Surveillance de la progression des nodules pulmonaires à l’aide de la microtomodensitométrie et du prélèvement sanguin dans un modèle murin

Résumé

Ce protocole décrit une méthode efficace, simple et peu invasive pour étudier les nodules pulmonaires. Le prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire et l’imagerie par micro-tomodensitométrie sont utilisés comme techniques d’investigation.

Résumé

La micro-tomodensitométrie (micro-TDM) est une technique en temps réel, intuitive, sensible et peu invasive permettant de surveiller les changements des nodules pulmonaires (NP) au cancer du poumon (LC). L’intégration du prélèvement sanguin de la veine sous-mandibulaire permet une détection rapide, stable et simple de l’imagerie et des altérations clés de la cible au cours de la progression de la NP à la LC. Dans cette étude, nous avons administré une dose de 100 mg/kg de 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone chez des souris A/J pour développer un modèle d’adénocarcinome pulmonaire. La progression de la maladie chez les animaux de laboratoire a ensuite été surveillée par prélèvement sanguin dans la veine sous-mandibulaire et par micro-tomodensitométrie. Les résultats expérimentaux ont montré la présence de foyers nodulaires dans les poumons de certains animaux à la 10e^semaine, le développement d’images d’adénocarcinome pulmonaire devenant évident à la 21e^semaine. En conclusion, la micro-TDM peut observer efficacement les changements pathologiques dans les poumons des souris et, lorsqu’elle est combinée à un prélèvement sanguin dans la veine sous-mandibulaire, peut surveiller dynamiquement les changements dans le sang, les protéines et les cibles. Cette méthode fournit une approche très spécifique, simple et sensible pour le dépistage de drogues, les tests pharmacocinétiques, les expériences toxicologiques et les études de sécurité.

Introduction

Le cancer du poumon (LC) est une tumeur grave qui prend naissance dans la muqueuse bronchique ou les glandes pulmonaires. Selon les statistiques de 2021, la LC est à l’origine d’environ deux millions de décès dans le monde chaque année, avec des taux d’incidence et de mortalité en hausse¹. Un diagnostic et une intervention précoces dans le LC contribuent à des taux de guérison plus élevés, à une réduction de la mortalité et à une réduction des coûts de traitement. Les nodules pulmonaires (NP) sont des précurseurs spécifiques de la LC, caractérisés par des ombres solides ou subsolides localisées, rondes et plus denses ≤30 mm de diamètre sur les examens radiologiques, sans signe de collapsus pulmonaire, d’hypertrophie des ganglions lymphatiques médiastinaux ou d’épanchement pleural². En 2022, le National Comprehensive Cancer Network (NCCN) a classé la NP par numéro, diamètre et densité, en identifiant des combinaisons telles qu’un nodule isolé de verre dépoli de 5 mm dans le poumon droit³. Cependant, les directives du NCCN indiquent que le risque de malignité dans la NP augmente avec le diamètre et la quantité des nodules. L’application généralisée de la tomodensitométrie à faible dose a considérablement augmenté les diagnostics de NP, avec des millions de nouveaux cas identifiés chaque année⁴.

L’association de souris A/J avec du 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) est le modèle animal le plus couramment utilisé pour le cancer du poumon (LC)^5,6. L’utilisation de la micro-TDM en plus du prélèvement sanguin de la veine sous-mandibulaire est une approche efficace pour le suivi en temps réel des changements des nodules pulmonaires (NP) à LC. L’induction chimique de cancérogènes, en particulier chez les souris NNK et A/J, est la méthode la plus répandue pour la modélisation du cancer du poumon et s’est avérée être une approche efficace pour établir un carcinome in situ ^7,8. Cette méthode de modélisation simule plus précisément la progression de la NP à la LC par rapport à la méthode d’inoculation axillaire.

Des études antérieures ont porté sur l’analyse statistique de la morphologie des nodules et la coloration pathologique d’échantillons de tissus après l’euthanasie⁹. Cependant, ces méthodes n’ont pas la capacité de suivre en temps réel la progression dynamique de la PN à la LC¹⁰. La micro-tomodensitométrie, en tant que technique d’imagerie non invasive, fournit des données longitudinales précises avec une haute résolution, une imagerie rapide, une faible dose de rayonnement et une sécurité, ce qui la rend adaptée à la détection d’images pulmonaires en temps réel^11,12. Le prélèvement de sang de la veine sous-mandibulaire est la méthode la plus récente, la plus simple et la plus rapide pour obtenir des échantillons de sang de souris¹³. Cette technique non invasive nécessite une manipulation minimale des animaux et permet un rétablissement rapide, conformément aux principes des 3R qui visent à réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche, à minimiser l’inconfort et à promouvoir un traitement éthique. Le volume sanguin collecté, d’environ 0,2 à 0,5 ml, est suffisant pour surveiller les paramètres sanguins avec des besoins modérés¹⁴.

L’utilisation simultanée de la micro-tomodensitométrie et du prélèvement sanguin dans la veine sous-mandibulaire permet une observation dynamique et en temps réel de la progression de la NP à la LC en imagerie et la détection en temps réel de cibles clés dans la circulation sanguine¹⁵. De plus, cette approche permet d’étudier en temps réel les métabolites et autres produits biochimiques, ce qui, combiné à des techniques telles que la chromatographie à haute performance, fait progresser notre compréhension de la CL^16,17.

Dans cette étude, des souris A/J combinées à NNK ont été utilisées pour créer un modèle murin de cancer du poumon in situ. Des micro-tomodensitogrammes ont été effectués à 4, 10 et 20 semaines après l’induction du modèle pour capturer des images pulmonaires, tandis que le sang a été prélevé par prélèvement de veines sous-mandibulaires tout au long de l’expérience. Cette étude vise à établir une base pour la recherche sur la NP et la LC en combinant le prélèvement sanguin de la veine sous-mandibulaire avec la micro-TDM.

En oncologie, la micro-tomodensitométrie est un outil très efficace pour détecter la croissance tumorale, offrant une technique à haute résolution pour mesurer les changements locaux de mise au point des ombres à tout moment au cours de^{ces études.} Cependant, il est essentiel de reconnaître que la micro-TDM seule ne fournit pas d’informations sur les caractéristiques du foyer d’ombre, l’état physiologique de l’animal ou les niveaux de facteurs biologiques clés. Par conséquent, l’échantillonnage de la veine sous-mandibulaire a été utilisé comme méthode complémentaire dans cette étude.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique du bien-être des animaux expérimentaux de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu et ont été menées conformément aux lois et normes éthiques pertinentes pour la recherche sur les animaux (numéro de revue : 2024035). Des souris femelles consanguines A/JGpt (âgées de 7 à 8 semaines) ont été maintenues à une température de 20 à 24 °C avec une humidité relative de 40 à 70 %. Ils ont reçu de la nourriture standard pour animaux et de l’eau purifiée à volonté tout au long d’un cycle lumière-obscurité de 12 heures. Avant l’expérience, chaque animal a été acclimaté à cet environnement pendant 7 jours. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Réactifs et préparation des animaux

1. Produits chimiques et réactifs
   1. Dissoudre le NNK dans une solution saline pour former un mélange maître de 10 mg/mL²⁰. Administrer une injection intrapéritonéale unique de 0,2 mL à une concentration de 100 mg/kg au groupe NNK, tout en fournissant un volume égal de solution saline normale au groupe à blanc.
      REMARQUE : Suivez Jang et ^al.21 pour déterminer le moment de la micro-tomodensitométrie et du prélèvement sanguin.
2. Prélèvement sanguin
   REMARQUE : Pour assurer la santé des souris, limitez la collecte de sang à un maximum de 0,2 ml à chaque fois et prévoyez une semaine pour la récupération. En raison de l’abondance de cheveux dans la région sous-mentonnière, veillez à éviter la contamination de l’échantillon de sang par les cheveux lors du prélèvement.
   1. Retirez les poils du visage de l’animal la veille de l’expérience à l’aide d’un rasoir approprié.
   2. Saisissez fermement la peau sur la face postérieure de la tête de la souris avec la main gauche pour éviter tout mouvement et maintenir la tête de la souris dans une position fixe.
   3. Insérez rapidement l’aiguille de prélèvement sanguin dans l’artère sous-maxillaire à partir de la zone mandibulaire derrière l’orbite oblique. Maintenez l’aiguille en place pendant au moins 3 s pour permettre une circulation sanguine optimale. Prélever de 50 à 200 μL de sang.
   4. Prélevez le sang dans un tube EDTA. Utilisez un coton-tige pour appliquer une légère pression sur la peau afin d’arrêter le saignement. Une fois que le saignement s’est arrêté, relâchez la souris et observez-la pendant 30 s.
   5. Agitez doucement le tube à essai pour vous assurer que le sang est bien mélangé avec le coagulant.
   6. Pour les tests sanguins de routine, placez le sang collecté dans l’instrument de test sanguin vétérinaire de routine, appuyez sur le bouton de prélèvement et laissez l’instrument collecter le sang. Enregistrez les résultats affichés. Éliminez le sang restant en toute sécurité.

2. Imagerie in vivo par micro-CT

REMARQUE : Retirez toujours les objets métalliques, tels que les étiquettes d’oreille, de l’animal testé avant d’utiliser le micro-CT. Les objets métalliques peuvent provoquer de graves artefacts dans l’image. Le micro-CT émet une certaine quantité de rayonnement ; S’assurer que d’autres résultats expérimentaux ne sont pas affectés.

1. Démarrez l’unité, lancez le logiciel micro-CT et effectuez l’étalonnage et le préchauffage de la sonde. Utilisez le lit d’outils spécifique à la souris pour la numérisation.
2. Créez une base de données et nommez-la pour cette analyse, ou connectez-la à une base de données existante.
3. Modifiez les paramètres dans la fenêtre de configuration du logiciel. Réglez le filtre à rayons X sur Cu0,06 + Al0,5, avec une tension de 70 kV, un courant de 80 μA, un champ de vision de 36 mm × 36 mm, un balayage rotatif à 360° et un temps de balayage de 4 min^22.
4. Anesthésier les souris avec de l’isoflurane à 3 % avant l’examen²³ (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Ouvrez l’écran de visualisation micro-CT et fixez les souris au lit de l’outil avec du ruban adhésif. Maintenez l’anesthésie en continu à l’aide d’une sonde nasogastrique placée à l’intérieur de l’instrument de micro-tomodensitométrie sur le lit de l’outil.
5. Guidez soigneusement l’animal dans l’appareil et surveillez sa position en temps réel. Utilisez les boutons appropriés pour ajuster la position de la souris, en vous assurant que sa poitrine est entièrement visible dans le champ de vision.
6. Faites pivoter le lit de l’outil de 90° pour positionner la souris. Utilisez les boutons pour ajuster la position de la souris, en vous assurant que la région pulmonaire est située au centre du champ de vision. Ensuite, remettez le lit de l’outil dans sa position d’origine.
7. Pour lancer l’analyse, sélectionnez le bouton Analyser . Laissez le système terminer le balayage sans interruption et évitez d’ouvrir l’écran d’affichage pendant le processus. Observez les coupes transaxiales, coronales et sagittales de la reconstruction à l’aide du logiciel.
8. Évaluez la qualité de l’image immédiatement après la numérisation. Si des artefacts ou des images floues apparaissent, répétez la procédure de numérisation.
9. Retirez les souris de l’appareil et surveillez leur santé pour vous assurer qu’elles sont dans un état stable avant de les remettre dans leurs cages.
10. À la fin de l’expérience, retirez le ruban adhésif du lit de l’outil, puis nettoyez le lit. Enregistrez les données et éteignez l’instrument.
11. Transférez doucement les souris dans leurs cages pour minimiser le stress. Assurez-vous que les cages sont propres et qu’elles disposent d’une litière appropriée.
12. Surveillez les souris pour détecter des signes de récupération après l’anesthésie. Observez leur comportement, leur mobilité et leur appétit. Fournissez de la nourriture et de l’eau au besoin.
13. Maintenez un environnement chaud pour les souris afin de prévenir l’hypothermie après l’anesthésie. Utilisez des coussins chauffants ou des couvertures si nécessaire.
14. Effectuez des contrôles de santé quotidiens pour la semaine prochaine. Recherchez des signes de détresse, un comportement inhabituel ou des blessures. Documentez les observations pour chaque souris.
15. Si une souris présente des signes de maladie ou de détresse, consultez un vétérinaire pour une intervention et des soins appropriés.
16. Assurez-vous que les souris retrouvent leurs conditions de logement normales une fois qu’elles se sont complètement rétablies et qu’elles sont stables.

3. Traitement et analyse des données

1. Utilisez des statistiques et des logiciels graphiques comme outil précieux pour l’analyse des données et la création de tableaux pour présenter les résultats.
2. Ouvrez le logiciel. Sélectionnez des graphiques XY dans la table de données nouvellement créée, entrez les données hebdomadaires pour le groupe NNK et le groupe de contrôle, puis générez un graphique affichant les changements de poids des souris.
3. Ouvrez à nouveau le logiciel, sélectionnez le diagramme de contingence dans le tableau de données nouvellement créé, saisissez les données de routine sanguine pour le groupe NNK et le groupe témoin, puis générez une icône.
4. Sélectionnez les options d’analyse dans le logiciel. Analysez les données globales à l’aide d’une ANOVA à un facteur, suivie d’une vérification des données par la mise en œuvre d’un test t. Marquez les différences significatives.
5. Enregistrez les données micro-CT au format SimpleViewer ou DICOM. Ouvrez le logiciel SimpleViewer et observez les données d’imagerie sous la direction d’un médecin spécialiste de l’imagerie. Étiquetez les nodules et quantifiez le volume d’ombre à l’aide des outils de mesure fournis.

Résultats

Cette étude a démontré la construction d’un modèle stable de cancer du poumon en utilisant NNK en combinaison avec des souris A/J. Le plan expérimental est illustré à la figure 1. L’objectif était d’observer le processus en temps réel de la transition des nodules pulmonaires (NP) au cancer du poumon (LC) dans les poumons de souris, en utilisant la micro-TDM et le prélèvement sanguin de la veine sous-mandibulaire. En conséquence, une micro-t...

Discussion

Il est important de rappeler plusieurs points clés de cette étude. Tout d’abord, bien que le prélèvement de sang dans la veine sous-mandibulaire soit une procédure relativement peu dommageable, elle peut tout de même entraîner un certain degré de préjudice pour les animaux. Par conséquent, il est nécessaire d’effectuer plusieurs procédures pour réduire le fardeau des souris et terminer le processus en temps opportun²⁷. Deuxièmement, l’épilatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/J mice	GemPharmatech LLC.	N000018
0.5 mL EDTA tubes	Labshark	130201070
1-Butanone,4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridinyl)	Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.	N589770
75% ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
Animal shaver	Codos	BM010220
Isoflurane	Shenzhen Reward Life Technology Co.	R510-22-16
medical tricorder	MedChemexpress	69652
Quantum GX2 microCT imaging system	PerkinElme	2020166501
Saline (medicine)	Beijing Biolabs Technology Co.	GL1736‌