Tâches comportementales pour l’examen de la reconnaissance d’identité chez la souris

Résumé

En associant des expériences à valence négative ou positive avec des cibles sociales individuelles, nous avons développé des tâches comportementales pour examiner la reconnaissance de l’identité des souris C57BL/6. Ces tâches permettent d’étudier les mécanismes de la mémoire sociale de cibles sociales individuelles dans des modèles murins sains et liés à la maladie avec une cognition sociale altérée.

Résumé

Les animaux sociaux, comme les rongeurs, sont capables de reconnaître et de différencier l’identité d’individus familiers. La reconnaissance de l’identité d’individus familiers est importante pour développer des structures sociales telles que la hiérarchie, la parenté et la famille. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la reconnaissance de l’identité sociale restent flous. La plupart des études sur la reconnaissance sociale chez les rongeurs sont basées sur la propension des rongeurs à interagir avec une nouvelle cible sociale, un phénomène connu sous le nom de nouveauté sociale. Cependant, les tâches comportementales pour l’examen de la nouveauté sociale ne peuvent pas révéler la reconnaissance de congénères familiers en fonction de leur identité. Sont présentées ici des tâches comportementales permettant d’examiner la reconnaissance d’identité chez les souris C57BL/6 en associant deux souris familières avec ou sans expérience valencée. Les sujets ont eu des interactions avec deux souris soit sans expérience (neutre), soit avec une expérience valencée (négative ou positive) et se sont familiarisés avec ces souris. La souris à valence négative était associée à des chocs, tandis que la souris à valence positive était associée à une récompense alimentaire. Après l’entraînement, la reconnaissance de l’identité de ces souris familières peut être révélée dans un test de discrimination sociale, qui est représenté par la préférence pour la souris à valence positive et l’évitement de la souris à valence négative par rapport à la souris neutre. Les tâches comportementales pour la reconnaissance de l’identité pourraient être utiles pour sonder les mécanismes de la mémoire sociale et la physiopathologie des troubles de la cognition sociale altérée, tels que les troubles du spectre autistique ou la schizophrénie.

Introduction

La reconnaissance de l’identité, ou la capacité d’identifier des individus familiers sur la base d’expériences antérieures, est essentielle à la survie des animaux sociaux¹. Chez les rongeurs, la hiérarchie sociale, la reconnaissance du partenaire et de la progéniture, la défense territoriale, l’établissement et le maintien de groupes sont des comportements qui incombent à la réussite de la reconnaissance identitaire ^2,3. La compréhension actuelle de la mémoire sociale est basée sur des études sur les rongeurs enracinées dans la capacité d’identifier des congénères nouveaux par rapport à des congénères familiers. Ces tâches ont été utiles pour découvrir des régions cérébrales qui sont censées médier la mémoire sociale, telles que l’hippocampe CA2⁴ et les régions CA1 ventrales⁵. Cependant, ces études restent limitées dans l’élucidation des mécanismes sous-jacents à la reconnaissance identitaire, car elles se limitent à la reconnaissance catégorique de la nouveauté sociale.

La reconnaissance de l’identité a été démontrée indépendamment de la nouveauté sociale via des paradigmes d’apprentissage associatif où les expériences saillantes valencées sont associées à l’une des deux (ou plus) cibles sociales familières. Ces tâches sont basées sur l’idée que les interactions sociales sont souvent liées à un sens émotionnel, où les expériences négatives entraînent des comportements de prévention des conflits, tandis que les interactions ludiques ou enrichissantes sont généralement gratifiantes. L’affect émotionnel attaché aux interactions est appelé valence sociale. Les hamsters dorés mâles étaient capables de faire la distinction entre deux cibles conspécifiques familières alors que l’une d’entre elles les avait précédemment attaqués⁶. La mémoire de reconnaissance des rats Wistar mâles individuels était également importante pour l’établissement du rang social⁷.

Récemment, la reconnaissance d’identité a été examinée chez des souris C57BL/6, la souche de souris la plus largement utilisée dans la recherche en neurosciences, en associant des souris C57BL/6 individuelles avec ou sans stimuli appétitifs⁸. Cette approche a utilisé des souris à tête fixe pour subir des centaines d’essais d’entraînement, ce qui a limité son utilisation pour examiner les comportements naturalistes chez les souris se déplaçant librement. Dans d’autres études, la reconnaissance de l’identité des souris C57BL/6 était étayée par la préférence des congénères administrés à l’éthanol ^9,10. Néanmoins, l’administration de substances pourrait introduire des facteurs de confusion. Enfin, peu de ces études ont été utilisées pour examiner la reconnaissance de l’identité chez les rongeurs des deux sexes. Une méthode facilement adoptable qui s’applique aux souris C57BL/6 mâles et femelles est un outil crucial pour faire avancer l’étude de la reconnaissance d’identité.

Nous présentons ici des paradigmes de reconnaissance d’identité qui peuvent être utilisés chez les souris mâles et femelles. Pour étudier l’identité indépendamment des effets de la nouveauté, deux cibles sociales familières sont utilisées, et l’une de ces cibles est associée à une expérience émotionnelle saillante qui est censée informer le comportement d’interaction. Pour l’association de valence sociale négative, une approche similaire au conditionnement social de la peur a été adaptée pour susciter l’évitement vers une cible sociale spécifique¹¹. Si une valence sociale négative, telle qu’un choc du pied aversif, est associée à un individu, une diminution de l’interaction avec la cible sociale serait attendue. À l’inverse, si une valence sociale positive, telle qu’une récompense appétitive, est associée à un individu spécifique, une interaction accrue avec cette souris serait attendue lors des tests ultérieurs. Prises ensemble, les tâches comportementales décrites peuvent être facilement appliquées dans la plupart des laboratoires pour l’étude de la reconnaissance d’identité chez les souris C57BL/6 et d’autres souches de souris.

Protocole

Des souris C57BL/6 mâles adultes (âgées de 8 à 10 semaines ; poids corporel : 18 à 25 g) ont été utilisées dans cette étude. Les souris utilisées comme cibles sociales ont été obtenues d’une source différente (voir le tableau des matériaux) pour s’assurer qu’elles provenaient de portées différentes et qu’elles n’étaient pas familières aux souris sujettes. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’établissement du Centre de recherche Douglas et ont suivi les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux (no de protocole : DOUG-5935).

1. Matériaux (voir figure 1)

1. Installez une grande cage transparente (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) pour être le contexte neutre dans l’expérience de valence sociale négative
2. Utilisez une boîte de choc triangulaire à paroi noire (longueur de chaque côté = 46 cm ; hauteur = 29 cm) comme contexte de valence négative. Assurez-vous que le sol de la boîte d’amortisseurs est constitué de grilles métalliques connectées à un générateur de courant de réseau brouillé.
3. Utilisez une grande cage transparente (26 cm x 47 cm x 21 cm) comme contexte d’accoutumance alimentaire dans l’expérience de valence sociale positive.
4. Utilisez une grande cage à parois noires (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) comme contexte neutre dans l’expérience de valence sociale positive.
5. Utilisez une grande cage à parois blanches (24 cm x 36 cm x 19,5 cm) avec un port de nourriture comme contexte social positif. Comme port alimentaire, utilisez un tube en plastique (0,5 cm de diamètre) qui passe par un côté de la paroi et placez un plat en plastique blanc sous le tube.
6. Des papiers de chevalet blancs prédécoupés à utiliser comme sol du contexte neutre (entraînement neutre dans les expériences de valence sociale négative et positive) et des contextes de valence sociale positive. Coupez le tampon légèrement plus petit que la surface inférieure du contexte pour éviter que la souris concernée ne s’enfouisse sous le papier. Replacez les coussinets de chevalet entre les souris sujettes.
7. Utilisez des granulés de précision sans poussière (20 mg, saveur chocolat) comme signal de récompense lors de l’interaction avec la cible sociale positive.
8. Utilisez une balance pour peser quotidiennement les souris sujettes pendant la durée des expériences de valence sociale positive.
9. Utilisez une boîte à trois chambres (81 cm x 23 cm x 23 cm), avec des ouvertures dans la chambre centrale qui relient les chambres gauche et droite, pour les tests de discrimination sociale. Utilisez des portes de chambre amovibles pour contenir la souris concernée dans la chambre centrale entre les sessions, évitant ainsi le stress de manipulation.
10. Utilisez deux boîtiers rectangulaires identiques en plexiglas (10 cm x 5 cm x 30 cm) pour l’entraînement social négatif et positif.
11. Utilisez quatre coupelles métalliques circulaires (8 cm x 8 cm x 10 cm) pour les tests de discrimination sociale. Gardez deux coupelles grillagées vides pendant la séance 1 du test de discrimination sociale. Dans la séance 2, placez les cibles sociales utilisées dans l’entraînement à valence sociale positive ou négative dans les deux autres bonnets métalliques.
    REMARQUE : Étiquetez les coupelles métalliques (par exemple, à l’aide de ruban adhésif) pour différencier les coupelles métalliques. Dans le cadre d’une expérience, utilisez les coupelles métalliques aux mêmes fins pendant toute la durée de l’expérience. Si une cible sociale différente doit être placée à l’intérieur du coupelle, nettoyez-la soigneusement avec du savon, de l’eau et un désinfectant à action rapide à base de peroxyde d’hydrogène.
12. Placez deux bouteilles en verre sur les gobelets métalliques renversés pendant les tests de discrimination sociale pour empêcher les souris concernées de grimper sur les gobelets métalliques.
13. S’assurer que les enceintes en formation ont des sols d’un matériau non conducteur pour les expériences de valence sociale négative. Par exemple, utilisez du plastique ou du carton recouvert de ruban isolant pour vous assurer que la cible sociale négative ne reçoit pas de chocs pendant l’entraînement.
14. Utilisez une minuterie silencieuse pour éviter les signaux externes qui pourraient interférer avec les comportements des animaux.
15. Utilisez une webcam haute résolution (1 080 p/30 ips) connectée à un ordinateur portable pour capturer le comportement de la souris pendant la formation et le test de discrimination sociale.
16. Utilisez un générateur de bruit blanc qui génère un bruit blanc statique à 60 dB mesuré au centre du contexte.
    REMARQUE : Toutes les procédures comportementales doivent être effectuées avec un bruit blanc statique à 60 dB mesuré au centre du contexte pour masquer les sons environnementaux susceptibles d’affecter le comportement des animaux.
17. Utilisez des lampes à lumière rouge pour toutes les procédures comportementales.
    REMARQUE : Cela fournit des conditions environnementales sombres, qui encouragent l’exploration chez les souris et permettent la visualisation du comportement des animaux dans les enregistrements vidéo.
18. Nettoyez les enclos, vides et contenant des animaux, entre les souris sujettes avec de l’éthanol à 70 %, qui sèche rapidement. Nettoyez les contextes d’entraînement et de test entre les souris sujettes avec un désinfectant à action rapide à base de peroxyde d’hydrogène afin d’éliminer les influences potentielles sur le comportement dues aux signaux olfactifs des souris sujets précédentes.

2. Procédures comportementales

1. Valence sociale négative
   1. Accoutumance au contexte
      1. Équiper la salle d’expérimentation d’un bruit blanc et d’une lumière rouge ambiante pour la durée de l’expérience.
      2. Préparez la boîte de choc en plaçant un boîtier en plexiglas vide avec un sol non conducteur au centre.
      3. Placez la souris concernée dans un coin de la boîte de choc et laissez-la explorer librement pendant 5 min.
      4. Renvoyez la souris dans sa cage d’origine.
      5. Répétez l’accoutumance à la boîte de choc avec les souris restantes.
      6. Au moins 1 h plus tard, répétez la procédure d’habituation au contexte (étapes 2.1.1.1-2.1.1.5) dans le contexte neutre.
   2. Entraînement à valence négative
      1. Commencer l’entraînement à valence négative au moins 1 h après l’accoutumance aux deux contextes.
      2. Préparez la boîte d’amortisseur en réglant le courant sur 0,3 mA.
         REMARQUE : Le réglage de courant recommandé est basé sur la boîte de choc que nous avons utilisée et notre conception expérimentale (3 jours de formation). Ce paramètre peut être modifié pour s’adapter à d’autres modèles expérimentaux (p. ex., un courant plus fort peut être utilisé avec des plans comportant moins d’essais d’entraînement).
      3. Placez la cible sociale à valence négative dans le boîtier en plexiglas avec un fond non conducteur au centre de la boîte de choc.
      4. Démarrez l’enregistrement vidéo et placez le sujet de la souris dans un coin de la boîte de choc.
      5. Démarrez le chronomètre et laissez la souris du sujet explorer librement.
      6. À 4 et 4,5 min, délivrez un choc électrique de 1 s.
         REMARQUE : Cela permet un temps d’interaction suffisant entre la souris concernée et la cible sociale avant de subir des chocs aversifs.
      7. Retirez le sujet de la souris au bout de 5 minutes et arrêtez l’enregistrement et la minuterie.
      8. Renvoyez la souris dans sa cage d’origine.
      9. Désinfectez la boîte de choc et répétez l’entraînement à valence négative avec les souris sujets restantes.
   3. Formation neutre
      1. Commencer l’entraînement neutre au moins 2 h après l’entraînement à valence négative.
      2. Placez la cible sociale neutre dans l’enceinte avec un fond non conducteur au centre du contexte.
         REMARQUE : Un fond non conducteur est utilisé pour s’assurer que les contextes négatif et neutre ont des repères de contexte identiques. Aucun choc n’est délivré lors d’un entraînement neutre.
      3. Démarrez l’enregistrement vidéo et placez le sujet de la souris dans un coin du contexte neutre.
      4. Démarrez le chronomètre et laissez la souris du sujet explorer librement.
      5. Retirez le sujet de la souris au bout de 5 minutes et arrêtez l’enregistrement et la minuterie.
      6. Renvoyez la souris dans sa cage d’origine.
   4. Ordre de la formation
      1. Jour 1 : Après l’accoutumance aux deux contextes (étape 2.1.1), effectuez l’entraînement neutre (étape 2.1.3) 2 h après l’entraînement à valence négative (étape 2.1.2).
      2. Jour 2 : Répétez l’entraînement le jour 2 avec un ordre d’entraînement inversé (étapes 2.1.3 puis 2.1.2 ; c’est-à-dire effectuer un entraînement neutre, puis un entraînement à valence négative 2 h plus tard).
      3. Jour 3 : Répétez l’entraînement le jour 3 avec un ordre d’entraînement inversé (étapes 2.1.2 puis 2.1.3 ; c’est-à-dire un entraînement à valence négative suivi d’un entraînement neutre 2 h plus tard).
2. Valence sociale positive
   1. Privation de nourriture
      1. Pesez chaque souris sujette quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience.
         REMARQUE : Si, à un moment donné, une souris sujette perd plus de 15 % de son poids corporel d’origine, la privation de nourriture doit être arrêtée et la souris doit être éliminée des expériences ultérieures.
      2. Fournissez 1 g de nourriture pour souris ordinaire par souris sujette dans la cage domestique.
         REMARQUE : Les souris sujettes sont logées en groupe avec 1 g de nourriture disponible par souris. Par exemple, si quatre souris sont hébergées en groupe, 4 g de nourriture sont placés dans la cage familiale.
      3. Répétez la privation de nourriture tous les jours pendant toute la durée de l’expérience de valence sociale positive (c’est-à-dire après chaque jour d’accoutumance aux granules de nourriture, d’accoutumance au contexte et d’entraînement à valence positive).
   2. Accoutumance aux pastilles alimentaires de saccharose
      1. Commencer l’accoutumance aux granulés de nourriture 12 h après le début de la privation de nourriture.
      2. Équiper la salle d’expérimentation d’un bruit blanc et d’une lumière rouge ambiante pour la durée de l’expérience.
      3. Placez la souris sujette dans un coin du contexte d’accoutumance alimentaire.
      4. Démarrez la minuterie et administrez 1 pastille de saccharose/min pendant 10 minutes.
      5. Retirez le sujet au bout de 10 minutes et remettez la souris dans sa cage d’origine.
      6. Notez le nombre de pastilles de saccharose consommées par la souris sujette.
      7. Répétez l’accoutumance aux pastilles de saccharose pendant un total de 3 jours.
         REMARQUE : Plus de jours d’habituation peuvent être ajoutés si les souris ne consomment pas de granulés de nourriture au saccharose après 3 jours.
      8. Retirez de l’étude les sujets qui ne consomment pas de granulés alimentaires de saccharose pendant l’accoutumance aux granulés alimentaires.
   3. Accoutumance au contexte
      1. Un jour après l’accoutumance aux pastilles alimentaires de saccharose (jour 4), préparez le contexte de valence positive en plaçant un boîtier en plexiglas vide dans un coin du contexte.
      2. Placez la souris concernée dans un coin du contexte de valence positive et laissez-la explorer librement pendant 10 min.
      3. Renvoyez la souris dans sa cage d’origine.
      4. Répétez l’habituation au contexte de valence positive avec les souris restantes.
      5. Au moins 1 h plus tard, répétez la procédure d’accoutumance au contexte neutre.
   4. Entraînement à valence positive
      1. Commencer l’entraînement à la valence positive au moins 1 h après l’accoutumance aux deux contextes.
      2. Placez la cible sociale à valence positive dans l’enceinte au centre du contexte de valence positive.
      3. Démarrez l’enregistrement vidéo et placez le sujet de la souris dans un coin du contexte de valence positive.
      4. Démarrez le chronomètre et laissez la souris du sujet explorer librement pendant 10 min.
      5. À chaque interaction avec la cible sociale qui est de >2 s, livrez 1 pastille de nourriture saccharose via le port de nourriture. L’interaction est définie comme des périodes où le nez de la souris en question se trouve à <2 cm de la périphérie de l’enceinte en plexiglas. L’angle de la tête du sujet doit être positionné vers le boîtier.
         REMARQUE : Le nez et le reniflement peuvent se produire, mais ne sont pas nécessaires pour l’administration de granulés de saccharose.
      6. Retirez le sujet de la souris au bout de 10 minutes et arrêtez l’enregistrement et la minuterie.
      7. Renvoyez la souris dans sa cage d’origine.
      8. Notez le nombre de granulés de saccharose livrés via le port d’alimentation et le nombre de granulés consommés par la souris concernée.
      9. Replacez le sol du coussin de chevalet, désinfectez le contexte positif et répétez l’entraînement de valence positive avec les souris du sujet restant.
   5. Formation neutre
      1. Commencer l’entraînement neutre au moins 2 h après l’entraînement à valence positive.
      2. Placez la cible sociale neutre dans l’enceinte, dans un coin du contexte neutre.
      3. Démarrez l’enregistrement vidéo et placez le sujet de la souris dans un coin du contexte neutre.
      4. Démarrez le chronomètre et laissez la souris du sujet explorer librement pendant 10 min.
      5. Retirez le sujet de la souris au bout de 10 minutes et arrêtez l’enregistrement et la minuterie.
      6. Renvoyez la souris dans sa cage d’origine.
      7. Replacez le sol du tapis de chevalet, désinfectez l’équipement et répétez l’entraînement neutre avec les souris restantes.
   6. Ordre de la formation
      1. Jours 1 à 3 : Effectuez l’habituation aux granulés de nourriture (étape 2.2.2).
      2. Jour 4 : Après l’accoutumance aux deux contextes (étape 2.2.3), effectuez d’abord un entraînement de valence positive (étape 2.2.4) suivi d’un entraînement neutre (étape 2.2.5) 2 h plus tard.
      3. Jour 5 : Répétez l’entraînement le jour 5 avec un ordre d’entraînement inversé (étapes 2.2.5 puis 2.2.4 ; c’est-à-dire un entraînement neutre suivi d’un entraînement à valence positive 2 h plus tard).
3. Test de discrimination sociale
   1. Équipez la salle d’expérimentation de bruit blanc et de lumière rouge ambiante.
   2. Transporter les sujets dans la salle d’expérimentation et permettre une accoudage non perturbée à la pièce pendant au moins 1 h.
      REMARQUE : Assurez-vous que les cibles sociales restent à l’extérieur de la salle d’expérimentation pendant la période d’accoutumance.
   3. Au cours de la séance 1, placez deux coupelles grillagées vides dans les coins opposés des chambres gauche et droite de la boîte à trois chambres pour la discrimination sociale.
      REMARQUE : Des objets identiques de grande taille (par exemple, des bouteilles en verre) sont placés sur le dessus des coupelles métalliques pour s’assurer que la souris concernée ne grimpe pas sur le dessus de la coupelle métallique.
   4. Démarrez l’enregistrement vidéo, placez le sujet de la souris au centre de la chambre centrale et démarrez le minuteur.
      REMARQUE : Si possible, sortez de la pièce pour minimiser les interférences de l’expérimentateur sur les souris sujets.
   5. Après 8 min, retournez dans la salle de test et, sans toucher la souris du sujet, utilisez les portes de la chambre pour enfermer le sujet dans la chambre du milieu.
   6. Remplacez les gobelets métalliques vides par un ensemble de gobelets identiques mais différents contenant les cibles sociales.
      REMARQUE : Les cibles sociales sont celles utilisées dans l’entraînement à valence sociale négative ou positive.
   7. Retirez les portes de la chambre et démarrez le chronomètre pendant que la souris du sujet explore dans la session 2.
   8. Après 8 min, arrêtez l’enregistrement et renvoyez la souris sujette et les cibles sociales dans leurs cages respectives.
   9. Nettoyez les gobelets avec de l’éthanol à 70 % et nettoyez l’arène avec un désinfectant.
   10. Répéter les tests de discrimination sociale (étapes 2.3.3 à 2.3.9) avec les souris autres sujets.
   11. Une fois que la moitié de la cohorte a terminé les tests, contrebalancez l’emplacement du bonnet métallique.
       REMARQUE : Les cibles sociales doivent être déplacées avec leurs coupelles métalliques respectives pour éviter les signaux olfactifs contradictoires.
   12. Nettoyez tous les gobelets métalliques avec du savon, de l’eau et un désinfectant. Nettoyez la boîte de discrimination sociale à trois chambres avec un désinfectant.

3. Analyse comportementale

1. Formation
   1. Analysez le temps d’interaction avec chaque cible sociale et notez le nombre de périodes d’interaction.
      REMARQUE : L’analyse peut être notée manuellement (tête de l’animal à <2 cm de la périphérie de l’enclos et angle de la tête de 180°) ou à l’aide d’un programme automatisé.
   2. Enregistrez le nombre de granulés de nourriture consommés pendant l’entraînement à valence sociale positive pour vous assurer que les changements dans les comportements sociaux ne sont pas dus à des différences de motivation à consommer des récompenses alimentaires.
2. Test de discrimination sociale
   1. Mesurez le temps pendant lequel la souris concernée examine chaque tasse. Une durée ininterrompue de 8 minutes du test commence une fois que l’expérimentateur quitte la pièce.
      REMARQUE : L’analyse peut être notée manuellement (tête de l’animal à <2 cm de la périphérie de la coupelle du fil et angle de tête de 180°) ou à l’aide d’un programme automatisé.
   2. Calculez des analyses par paires pour mieux saisir les modifications individuelles au cours des sessions de test. De plus, effectuez une ANOVA à mesures répétées dans les deux sens (avec les facteurs de la session et de la tasse) pour détecter les différences d’exploration entre les sessions.

Résultats

Nous avons utilisé les tâches de valence sociale positive et négative pour évaluer la reconnaissance de l’identité chez les souris C57BL/6 (Figure 2). Par rapport au jour 1 de l’accoutumance aux granules de nourriture au saccharose (H1, Figure 2B), la plupart des souris ont consommé tous les granulés donnés le dernier jour de l’habituation à la nourriture (H3). Au cours des séances d’entraînement (T1 et T2), les souris sujettes se sont familiarisées avec deux souris CD1 : neutre (Neu) et souris associée à la valence positive (PV) en interagissant avec elles séparément dans différents contextes. Les récompenses alimentaires n’ont été données aux souris sujettes qu’après l’interaction avec la souris PV. Au cours de la tâche de discrimination sociale, nous avons constaté que les souris entraînées préféraient interagir avec la souris PV par rapport à la souris neutre (* p < 0,05, test t de Student apparié). Le rapport entre les sessions du temps d’interaction de la session 2 par rapport à l’interaction de la session 1 a également révélé une préférence pour la souris PV (* p < 0,05, test t de Student apparié).

Nous avons également utilisé la tâche de valence sociale négative pour examiner la reconnaissance d’identité (Figure 2C). Les souris concernées se sont familiarisées avec deux souris CD1 : la souris Neu et la souris associée à la valence négative (NV) en interagissant avec elles séparément dans différents contextes. Deux chocs électriques ont été administrés vers la fin de la session d’interaction avec la souris NV, tandis qu’aucun choc n’a été administré après l’interaction avec la souris Neu. Nous n’avons pas trouvé de différences dans les temps d’interaction entre les souris sujettes et les souris Neu ou NV à chaque jour d’entraînement. Cependant, nous avons constaté que les souris sujettes réduisaient le temps d’interaction avec la souris NV pendant le test de discrimination sociale (* p < 0,05, test t de Student apparié). Le rapport entre les sessions du temps d’interaction de la session 2 par rapport à l’interaction de la session 1 a également révélé une préférence pour la souris Neu (* p < 0,05, test t de Student apparié).

Figure 1 : Appareil pour des tâches de reconnaissance d’identité. (A) Contexte de valence neutre pour les tests de valence sociale négative. Un bloc-notes de chevalet blanc est placé au bas du contexte. (B) Contexte de valence sociale positive. Notez le port d’alimentation (flèche) au milieu du bas de la boîte. (C) Contexte de valence neutre pour les tests de valence sociale positifs. (D) Contexte d’accoutumance alimentaire. Un port de livraison de nourriture est installé sur le côté droit de la boîte, comme indiqué en E (cercle pointillé) et F (agrandi). (G) Boîte d’amortisseur. (H) Boîtier en plexiglas. (I) Coupelle métallique. (J) Boîte à trois chambres pour le test de discrimination sociale. Les portes de chambre amovibles pour contenir la souris sujette dans la chambre centrale sont illustrées en K (pointes de flèches). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Conception et résultats attendus des tâches de reconnaissance d’identité. (A) Diagrammes schématiques de versions de valence sociale positive (en haut) et négative des tâches de reconnaissance d’identité (en bas). Les souris C57BL/6 ont été entraînées à interagir quotidiennement avec les cibles sociales neutres (souris Neu) et associées à la valence (souris PV ou NV). Un jour après l’entraînement, des souris sujettes ont été placées dans un appareil à trois chambres pour le test de discrimination sociale. Nous nous attendons à ce qu’après un entraînement à valence sociale positive et négative, les souris sujettes affichent une préférence et un évitement envers les souris à valence positive (vert, PV de souris) et les souris à valence négative (rouge, NV de souris), respectivement. (B) Données représentatives d’une expérience d’entraînement à valence sociale positive. Les souris sujettes ont été entraînées à interagir quotidiennement avec la souris à valence positive (souris PV) et la souris neutre (souris Neu) pendant 2 jours. L’ordre d’interaction a été inversé le jour 2. À gauche : Les histogrammes montrent le pourcentage de pastilles de saccharose consommées pendant l’accoutumance (H1 à 3 qui représentent les jours d’accoutumance 1 à 3) et l’entraînement (T1-2 qui représentent les jours d’entraînement 1 à 2) avec la PV de souris. À droite : Les histogrammes montrent l’augmentation du temps d’interaction sociale avec la souris PV à valence positive pendant le test de discrimination sociale. Le rapport d’intersession (temps d’interaction de la session 2/temps d’interaction de la session 1) a révélé la préférence pour la PV de la souris à valence positive. * p < 0,05, test t de Student apparié. (C) Données représentatives d’une expérience d’entraînement à valence sociale négative. Les souris sujettes ont été entraînées à interagir quotidiennement avec la souris à valence négative (souris NV) et la souris neutre (souris Neu) pendant 3 jours. L’ordre d’interaction était inversé quotidiennement. À gauche : Les histogrammes montrent le temps d’interaction avec les souris Neu et NV au cours des différents jours d’entraînement. À droite : Les histogrammes montrent la diminution du temps d’interaction sociale avec la souris NV à valence négative pendant le test de discrimination sociale. Le rapport d’intersession a révélé l’évitement de la souris NV à valence négative. * p < 0,05, test t de Student apparié. Abréviations : Neu = neutre ; PV = valence positive ; NV = valence négative ; H = accoutumance ; T = formation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les paradigmes de reconnaissance d’identité ont été conçus pour être facilement mis en œuvre dans les laboratoires avec un minimum d’équipement spécialisé et peu de sessions de formation en une semaine. D’autres expériences valencées peuvent être utilisées en fonction des ressources disponibles et de la question de recherche souhaitée. Par exemple, la reconnaissance d’identité à valence négative suite à des attaques d’une cible sociale agressive a été décrite pour la première fois chez les hamsters dorés et adaptée aux souris dans notre modèle ^6,12.

Les paradigmes de reconnaissance d’identité à valence peuvent avoir des applications plus larges dans le domaine de la mémoire sociale. Non seulement ces tâches peuvent être utilisées pour étudier davantage la mémoire sociale ou les mécanismes de valence sociale, mais elles peuvent également aider à l’étude de modèles de maladies connus pour avoir des troubles de la reconnaissance sociale. Les déficiences de la reconnaissance de l’identité sont à l’origine des déficits du comportement social dans des troubles tels que la schizophrénie^13,14,15 et les troubles du spectre autistique 16,17,18, où il a été estimé qu’un tiers des adultes autistes ont des difficultés à faire face à la reconnaissance de l’identité individuelle ¹⁹. Par exemple, les souris knock-out Shank3 et Df(16)A^+/- sont des modèles de souris atteintes de troubles du spectre autistique et de schizophrénie connues pour présenter une cognition sociale altérée 20,21,22^. Nos nouveaux paradigmes peuvent récapituler les déficits de mémoire sociale et être adoptés pour la caractérisation de modèles de maladies et l’identification de manipulations ou de traitements qui améliorent les déficits de comportement social. Les objets inanimés peuvent également être étudiés en remplacement des cibles sociales afin d’analyser davantage les mécanismes qui soutiennent l’objet, par rapport à la reconnaissance sociale¹².

Les cibles sociales utilisées dans la figure 1 sont des souris de même sexe de souche CD1, mais nous avons obtenu une reconnaissance d’identité à valence comparable en utilisant des cibles de la même souche C57BL/6. Ainsi, nous avons développé une méthode facilement adoptable, qui peut être utilisée pour l’étude plus approfondie du traitement de la valence sociale, de l’identité sociale et des déficits de ces fonctions cognitives sociales dans des modèles animaux de maladies cérébrales.

Les paradigmes de reconnaissance d’identité examinent la mémoire d’individus spécifiques. Lors de la conception des expériences, il faut veiller à ce que les sessions d’entraînement et de test soient entièrement différentes et que le seul indice maintenu constant soit l’identité des cibles sociales. Par exemple, les salles dans lesquelles se déroulent les formations et les tests, les enceintes qui contiennent les cibles sociales et les indices associés aux contextes de formation et de test doivent tous être différents.

Les quatre coupelles métalliques doivent être identiques les unes aux autres, mais aussi différentes que possible des boîtiers en plexiglas. Les coupelles et les boîtiers doivent être différents en termes de matériau (par exemple, plexiglas ou métal), de forme (par exemple, rectangulaire ou circulaire) et de couleur (par exemple, transparent ou or rose). Cela permet de s’assurer que le seul indice informant le comportement exploratoire pendant les tests est l’identité des cibles sociales.

L’habituation au contexte est effectuée le jour 1 de la formation. Ceci est fait pour encourager l’exploration des cibles sociales pendant l’entraînement plutôt que le contexte, qui sera déjà connu de la souris sujet. De plus, il est recommandé d’attendre au moins 2 h entre les séances d’entraînement valencées et neutres. On pense que le fait de donner aux souris sujettes du temps entre les séances d’entraînement réduit la généralisation, car les expériences allouées plus près dans le temps sont plus susceptibles d’être liées²³. Pour cette même raison, l’entraînement est répété, mais contrebalancé dans l’ordre, les jours suivants. La répétition est censée encourager l’association ultérieure de l’expérience avec la cible sociale respective. Idéalement, plus de temps entre les séances d’entraînement pourrait permettre aux souris sujettes d’apprendre à associer la cible sociale à leur expérience respective valencée. Pour des raisons pratiques, la période d’attente a été fixée à 2 h, car elle permettait de réaliser des séances d’entraînement neutres et valencées en 1 jour dans une cohorte de 8 à 12 souris. Par exemple, l’entraînement de 12 souris peut prendre environ 2 heures, après quoi la souris qui a été entraînée en premier serait prête à commencer la prochaine session d’entraînement. Bien sûr, l’augmentation de la période d’attente peut améliorer les performances des souris sujettes, mais prendra plus de temps pour l’expérimentateur.

Les souris sujettes et les cibles sociales doivent arriver à l’animalerie au moins 7 jours avant le début de l’entraînement comportemental afin de minimiser l’influence du stress du transport. Les cibles sociales doivent être logées à un seul logement, car les indices olfactifs des cagemates peuvent nuire à la reconnaissance de l’identité. Les deux mêmes cibles sociales peuvent être utilisées pour une cohorte d’un maximum de 12 souris sujets. Il est important de noter que les cibles sociales doivent être renvoyées dans leur cage d’accueil pendant chaque période de nettoyage et d’installation entre les souris sujettes. Il est important de renvoyer les cibles sociales dans leurs cages domestiques, car un confinement prolongé dans les enclos peut modifier leur comportement et, à son tour, influencer la décision des souris sujettes d’interagir.

Les souris sujettes et les cibles sociales peuvent être des congénères de souches identiques ou différentes. Si des cibles sociales de même souche sont utilisées, il est essentiel qu’elles ne soient pas de la même portée que les souris sujettes et que les cibles sociales ne se connaissent pas. Cela peut être assuré en commandant des souris sujettes et des cibles sociales auprès de différents fournisseurs d’animaux ou en commandant des animaux d’âges légèrement différents (c’est-à-dire des souris soumises de 8 semaines et des cibles sociales de 7 semaines). Si des procédures de marquage auditif sont nécessaires, elles doivent être effectuées au moins 24 heures avant le début de la formation comportementale. Il s’agit de minimiser l’influence des facteurs de stress externes sur le comportement de la souris sujette. Pour toutes les formations et tests comportementaux, il est recommandé de travailler avec une souris à la fois. Bien que l’entraînement et les tests simultanés de souris à sujets multiples puissent faire gagner du temps, ils augmentent également les indices olfactifs dans la salle d’expérience qui peuvent influencer l’encodage ou le rappel de la reconnaissance d’identité. En tant que tel, nous recommandons des cohortes de 8 à 12 souris sujets. Pour des expériences de valence sociale positive, il est recommandé de manipuler les animaux quotidiennement avant l’entraînement afin de minimiser le stress lié à la manipulation, qui peut décourager la consommation de nouveaux aliments. Il est également recommandé de placer 2 à 3 granulés de nourriture au saccharose par souris dans la cage domestique pendant 3 jours avant l’accoutumance pour faciliter le processus d’accoutumance.

Bien que les données présentées aient été notées manuellement, il existe des options conviviales et automatisées d’analyse comportementale qui peuvent être appliquées pour une notation plus efficace des interactions sociales dans les vidéos de formation et de test. Par exemple, DeepLabCut est un logiciel utilisant des réseaux neuronaux entraînés par l’utilisateur pour l’annotation sans marqueur de la position de l’animal et peut être optimisé pour l’identification précise des images satisfaisant le comportement d’investigation^24.

D’autres expériences de contrôle peuvent être utilisées pour vérifier que les protocoles de reconnaissance d’identité ont été mis en place¹². L’inversion de l’ordre de formation devrait continuer à susciter la reconnaissance de l’identité et à confirmer que les résultats ne sont pas dus à l’ordre de formation valencée et neutre. L’entraînement peut également être effectué comme décrit, mais des tests peuvent avoir lieu avec la cible sociale neutre et une nouvelle cible, où une interaction accrue avec la nouvelle cible suggérerait que les souris sujettes ont une mémoire sociale pour la cible neutre et ont reconnu qu’elle est familière. De même, des tests avec deux nouvelles souris sujettes peuvent être effectués pour confirmer que les comportements d’évitement ou d’approche sont, en fait, spécifiques aux cibles sociales à valeur négative et positive, respectivement. Bien qu’il ne soit actuellement pas testé si la même souris sujette peut subir à la fois un entraînement de valence sociale négative et positive, nous pensons que c’est possible si les expérimentateurs ont accès à plusieurs souches cibles sociales ou contextes d’entraînement. L’utilisation de la même souche de cibles sociales pour des expériences de valence positive et négative peut compliquer l’association d’une souche avec une valence particulière. Si possible, l’utilisation de différentes souches cibles sociales peut encourager l’exploration et éviter la généralisation entre les expériences positives et négatives. De même, la réutilisation des mêmes contextes d’entraînement augmenterait la généralisation entre les expériences de valence opposée et serait minimisée par l’utilisation de contextes distincts pour l’entraînement. Si la chronologie expérimentale le permet, il serait également recommandé de séparer les expériences de valence positive et négative de quelques semaines.

Dans le cas où il y aurait des difficultés à établir les protocoles de reconnaissance d’identité, nous suggérons des solutions aux problèmes fréquemment rencontrés auxquels nous avons été confrontés. Les souris sujettes hébergées en groupe peuvent fonctionner comme une formation d’extinction car la valence associée à une cible sociale s’éteint après une interaction normale entre compagnons de cage²⁵, mais est nécessaire car l’isolement social altère la mémoire sociale et modifie le comportement social^26,27. En fait, nous avons constaté que le logement unique ne suscitait pas de reconnaissance identitaire chez les souris mâles. Cependant, un logement simple peut être nécessaire si les animaux se remettent de chirurgies stéréotaxiques ou ont des implants intracrâniens qui peuvent être sensibles au détachement. Dans de tels cas, nous avons réussi à loger des souris par paires dans de grandes cages, séparées par une cloison perforée, et nous avons reproduit la reconnaissance d’identité dans cette condition¹².

Pour la tâche de valence sociale positive, il est courant que les souris hésitent à consommer de nouvelles pastilles de saccharose. Pour résoudre ce problème, il est utile d’augmenter le temps de privation de nourriture ou de familiariser les souris avec les granulés en mettant quelques granulés dans leur cage domestique pendant 2-3 jours avant la séance d’accoutumance. Dans certaines situations où la majorité des souris ne consomment pas de granulés alimentaires, il peut également être utile d’augmenter le nombre de séances d’accoutumance. Bien que nous ayons remarqué que les souris mâles mangeaient généralement moins pendant l’accoutumance aux granulés de nourriture que les souris femelles, cela n’affecte pas leur capacité à reconnaître la cible sociale à valence positive.

Enfin, les paramètres des tâches de reconnaissance d’identité peuvent être modifiés pour réduire ou augmenter la difficulté de la tâche. Par exemple, pour révéler l’impact subtil des facteurs biologiques sur la reconnaissance de l’identité, le temps de formation et le nombre de séances d’entraînement peuvent être réduits pour augmenter la difficulté de la tâche.

Les tâches comportementales que nous avons présentées dans ce protocole sont simples, faciles à mettre en place et adaptables aux souris mâles et femelles pour l’étude de la reconnaissance d’identité. L’utilisation flexible de stimuli appétitifs ou aversifs dans ces tâches permet également d’examiner le rôle de la valence sociale dans la reconnaissance de l’identité. Ces tâches seront utiles pour étudier les mécanismes biologiques de reconnaissance de l’identité chez les souris saines, ou les déficits de ces mécanismes dans des modèles murins liés à des maladies qui présentent une déficience sociale.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol
Black-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			neutral context, positive social valence experiment
C57BL/6 mice	Charles River, Jackson Laboratory		Social targets from Jackson Laboratory
Dustless precision pellets	BioServ	F05301	20 mg, chocolate flavor
Electric tape
Glass bottles (2)
hydrogen peroxide-based disinfectant
Plastic or cardboard			Non-conductive material for enclosure floor
Rectangular plexiglass enclosures (2, 10 cm x 5 cm x 30 cm)			Identical
Shock box (triangular, length of each side = 46 cm; height = 29 cm)
Silent timer
Single Output Scrambled Animal Shocker	Lafayette Instrument	HSCK100AP
three-chamber box (81 cm x 23 cm x 23 cm), with openings in the middle chamber that connect to the left and the right chambers			social discrimination testing
Transparent cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm)			Negative social valence
Transparent cage (26 cm x 47 cm x 21 cm)			Food habituation (positive social valence)
Webcam	Logitech	C920x
Weighing scale
white easel pad papers			floor of the neutral context
White noise generator			60 dB
White, plastic dish
White-walled cage (24 cm x 36 cm x 19.5 cm) with a 1 cm diameter plastic tube as food port			positive social valence context
Wire cups (circular, four, 8 cm x 8 cm x 10 cm)