在小鼠模型中使用显微计算机断层扫描和血液采样监测肺结节进展

摘要

该协议描述了一种用于研究肺结节的高效、简单和微创方法。颌下静脉采血和 micro-CT 成像用作调查技术。

摘要

显微计算机断层扫描 （micro-CT） 是一种实时、直观、灵敏和微创的技术，用于监测从肺结节 （PN） 到肺癌 （LC） 的变化。下颌下静脉采血的整合能够在 PN 到 LC 的进展过程中快速、稳定和直接地检测成像和关键靶标改变。在这项研究中，我们在 A/J 小鼠中施用 100 mg/kg 剂量的 4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮，以开发肺腺癌模型。然后通过下颌下静脉采血和 micro-CT 测定监测实验动物的疾病进展。实验结果显示，到^第 10 周，一些动物的肺部存在结节病灶，到^第 21 周，肺腺癌图像的发展变得明显。综上所述，micro-CT 可以有效观察小鼠肺部的病理变化，结合下颌下静脉采血，可以动态监测血液、蛋白质和靶点的变化。该方法为药物筛选、药代动力学测试、毒理学实验和安全性研究提供了一种高度特异性、简单且灵敏的方法。

引言

肺癌 （LC） 是一种起源于支气管粘膜或肺腺的严重肿瘤。根据 2021 年的统计数据，LC 每年导致全球约 200 万人死亡，发病率和死亡率呈上升^{趋势 1}。LC 的早期诊断和干预有助于提高治愈率、降低死亡率和降低治疗成本。肺结节 （PN） 是 LC 的特异性前体，其特征是放射学检查显示直径为 30 mm 的局部、圆形和更致密的实性或亚实性阴影 ≤，无肺塌陷、纵隔淋巴结肿大或胸腔积液的证据²。美国国家综合癌症网络 （NCCN） 在 2022 年按数量、直径和密度对 PN 进行分类，确定了诸如右肺 5 mm 孤立性磨玻璃结节等组合³。然而，NCCN 指南表明，PN 恶性肿瘤的风险随着结节直径和数量的增加而增加。低剂量计算机断层扫描的广泛应用大大增加了 PN 诊断，每年发现数百万新病例⁴。

A/J 小鼠与 4-（甲基亚硝基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮 （NNK） 的组合是肺癌 （LC） 最常用的动物模型^5,6。使用 micro-CT 和下颌下静脉采血是实时监测从肺结节 （PN） 到 LC 的变化的有效方法。化学致癌物诱导，尤其是 NNK 和 A/J 小鼠，是肺癌建模最普遍的方法，已被证明是建立原位癌的有效方法 ^7,8。与腋窝接种方法相比，这种建模方法更准确地模拟了 PN 到 LC 的进展。

以前的研究集中在安乐死后组织样本的结节形态统计分析和病理染色⁹。然而，这些方法缺乏实时监测从 PN 到 LC¹⁰ 的动态进展的能力。显微 CT 作为一种无创成像技术，可提供准确的纵向数据，具有高分辨率、快速成像、低辐射剂量和安全性，使其适用于实时检测肺部图像^11,12。下颌下静脉采血是获取小鼠血液样本的最新、最简单、最快的方法¹³。这种非侵入性技术需要最少的动物处理并允许快速恢复，符合 3R 原则，旨在减少研究中使用的动物数量，最大限度地减少不适并促进道德治疗。采集的血容量约为 0.2-0.5 mL，足以监测中等需求的血液参数¹⁴。

同时使用显微 CT 和下颌下静脉血液采样，可以动态、实时地观察成像中的 PN 到 LC 进展，并实时检测血流中的关键靶标¹⁵。此外，这种方法能够实时研究代谢物和其他生化物质，当与高效色谱等技术相结合时，可以促进我们对 LC^{的理解 16,17}。

在本研究中，使用 A/J 小鼠联合 NNK 创建原位肺癌小鼠模型。在模型诱导后 4 、 10 和 20 周进行 Micro-CT 扫描以捕获肺部图像，同时在整个实验过程中 通过 下颌下静脉取样采集血液。本研究旨在通过将下颌下静脉采血与显微 CT 相结合，为 PN 和 LC 研究奠定基础。

在肿瘤学中，显微 CT 是检测肿瘤生长的高效工具，提供了一种高分辨率技术，可在此类研究期间随时测量局部阴影焦点变化^18,19。然而，必须认识到，单独的显微 CT 并不能提供有关阴影焦点特征、动物生理状态或关键生物因素水平的信息。因此，本研究采用下颌下静脉取样作为补充方法。

研究方案

本研究中描述的所有动物实验均经成都中医药大学实验动物福利伦理委员会批准，并按照动物研究相关法律和伦理标准进行（综述编号：2024035）。雌性近交 A/JGpt 小鼠 （7-8 周龄） 维持在 20-24 °C 的温度和 40%-70% 的相对湿度下。在整个 12 小时的明暗循环中 ， 它们随意提供标准动物饲料和纯净水。实验前，每只动物都适应了这种环境 7 天。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 试剂和动物制备

1. 化学品和试剂
   1. 将 NNK 溶解在盐水中，形成 10 mg/mL 预混液²⁰.对 NNK 组进行浓度为 100 mg/kg 的 0.2 mL 单次腹膜内注射，同时向空白组提供等体积的生理盐水。
      注意：按照 Jang 等人 ²¹ 确定显微 CT 扫描和采血的时间。
2. 采血
   注意：为确保小鼠的健康，每次将采血限制在不超过 0.2 mL，并等待一周的恢复时间。由于颏下区有大量的毛发，在采集过程中要注意避免血液样本被毛发污染。
   1. 在实验前一天使用合适的剃须刀去除动物的面部毛发。
   2. 用左手牢牢抓住鼠标头部后部的皮肤，以防止任何移动并将鼠标的头部保持在固定位置。
   3. 将采血针从斜眼窝后面的下颌区域迅速插入颌下动脉。将针头保持在原位至少 3 秒，以允许最佳血液流动。收集 50-200 μL 血液。
   4. 将血液收集到 EDTA 管中。使用棉签轻轻按压皮肤以止血。出血停止后，松开鼠标并观察 30 秒。
   5. 轻轻搅动试管，确保血液与凝血剂充分混合。
   6. 对于常规血液检测，将采集的血液放入兽用血液常规检测仪中，按下采集按钮，让仪器采集血液。记录显示的结果。安全地处理任何剩余的血液。

2. 显微 CT 活体 成像

注意： 在使用显微 CT 扫描之前，请务必从测试动物身上取下金属物体，例如耳标。金属对象可能会导致图像中出现严重的伪影。显微 CT 发出一定量的辐射;确保其他实验结果不受影响。

1. 启动设备，启动 micro-CT 软件，然后进行探头校准和预热。使用鼠标专用工具床进行扫描。
2. 创建一个新数据库并为此扫描命名，或将其连接到现有数据库。
3. 在软件设置窗口中修改参数。将 X 射线滤光片 设置为 Cu0.06 + Al0.5， 电压 为 70 kV， 电流 为 80 μA，视 场 为 36 mm × 36 mm，360 ° 旋转扫描， 扫描时间为 4 min²²。
4. 在扫描²³ 之前，用 3% 异氟醚麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）。打开 micro-CT 观察屏幕，并用胶带将鼠标固定在工具床上。使用放置在工具床上显微 CT 仪器内的鼻胃管持续保持麻醉。
5. 小心地将动物引导到设备中并实时监测其位置。使用适当的按钮调整鼠标的位置，确保其胸部在视野内完全可见。
6. 将工具床旋转 90° 以定位鼠标。使用按钮调整鼠标的位置，确保肺部区域位于视野的中心。然后，将工具床放回其原始位置。
7. 要启动扫描，请选择 Scan （ 扫描 ） 按钮。让系统不间断地完成扫描，并在此过程中避免打开查看屏幕。通过软件观察重建的经轴、冠状和矢状切片。
8. 扫描后立即评估图像质量。如果出现伪影或模糊图像，请重复扫描过程。
9. 将老鼠从设备中取出并监测它们的健康状况，以确保它们处于稳定的状态，然后再将它们放回笼子。
10. 实验结束时，从工具床上取下胶带，然后清洁床。保存数据并关闭仪器。
11. 轻轻地将小鼠转移回笼子中，以尽量减少压力。确保笼子干净并有合适的垫料。
12. 监测小鼠是否有麻醉恢复的迹象。观察它们的行为、活动能力和食欲。根据需要提供食物和水。
13. 为小鼠保持温暖的环境，以防止麻醉后体温过低。如有必要，使用加热垫或毯子。
14. 执行下周的每日运行状况检查。寻找痛苦、异常行为或任何受伤的迹象。记录每只鼠标的观察结果。
15. 如果任何老鼠出现生病或痛苦的迹象，请咨询兽医以获得适当的干预和护理。
16. 确保小鼠在完全恢复并稳定后恢复到正常的住房状态。

3. 数据处理和分析

1. 使用统计和绘图软件作为数据分析和创建表格以呈现结果的宝贵工具。
2. 打开软件。从新创建的数据表中选择 XY 图 ，输入 NNK 和对照组的每周数据，并生成一个图表，显示小鼠体重的变化。
3. 再次打开软件，从新创建的数据表中选择 列联图 ，输入 NNK 组和对照组的血常规数据，并生成一个图标。
4. 在 软件 中选择 分析 选项。使用单因子方差分析分析总体数据，然后通过实施 t 检验来验证数据。标记显著差异。
5. 将显微 CT 数据保存为 SimpleViewer 格式或 DICOM。打开 SimpleViewer 软件，在专业影像医师的指导下观察影像数据。使用提供的测量工具标记结节并量化阴影体积。

结果

本研究证明了使用 NNK 联合 A/J 小鼠构建稳定的肺癌模型。实验设计如图 1 所示。目的是利用显微 CT 和下颌下静脉采血观察小鼠肺从肺结节 （PN） 向肺癌 （LC） 转变的实时过程。因此，在第 4 周、第 10 周和第 20 周进行小鼠肺部显微 CT 扫描和血液采样。

实验结果表明，NNK 联合 A/J 小鼠的建模方法有效模拟了从 PN 到 LC 的病理过?...

讨论

重申本研究中的几个关键点很重要。首先，虽然下颌下静脉采血是一种损伤相对较低的手术，但它仍然可能对动物造成一定程度的伤害。因此，有必要进行多种程序以减轻小鼠的负担并及时完成该过程²⁷。其次，在采集血液样本之前去除毛发可确保样本的纯度。第三，必须使用合适的采血管。在本研究中，含有 EDTA 的采血管用于常规血液检查。如果要使?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/J mice	GemPharmatech LLC.	N000018
0.5 mL EDTA tubes	Labshark	130201070
1-Butanone,4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridinyl)	Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.	N589770
75% ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
Animal shaver	Codos	BM010220
Isoflurane	Shenzhen Reward Life Technology Co.	R510-22-16
medical tricorder	MedChemexpress	69652
Quantum GX2 microCT imaging system	PerkinElme	2020166501
Saline (medicine)	Beijing Biolabs Technology Co.	GL1736‌