите запись и таймер.
      6. Верните мышь в ее домашнюю клетку.
      7. Замените пол мольберта, продезинфицируйте оборудование и повторите нейтральную тренировку с оставшимися испытуемыми мышами.
   6. Порядок обучения
      1. Дни 1-3: Проведите приучение к пищевым гранулам (шаг 2.2.2).
      2. День 4: После привыкания к обоим контекстам (шаг 2.2.3) сначала проведите тренировку положительной валентности (шаг 2.2.4), а затем нейтральную тренировку (шаг 2.2.5) через 2 часа.
      3. День 5: Повторите тренировку на 5-й день с обратным порядком тренировок (шаги 2.2.5, затем 2.2.4; т.е. нейтральная тренировка с последующей тренировкой положительной валентности через 2 часа).
3. Тест на социальную дискриминацию
   1. Оборудуйте экспериментальное помещение белым шумом и окружающим красным светом.
   2. Транспортируйте испытуемых в экспериментальное помещение и обеспечьте беспрепятственное пребывание в помещении в течение не менее 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что социальные цели остаются за пределами экспериментальной комнаты в течение периода привыкания.
   3. На занятии 1 поместите две пустые проволочные чашки в противоположные углы левой и правой камер трехкамерного ящика для социальной дискриминации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одинаковые большие утяжеленные предметы (например, стеклянные бутылки) размещаются на проволочных чашках, чтобы мышь не забралась на проволочную чашку.
   4. Запустите запись видео, поместите мышь в центр средней камеры и запустите таймер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, выйдите из комнаты, чтобы свести к минимуму вмешательство экспериментатора в работу мышей.
   5. Через 8 минут вернитесь в комнату для тестирования и, не прикасаясь к мыши-испытуемому, используйте дверцы камеры, чтобы заключить испытуемого в среднюю камеру.
   6. Замените пустые проволочные стаканчики на идентичный, но другой набор стаканчиков, содержащих социальные цели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Социальные цели – это те, которые используются в тренинге негативной или позитивной социальной валентности.
   7. Уберите дверцы камеры и запустите таймер, пока мышь исследует объект в сеансе 2.
   8. Через 8 минут остановите запись и верните мышь и социальные объекты в соответствующие домашние клетки.
   9. Очистите чашки 70% этанолом и очистите арену дезинфицирующим средством.
   10. Повторите тестирование на социальную дискриминацию (шаги 2.3.3-2.3.9) с оставшимися мышами.
   11. После того, как половина когорты завершит тестирование, уравновесьте расположение проволочной чашки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Социальные цели должны перемещаться с помощью соответствующих проволочных чашек, чтобы предотвратить конфликт обонятельных сигналов.
   12. Промойте все проволочные стаканчики водой с мылом и дезинфицирующим средством. Очистите трехкамерный бокс для социальной дискриминации дезинфицирующим средством.

3. Поведенческий анализ

1. Тренировка
   1. Анализируйте время взаимодействия с каждой социальной целью и оценивайте количество сеансов взаимодействия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ может быть проведен вручную (голова животного на расстоянии <2 см от периферии вольера и угол наклона головы 180°) или с помощью автоматизированной программы.
   2. Запишите количество пищевых гранул, съеденных во время тренинга позитивной социальной валентности, чтобы убедиться, что изменения в социальном поведении не связаны с различиями в мотивации к потреблению пищевых вознаграждений.
2. Тест на социальную дискриминацию
   1. Измерьте количество времени, в течение которого мышь исследует каждую чашку. Непрерывный тест продолжительностью 8 минут начинается после того, как экспериментатор покидает комнату.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ может быть выполнен вручную (голова животного на расстоянии <2 см от периферии проволочной чашки и угол наклона головы 180°) или с помощью автоматизированной программы.
   2. Рассчитывайте попарный анализ, чтобы лучше фиксировать отдельные изменения во время тестовых сеансов. Дополнительно проведите двустороннее повторное измерение ANOVA (с коэффициентами сеанса и чашки) для выявления различий между сессиями при исследовании.

Результаты

Мы использовали задания на положительную и отрицательную социальную валентность для оценки распознавания идентичности у мышей C57BL/6 (рис. 2). По сравнению с 1-м днем привыкания к сахарозе к пищевым гранулам (H1, рисунок 2B), большинство мышей потребляли все данные гранулы к последнему дню привыкания к пище (H3). Во время тренировочных сессий (T1 и T2) испытуемые мыши познакомились с двумя мышами CD1: нейтральной (Neu) и положительно-валентно-ассоциированной мышью (PV), взаимодействуя с ними по отдельности в разных контекстах. Пищевые награды выдавались испытуемым мышам только после взаимодействия с мышью PV. В ходе задания на социальную дискриминацию мы обнаружили, что обученные мыши предпочитали взаимодействовать с PV-мышью по сравнению с нейтральной мышью (* p < 0,05, парный t-критерий Стьюдента). Соотношение времени взаимодействия в сеансе 2 по сравнению с взаимодействием в сеансе 1 также показало предпочтение в пользу мыши PV (* p < 0,05, парный t-критерий Стьюдента).

Мы также использовали задачу отрицательной социальной валентности для изучения распознавания идентичности (рисунок 2C). Испытуемые мыши познакомились с двумя мышами CD1: Neu и отрицательной валентно-ассоциированной мышью (NV), взаимодействуя с ними по отдельности в разных контекстах. Два удара электрическим током были нанесены ближе к концу сеанса взаимодействия с мышью NV, в то время как после взаимодействия с мышью Neu удары током не были нанесены. Мы не обнаружили различий во времени взаимодействия между испытуемыми мышами и мышами Neu или NV в каждый день обучения. Тем не менее, мы обнаружили, что испытуемые мыши сократили время взаимодействия с мышью NV во время теста на социальную дискриминацию (* p < 0,05, парный t-критерий Стьюдента). Межсессионное соотношение времени взаимодействия в сеансе 2 по сравнению с взаимодействием в сеансе 1 также выявило предпочтение в пользу мыши Neu (* p < 0,05, парный t-критерий Стьюдента).

Рисунок 1: Аппаратура для задач распознавания личности. (А) Нейтральный валентный контекст для негативного социального валентного теста. Белая бумага для мольберта помещена в нижнюю часть контекста. (B) Позитивный социальный валентный контекст. Обратите внимание на порт для еды (стрелка) в середине дна коробки. (C) Нейтральный валентный контекст для положительного тестирования социальной валентности. (D) Контекст привыкания к пище. Порт для подачи еды установлен с правой стороны коробки, как показано в буквах E (пунктирный круг) и F (увеличенный). (G) Амортизатор. (H) Корпус из плексигласа. (I) Проволочная чашка. (J) Трехкамерный ящик для проверки социальной дискриминации. Съемные дверцы камеры для размещения мыши в центральной камере показаны буквой K (стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Дизайн и ожидаемые результаты задач по распознаванию личности. (A) Принципиальные диаграммы позитивных (вверху) и негативных социальных валентных версий задач на распознавание идентичности (внизу). Мышей C57BL/6 обучали ежедневному взаимодействию с нейтральными (мышиный Neu) и валентно-ассоциированными социальными целями (мышиный PV или NV). На следующий день после обучения испытуемых мышей поместили в трехкамерный аппарат для проведения теста на социальную дискриминацию. Мы ожидаем, что после положительной и отрицательной тренировки социальной валентности испытуемые мыши будут проявлять предпочтение и избегание в сторону положительно валентных (зеленый, мышиный PV) и отрицательно валентных мышей (красный, мышиный NV) соответственно. (B) Репрезентативные данные эксперимента по обучению положительной социальной валентности. Испытуемые мыши были обучены взаимодействовать с положительно валентной мышью (мышь PV) и нейтральной мышью (мышь Neu) ежедневно в течение 2 дней. Порядок взаимодействия был обратным на 2-й день. Слева: Гистограммы показывают процент потребляемых гранул сахарозы во время привыкания (H1–3, которые представляют дни привыкания 1–3) и тренировки (T1–2, которые представляют дни обучения 1–2) с мышиной PV. Справа: Гистограммы показывают увеличение времени социального взаимодействия с положительно валентной мышиной PV во время теста на социальную дискриминацию. Межсессионное соотношение (время взаимодействия в сеансе 2/время взаимодействия в сеансе 1) выявило предпочтение положительно валентной мыши PV. * p < 0,05, парный t-критерий Стьюдента. (C) Репрезентативные данные эксперимента по обучению отрицательной социальной валентности. Испытуемые мыши были обучены взаимодействовать с отрицательновалентной мышью (мышь NV) и нейтральной мышью (мышь Neu) ежедневно в течение 3 дней. Порядок взаимодействия менялся на противоположный ежедневно. Слева: Гистограммы показывают время взаимодействия с мышью Neu и NV в разные дни обучения. Справа: Гистограммы показывают уменьшение времени социального взаимодействия с отрицательно валентной мышиной NV во время теста на социальную дискриминацию. Соотношение промежуточных сеансов показало избежание отрицательно валентного НВ у мышей. * p < 0,05, парный t-критерий Стьюдента. Сокращения: Neu = нейтральный; PV = положительная валентность; NV = отрицательная валентность; H = привыкание; T = обучение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Парадигмы распознавания идентичности были разработаны таким образом, чтобы их можно было легко внедрить в лабораториях с минимальным специализированным оборудованием и небольшим количеством тренингов в течение недели. Альтернативные валентные переживания могут быть использованы в зависимости от имеющихся ресурсов и желаемого исследовательского вопроса. Например, отрицательное валентное распознавание идентичности после атак агрессивной социальной цели было впервые описано у золотых хомяков и адаптировано к мышам в нашей модели ^6,12.

Валентные парадигмы распознавания идентичности могут иметь более широкое применение в области социальной памяти. Эти задачи могут быть использованы не только для дальнейшего изучения социальной памяти или механизмов социальной валентности, но и для изучения моделей заболеваний, о которых известно, что они имеют нарушения социального узнавания. Нарушения в распознавании идентичности лежат в основе дефицита социального поведения при таких расстройствах, как шизофрения^13,14,15 и расстройство аутистического спектра 16,17,18, где было подсчитано, что треть взрослых с аутизмом испытывают трудности с распознаванием личности по лицу ¹⁹. Например, мыши с нокаутом Shank3 и Df(16)A^+/- являются мышиными моделями с расстройством аутистического спектра и шизофренией, которые, как известно, демонстрируют нарушение социального познания 20,21,22. Наши новые парадигмы могут восполнить дефицит социальной памяти и быть приняты для характеристики моделей заболеваний и выявления манипуляций или методов лечения, которые улучшают дефицит социального поведения. Неодушевленные предметы также могут быть изучены в качестве замены социальных целей для дальнейшего анализа механизмов, поддерживающих объект, по сравнению с социальным признанием¹².

Социальные мишени, используемые на рисунке 1 , являются мышами однополой линии CD1, но мы достигли сопоставимого валентного распознавания идентичности с использованием мишеней C57BL/6 того же штамма. Таким образом, мы разработали легко адаптируемый метод, который может быть использован для дальнейшего изучения процессинга социальной валентности, социальной идентичности и дефицита этих социальных когнитивных функций в животных моделях заболеваний мозга.

Парадигмы распознавания идентичности рассматривают память конкретных людей. При планировании экспериментов необходимо позаботиться о том, чтобы тренинги и тестовые сессии были совершенно разными и чтобы единственным постоянным сигналом была идентичность социальных целей. Например, помещения, в которых проводятся тренинги и тестирование, вольеры, в которых находятся социальные цели, и сигналы, связанные с контекстами обучения и тестирования, должны быть разными.

Четыре проволочные чашки должны быть идентичны друг другу, но максимально отличаться от корпусов из плексигласа. Проволочные чашки и корпуса должны отличаться по материалу (например, плексиглас или металл), форме (например, прямоугольный или круглый) и цвету (например, прозрачный или розовый золото). Это делается для того, чтобы гарантировать, что единственным сигналом, информирующим об исследовательском поведении во время тестирования, является идентичность социальных целей.

Привыкание к контексту проводится в 1-й день обучения. Это делается для того, чтобы стимулировать изучение социальных целей во время обучения, а не контекста, который уже будет известен испытуемой мыши. Кроме того, рекомендуется не менее 2 часов ожидания между валентными и нейтральными тренировочными сессиями. Считается, что предоставление испытуемым мышам времени между тренировочными сессиями снижает обобщение, поскольку опыт, распределенный ближе по времени, с большей вероятностью будет связан^между собой. По этой же причине тренировки повторяются, но уравновешиваются по порядку, в последующие дни. Считается, что повторение способствует дальнейшей ассоциации переживания с соответствующей социальной целью. В идеале, большее количество времени между тренировочными сессиями может в дальнейшем позволить испытуемым мышам научиться ассоциировать социальную цель с их соответствующим валентным опытом. Для практических целей период ожидания был выбран равным 2 часам, так как это позволяло проводить как нейтральные, так и валентные тренировки в течение 1 дня в когорте из 8-12 мышей. Например, обучение 12 мышей может занять примерно 2 часа, после чего испытуемая мышь, которая была обучена первой, будет готова начать следующую тренировочную сессию. Конечно, увеличение периода ожидания может улучшить производительность испытуемых мышей, но будет более трудоемким для экспериментатора.

Испытуемые мыши и социальные объекты должны прибыть в помещение для животных не менее чем за 7 дней до начала поведенческой дрессировки, чтобы свести к минимуму влияние транспортного стресса. Социальные цели должны быть одноместными, так как обонятельные сигналы от кагематов могут ухудшить узнаваемость идентичности. Те же две социальные цели могут быть использованы для когорты до 12 испытуемых мышей. Важно отметить, что социальные объекты должны возвращаться в свою домашнюю клетку во время каждой уборки и установки между мышами. Важно вернуть социальных объектов в их домашние клетки, так как длительное содержание в вольерах может изменить их поведение и, в свою очередь, повлиять на решение мышей-испытуемых взаимодействовать.

Испытуемые мыши и социальные объекты могут быть сородичами одной и той же или разных линий. Если используются социальные мишени одного и того же штамма, очень важно, чтобы они не были из того же помета, что и испытуемые мыши, и социальные мишени должны быть незнакомы друг другу. Это может быть обеспечено путем заказа мышей-субъектов и социальных целей у разных поставщиков животных или при заказе животных немного разного возраста (т. е. 8-недельных мышей-подопытных и 7-недельных социальных целей). Если требуются процедуры мечения ушей, их следует проводить не менее чем за 24 часа до начала поведенческой дрессировки. Это необходимо для минимизации влияния внешних стрессоров на поведение испытуемой мыши. Для всех поведенческих тренировок и тестов рекомендуется работать с одной мышью за раз. Несмотря на то, что одновременное обучение и тестирование мышей с несколькими субъектами может сэкономить время, это также увеличивает обонятельные сигналы в экспериментальной комнате, которые могут повлиять на кодирование или вспоминание идентичности. Таким образом, мы рекомендуем когорты из 8-12 испытуемых мышей. Для экспериментов с положительной социальной валентностью рекомендуется ежедневно работать с животными перед дрессировкой, чтобы свести к минимуму стресс при обращении, который может отпугнуть потребление новых продуктов питания. Также рекомендуется поместить 2-3 гранулы сахарозы на каждую мышь в домашнюю клетку за 3 дня до привыкания, чтобы облегчить процесс привыкания.

Несмотря на то, что представленные данные были оценены вручную, существуют удобные для пользователя и автоматизированные варианты поведенческого анализа, которые могут быть применены для более эффективной оценки социальных взаимодействий в обучающих и тестовых видео. Например, DeepLabCut представляет собой программное обеспечение, использующее обученные пользователем нейронные сети для безмаркерного аннотирования положения животного и может быть оптимизировано для точной идентификации кадров, удовлетворяющих исследовательскому поведению²⁴.

Дальнейшие контрольные эксперименты могут быть использованы для проверки того, что протоколы распознавания личности были успешно выполнены¹². Изменение порядка обучения должно продолжать вызывать распознавание идентичности и подтверждать, что результаты не обусловлены порядком валентного и нейтрального обучения. Обучение также может проводиться в соответствии с описанием, но тестирование может проводиться с нейтральной и новой социальной мишенью, где повышенное взаимодействие с новой мишенью предполагает, что испытуемые мыши имеют социальную память на нейтральную цель и осознают, что она им знакома. Аналогичным образом, тестирование на двух новых мышах может быть проведено, чтобы подтвердить, что поведение избегания или приближения на самом деле специфично для негативных и позитивно валентных социальных целей соответственно. Хотя в настоящее время не проверяется, может ли одна и та же испытуемая мышь подвергаться как негативной, так и положительной социальной валентной тренировке, мы считаем, что это возможно, если экспериментаторы имеют доступ к нескольким социальным целевым штаммам или контекстам обучения. Использование одного и того же штамма социальных мишеней для экспериментов с положительной и отрицательной валентностью может усложнить ассоциацию штамма с определенной валентностью. Если это возможно, использование различных социальных целевых штаммов может стимулировать исследование и избежать обобщения между положительным и отрицательным опытом. Аналогичным образом, повторное использование одних и тех же обучающих контекстов усилило бы обобщение между противоположно валентными переживаниями и было бы сведено к минимуму за счет использования различных контекстов для обучения. Если график эксперимента позволяет, также рекомендуется разделить эксперименты с положительной и отрицательной валентностью на несколько недель.

В случае возникновения трудностей с установлением протоколов распознавания личности, мы предлагаем решения часто встречающихся проблем, с которыми мы столкнулись. Мыши-субъекты группового содержания могут функционировать как тренировка на вымирание, поскольку валентность, связанная с социальной целью, исчезает после нормального кагематного^{взаимодействия25}, но это необходимо, поскольку социальная изоляция ухудшает социальную память и изменяет социальное поведение^26,27. На самом деле, мы обнаружили, что одиночное жилье не вызывает распознавания идентичности у самцов мышей. Тем не менее, одноместное содержание может потребоваться, если животные восстанавливаются после стереотаксических операций или имеют внутричерепные имплантаты, которые могут быть чувствительны к отслойке. В таких случаях мы успешно разместили мышей в парах в больших клетках, разделенных перфорированной перегородкой, и воспроизвели распознавание идентичности в этом условии¹².

Для задачи положительной социальной валентности мыши, как правило, проявляют нерешительность в отношении потребления новых гранул сахарозы. Чтобы решить эту проблему, полезно увеличить время лишения пищи или познакомить мышей с гранулами, поместив несколько гранул в их домашнюю клетку за 2-3 дня до сеанса приучения. В некоторых ситуациях, когда большинство мышей не употребляют пищевые гранулы, также может быть полезно увеличить количество сеансов привыкания. Хотя мы заметили, что самцы мышей в целом ели меньше во время привыкания к пищевым гранулам, чем самки мышей, это не влияет на их способность распознавать положительно валентную социальную цель.

Наконец, параметры задач распознавания идентичности могут быть изменены для уменьшения или повышения сложности задачи. Например, чтобы выявить тонкое влияние биологических факторов на распознавание личности, время обучения и количество тренировочных сессий могут быть сокращены, чтобы увеличить сложность задачи.

Поведенческие задачи, которые мы представили в этом протоколе, просты, легко настраиваются и адаптируются к самцам и самкам мышей для изучения распознавания личности. Гибкое использование в этих задачах как аппетитных, так и аверсивных стимулов также позволяет изучить роль социальной валентности в узнавании идентичности. Эти задачи будут полезны для изучения биологических механизмов распознавания идентичности у здоровых мышей или дефицита этих механизмов в моделях мышей, связанных с заболеваниями, которые демонстрируют социальные нарушения.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol
Black-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			neutral context, positive social valence experiment
C57BL/6 mice	Charles River, Jackson Laboratory		Social targets from Jackson Laboratory
Dustless precision pellets	BioServ	F05301	20 mg, chocolate flavor
Electric tape
Glass bottles (2)
hydrogen peroxide-based disinfectant
Plastic or cardboard			Non-conductive material for enclosure floor
Rectangular plexiglass enclosures (2, 10 cm x 5 cm x 30 cm)			Identical
Shock box (triangular, length of each side = 46 cm; height = 29 cm)
Silent timer
Single Output Scrambled Animal Shocker	Lafayette Instrument	HSCK100AP
three-chamber box (81 cm x 23 cm x 23 cm), with openings in the middle chamber that connect to the left and the right chambers			social discrimination testing
Transparent cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			Negative social valence
Transparent cage (26 cm x 47 cm x 21 cm)			Food habituation (positive social valence)
Webcam	Logitech	C920x
Weighing scale
white easel pad papers			floor of the neutral context
White noise generator			60 dB
White, plastic dish
White-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm) with a 1 cm diameter plastic tube as food port			positive social valence context
Wire cups (circular, four, 8 cm x 8 cm x 10 cm)