Monitoraggio della progressione del nodulo polmonare mediante tomografia microcomputerizzata e prelievo di sangue in un modello murino

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo efficiente, semplice e minimamente invasivo per lo studio dei noduli polmonari. La raccolta del sangue della vena sottomascellare e l'imaging micro-CT sono utilizzate come tecniche investigative.

Abstract

La micro-tomografia computerizzata (micro-CT) è una tecnica in tempo reale, intuitiva, sensibile e minimamente invasiva per il monitoraggio dei cambiamenti dai noduli polmonari (PN) al cancro del polmone (LC). L'integrazione del prelievo di sangue della vena sottomandibolare consente un rilevamento rapido, stabile e diretto dell'imaging e delle principali alterazioni del bersaglio durante la progressione della PN a LC. In questo studio, abbiamo somministrato un dosaggio di 100 mg/kg di 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanone in topi A/J per sviluppare un modello di adenocarcinoma polmonare. La progressione della malattia negli animali da esperimento è stata quindi monitorata attraverso il prelievo di sangue della vena sottomandibolare e il test micro-CT. I risultati sperimentali hanno mostrato la presenza di focolai nodulari nei polmoni di alcuni animali entro la 10a^settimana, con lo sviluppo di immagini di adenocarcinoma polmonare che diventavano evidenti entro la 21a settimana. In conclusione, la micro-CT può osservare efficacemente i cambiamenti patologici nei polmoni dei topi e, se combinata con il prelievo di sangue della vena sottomandibolare, può monitorare dinamicamente i cambiamenti nel sangue, nelle proteine e nei bersagli. Questo metodo fornisce un approccio altamente specifico, semplice e sensibile per lo screening dei farmaci, i test farmacocinetici, gli esperimenti tossicologici e gli studi di sicurezza.

Introduzione

Il carcinoma polmonare (LC) è una grave neoplasia che origina nella mucosa bronchiale o nelle ghiandole polmonari. Secondo le statistiche del 2021, la LC causa circa due milioni di decessi a livello globale ogni anno, con tassi di incidenza e mortalità in aumento¹. La diagnosi precoce e l'intervento nella LC contribuiscono a tassi di guarigione più elevati, a una riduzione della mortalità e a minori costi di trattamento. I noduli polmonari (PN) sono precursori specifici della LC, caratterizzati da ombre solide o subsolide localizzate, rotonde e più dense di ≤30 mm di diametro agli esami radiologici, senza evidenza di collasso polmonare, ingrossamento dei linfonodi mediastinici o versamento pleurico². Il National Comprehensive Cancer Network (NCCN) nel 2022 ha classificato la PN per numero, diametro e densità, identificando combinazioni come un nodulo a vetro smerigliato isolato di 5 mm nel polmone destro³. Tuttavia, le linee guida NCCN indicano che il rischio di malignità nella PN aumenta con il diametro e la quantità dei noduli. L'applicazione diffusa della tomografia computerizzata a basse dosi ha aumentato notevolmente le diagnosi di PN, con milioni di nuovi casi identificati ogni anno⁴.

La combinazione di topi A/J con 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanone (NNK) è il modello animale più comunemente usato per il cancro del polmone (LC)^5,6. L'uso della micro-TC insieme al prelievo di sangue della vena sottomandibolare è un approccio efficace per il monitoraggio in tempo reale delle variazioni da noduli polmonari (PN) a LC. L'induzione di agenti chimici cancerogeni, in particolare con i topi NNK e A/J, è il metodo più diffuso per la modellazione del cancro del polmone e si è dimostrato un approccio efficace per stabilire il carcinoma in situ ^7,8. Questo metodo di modellazione simula in modo più accurato la progressione della PN in LC rispetto al metodo di inoculazione ascellare.

Precedenti studi si sono concentrati sull'analisi statistica della morfologia dei noduli e sulla colorazione patologica di campioni di tessuto post-eutanasia⁹. Tuttavia, questi metodi non hanno la capacità di monitorare in tempo reale la progressione dinamica da PN a LC¹⁰. La micro-CT, come tecnica di imaging non invasiva, fornisce dati longitudinali accurati con alta risoluzione, imaging veloce, una bassa dose di radiazioni e sicurezza, rendendola adatta per rilevare immagini polmonari in tempo reale^11,12. Il prelievo di sangue della vena sottomandibolare è il metodo più recente, semplice e veloce per ottenere campioni di sangue dai topi¹³. Questa tecnica non invasiva richiede una manipolazione minima degli animali e consente un rapido recupero, in linea con i principi delle 3R che mirano a ridurre il numero di animali utilizzati nella ricerca, minimizzare il disagio e promuovere un trattamento etico. Il volume ematico raccolto, circa 0,2-0,5 ml, è sufficiente per monitorare i parametri ematici con requisiti moderati¹⁴.

L'uso concomitante della micro-TC e del prelievo di sangue della vena sottomandibolare consente l'osservazione dinamica e in tempo reale della progressione da PN a LC nell'imaging e il rilevamento in tempo reale di bersagli chiave all'interno del flusso sanguigno¹⁵. Inoltre, questo approccio consente lo studio in tempo reale di metaboliti e altre sostanze biochimiche che, se combinato con tecniche come la cromatografia ad alte prestazioni, fa progredire la nostra comprensione della LC ^16,17.

In questo studio, i topi A/J combinati con NNK sono stati utilizzati per creare un modello murino di cancro del polmone in situ. Le scansioni micro-CT sono state eseguite a 4, 10 e 20 settimane dopo l'induzione del modello per acquisire immagini polmonari, mentre il sangue è stato raccolto tramite campionamento della vena sottomandibolare durante l'esperimento. Questo studio mira a stabilire una base per la ricerca su PN e LC combinando il prelievo di sangue della vena sottomandibolare con la micro-CT.

In oncologia, la micro-CT è uno strumento altamente efficace per rilevare la crescita tumorale, offrendo una tecnica ad alta risoluzione per misurare i cambiamenti locali del fuoco ombra in qualsiasi momento durante tali studi^18,19. Tuttavia, è essenziale riconoscere che la micro-CT da sola non fornisce informazioni sulle caratteristiche di focalizzazione delle ombre, sullo stato fisiologico dell'animale o sui livelli di fattori biologici chiave. Pertanto, il campionamento della vena sottomandibolare è stato utilizzato come metodo complementare in questo studio.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico per il Benessere Animale Sperimentale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu e sono stati condotti in conformità con le leggi e gli standard etici pertinenti per la ricerca sugli animali (numero di revisione: 2024035). I topi femmina consanguinei A/JGpt (7-8 settimane di età) sono stati mantenuti a una temperatura di 20-24 °C con un'umidità relativa del 40%-70%. Sono stati forniti loro mangimi standard per animali e acqua purificata ad libitum per un ciclo luce-buio di 12 ore. Prima dell'esperimento, ogni animale è stato acclimatato a questo ambiente per 7 giorni. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Reagenti e preparazione animale

1. Sostanze chimiche e reagenti
   1. Sciogliere NNK in soluzione salina fino a formare una master mix²⁰ da 10 mg/mL. Somministrare una singola iniezione intraperitoneale di 0,2 mL con una concentrazione di 100 mg/kg al gruppo NNK, fornendo un volume uguale di soluzione fisiologica normale al gruppo bianco.
      NOTA: Seguire Jang et ^al.21 per determinare i tempi per la scansione micro-CT e il prelievo di sangue.
2. Prelievo di sangue
   NOTA: Per garantire la salute dei topi, limitare la raccolta del sangue a non più di 0,2 ml alla volta e attendere una settimana per il recupero. A causa dell'abbondanza di peli nella regione sottomentoniera, fare attenzione a evitare la contaminazione del campione di sangue da parte dei capelli durante la raccolta.
   1. Rimuovere i peli del viso dell'animale il giorno prima dell'esperimento utilizzando un rasoio appropriato.
   2. Afferrare saldamente la pelle sulla parte posteriore della testa del mouse con la mano sinistra per impedire qualsiasi movimento e mantenere la testa del mouse in una posizione fissa.
   3. Inserire rapidamente l'ago per la raccolta del sangue nell'arteria sottomascellare dall'area mandibolare dietro l'orbita obliqua. Tenere l'ago in posizione per almeno 3 secondi per consentire un flusso sanguigno ottimale. Raccogliere 50-200 μL di sangue.
   4. Raccogliere il sangue in una provetta EDTA. Usa un batuffolo di cotone per applicare una leggera pressione sulla pelle per fermare il sanguinamento. Una volta che l'emorragia si è fermata, rilasciare il mouse e osservarlo per 30 s.
   5. Agitare delicatamente la provetta per assicurarsi che il sangue sia accuratamente miscelato con il coagulante.
   6. Per gli esami del sangue di routine, posizionare il sangue raccolto nello strumento veterinario per i test di routine, premere il pulsante di raccolta e consentire allo strumento di raccogliere il sangue. Registra i risultati visualizzati. Smaltire il sangue rimanente in modo sicuro.

2. Imaging in vivo mediante micro-CT

NOTA: Rimuovere sempre gli oggetti metallici, come i marchi auricolari, dall'animale di prova prima di utilizzare la scansione micro-CT. Gli oggetti metallici possono causare gravi artefatti nell'immagine. La micro-CT emette una certa quantità di radiazioni; garantire che altri risultati sperimentali non siano influenzati.

1. Avviare l'unità, avviare il software micro-CT ed eseguire la calibrazione e il riscaldamento della sonda. Utilizzare la base strumenti specifica per il mouse per la scansione.
2. Creare un nuovo database e assegnargli un nome per questa scansione oppure connetterlo a un database esistente.
3. Modificare i parametri nella finestra di configurazione del software. Impostare il filtro a raggi X su Cu0,06 + Al0,5, con una tensione di 70 kV, una corrente di 80 μA, un campo visivo di 36 mm × 36 mm, scansione rotazionale a 360° e un tempo di scansione di 4 min²².
4. Anestetizzare i topi con isoflurano al 3% prima di eseguire la scansione²³ (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Aprire lo schermo di visualizzazione della micro-CT e fissare i mouse al letto degli strumenti con del nastro adesivo. Mantenere l'anestesia in modo continuo utilizzando un sondino nasogastrico posizionato all'interno dello strumento micro-CT sul letto dell'utensile.
5. Guidare con attenzione l'animale all'interno dell'apparecchio e monitorare la sua posizione in tempo reale. Utilizzare i pulsanti appropriati per regolare la posizione del mouse, assicurandosi che il suo torace sia completamente visibile all'interno del campo visivo.
6. Ruotare il piano degli attrezzi di 90° per posizionare il mouse. Utilizzare i pulsanti per regolare la posizione del mouse, assicurandosi che la regione polmonare sia situata centralmente all'interno del campo visivo. Quindi, riportare il piano degli attrezzi nella sua posizione originale.
7. Per avviare la scansione, selezionare il pulsante Scansione . Consentire al sistema di completare la scansione senza interruzioni ed evitare di aprire la schermata di visualizzazione durante il processo. Osservare le fette transassiali, coronali e sagittali della ricostruzione attraverso il software.
8. Valutare la qualità dell'immagine subito dopo la scansione. Se compaiono artefatti o immagini sfocate, ripetere la procedura di scansione.
9. Rimuovi i topi dall'apparecchio e monitora la loro salute per assicurarti che siano in condizioni stabili prima di rimetterli nelle loro gabbie.
10. Al termine dell'esperimento, rimuovere il nastro adesivo dal letto degli attrezzi, quindi pulire il letto. Salvare i dati e spegnere lo strumento.
11. Trasferisci delicatamente i topi nelle loro gabbie per ridurre al minimo lo stress. Assicurarsi che le gabbie siano pulite e abbiano una lettiera adeguata.
12. Monitorare i topi per segni di recupero dall'anestesia. Osserva il loro comportamento, la mobilità e l'appetito. Fornire cibo e acqua secondo necessità.
13. Mantenere un ambiente caldo per i topi per prevenire l'ipotermia dopo l'anestesia. Se necessario, utilizzare termofori o coperte.
14. Condurre controlli sanitari giornalieri per la prossima settimana. Cerca segni di angoscia, comportamenti insoliti o lesioni. Documenta le osservazioni per ogni topo.
15. Se un topo mostra segni di malattia o angoscia, consultare un veterinario per un intervento e una cura appropriati.
16. Assicurati che i topi tornino alle loro normali condizioni di alloggio dopo che si sono completamente ripresi e sono stabili.

3. Elaborazione e analisi dei dati

1. Utilizza le statistiche e i software grafici come strumento prezioso per l'analisi dei dati e la creazione di tabelle per presentare i risultati.
2. Apri il software. Seleziona i grafici XY dalla tabella dati appena creata, inserisci i dati settimanali per l'NNK e i gruppi di controllo e genera un grafico che mostra le variazioni di peso dei topi.
3. Aprire nuovamente il software, selezionare il diagramma di contingenza dalla tabella dati appena creata, inserire i dati di routine del sangue per il gruppo NNK e il gruppo di controllo e generare un'icona.
4. Selezionare le opzioni di analisi nel software. Analizza i dati complessivi utilizzando l'ANOVA unidirezionale, seguita dalla verifica dei dati attraverso l'implementazione di un t-test. Segna le differenze significative.
5. Salvare i dati micro-CT in formato SimpleViewer o DICOM. Aprire il software SimpleViewer e osservare i dati di imaging sotto la guida di un medico di imaging professionista. Etichettare i noduli e quantificare il volume d'ombra utilizzando gli strumenti di misurazione forniti.

Risultati

Questo studio ha dimostrato la costruzione di un modello stabile di cancro del polmone utilizzando NNK in combinazione con topi A/J. Il disegno sperimentale è illustrato nella Figura 1. L'obiettivo era quello di osservare il processo in tempo reale della transizione dai noduli polmonari (PN) al carcinoma polmonare (LC) nei polmoni di topo, utilizzando la micro-TC e il prelievo di sangue della vena sottomandibolare. Di conseguenza, la micro-TC e il prelievo ...

Discussione

È importante ribadire diversi punti chiave di questo studio. In primo luogo, sebbene la raccolta del sangue della vena sottomandibolare sia una procedura relativamente a basso numero di lesioni, può comunque causare un certo grado di danno agli animali. Pertanto, è necessario condurre più procedure per ridurre l'onere sui topi e completare il processo in modo tempestivo²⁷. In secondo luogo, la rimozione dei peli prima della raccolta del campione di sangue gara...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/J mice	GemPharmatech LLC.	N000018
0.5 mL EDTA tubes	Labshark	130201070
1-Butanone,4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridinyl)	Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.	N589770
75% ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
Animal shaver	Codos	BM010220
Isoflurane	Shenzhen Reward Life Technology Co.	R510-22-16
medical tricorder	MedChemexpress	69652
Quantum GX2 microCT imaging system	PerkinElme	2020166501
Saline (medicine)	Beijing Biolabs Technology Co.	GL1736‌