Monitorización de la progresión de los nódulos pulmonares mediante tomografía microcomputarizada y muestras de sangre en un modelo de ratón

Resumen

Este protocolo describe un método eficiente, sencillo y mínimamente invasivo para el estudio de los nódulos pulmonares. La extracción de sangre de las venas submaxilares y las imágenes por micro-TC se utilizan como técnicas de investigación.

Resumen

La microtomografía computarizada (micro-TC) es una técnica en tiempo real, intuitiva, sensible y mínimamente invasiva para controlar los cambios de nódulos pulmonares (NP) a cáncer de pulmón (CP). La integración de la toma de muestras de sangre de la vena submandibular permite una detección rápida, estable y sencilla de las imágenes y las alteraciones clave del objetivo durante la progresión de la NP a la LC. En este estudio, administramos una dosis de 100 mg/kg de 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona en ratones A/J para desarrollar un modelo de adenocarcinoma de pulmón. A continuación, se monitorizó la progresión de la enfermedad en los animales de experimentación mediante muestras de sangre de la vena submandibular y un ensayo de microtomografía computarizada. Los resultados experimentales mostraron la presencia de focos nodulares en los pulmones de algunos animales a la^10ª semana, y el desarrollo de imágenes de adenocarcinoma de pulmón se hizo evidente a la^21ª semana. En conclusión, la micro-TC puede observar eficazmente los cambios patológicos en los pulmones de los ratones y, cuando se combina con la toma de muestras de sangre de las venas submandibulares, puede controlar dinámicamente los cambios en la sangre, las proteínas y los objetivos. Este método proporciona un enfoque muy específico, sencillo y sensible para la detección de fármacos, las pruebas farmacocinéticas, los experimentos toxicológicos y los estudios de seguridad.

Introducción

El cáncer de pulmón (CP) es una neoplasia grave que se origina en la mucosa bronquial o en las glándulas pulmonares. Según las estadísticas de 2021, la LC causa aproximadamente dos millones de muertes en todo el mundo cada año, con tasas de incidencia y mortalidad en aumento¹. El diagnóstico y la intervención tempranos en el CL contribuyen a tasas de curación más altas, menor mortalidad y menores costos de tratamiento. Los nódulos pulmonares (NP) son precursores específicos de la CP, caracterizados por sombras sólidas o subsólidas localizadas, redondas y más densas ≤30 mm de diámetro en los exámenes radiológicos, sin evidencia de colapso pulmonar, agrandamiento de los ganglios linfáticos mediastínicos o derrame pleural². La National Comprehensive Cancer Network (NCCN) en 2022 clasificó la NP por número, diámetro y densidad, identificando combinaciones como un nódulo de vidrio esmerilado aislado de 5 mm en el pulmón derecho³. Sin embargo, las guías de la NCCN indican que el riesgo de malignidad en la NP aumenta con el diámetro y la cantidad de los nódulos. La aplicación generalizada de la tomografía computarizada de baja dosis ha aumentado drásticamente los diagnósticos de NP, con millones de nuevos casos identificados cada año⁴.

La combinación de ratones A/J con 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) es el modelo animal más utilizado para el cáncer de pulmón (CL)^5,6. El uso de la micro-TC junto con la toma de muestras de sangre de las venas submandibulares es un enfoque eficaz para la monitorización en tiempo real de los cambios de nódulos pulmonares (NP) a CL. La inducción química de carcinógenos, particularmente con ratones NNK y A/J, es el método más prevalente para el modelado del cáncer de pulmón y ha demostrado ser un enfoque eficaz para establecer el carcinoma in situ ^7,8. Este método de modelado simula con mayor precisión la progresión de NP a LC en comparación con el método de inoculación axilar.

Los estudios previos se han centrado en el análisis estadístico de la morfología de los nódulos y en la tinción patológica de las muestras de tejido después de la eutanasia⁹. Sin embargo, estos métodos carecen de la capacidad de monitorear en tiempo real la progresión dinámica de NP a LC¹⁰. La micro-TC, como técnica de imagen no invasiva, proporciona datos longitudinales precisos con alta resolución, imágenes rápidas, baja dosis de radiación y seguridad, lo que la hace adecuada para la detección de imágenes pulmonares en tiempo real^11,12. La toma de muestras de sangre en la vena submandibular es el método más reciente, sencillo y rápido para obtener muestras de sangre de ratones¹³. Esta técnica no invasiva requiere un manejo mínimo de los animales y permite una recuperación rápida, alineándose con los principios de las 3R que tienen como objetivo reducir el número de animales utilizados en la investigación, minimizar las molestias y promover el tratamiento ético. El volumen sanguíneo recogido, aproximadamente 0,2-0,5 mL, es suficiente para monitorizar los parámetros sanguíneos con requerimientos moderados¹⁴.

El uso simultáneo de la micro-TC y la toma de muestras de sangre en las venas submandibulares permite la observación dinámica y en tiempo real de la progresión de la NP a la LC en las imágenes y la detección en tiempo real de objetivos clave dentro del torrente sanguíneo¹⁵. Además, este enfoque permite la investigación en tiempo real de metabolitos y otros productos bioquímicos, lo que, cuando se combina con técnicas como la cromatografía de alta resolución, avanza nuestra comprensión de la LC^16,17.

En este estudio, se utilizaron ratones A/J combinados con NNK para crear un modelo de ratón de cáncer de pulmón in situ. Se realizaron microtomografías computarizadas a las 4, 10 y 20 semanas después de la inducción del modelo para capturar imágenes pulmonares, mientras que la sangre se recolectó mediante muestreo de venas submandibulares durante todo el experimento. Este estudio tiene como objetivo establecer una base para la investigación de la NP y la LC mediante la combinación de muestras de sangre de la vena submandibular con micro-CT.

En oncología, la micro-TC es una herramienta altamente efectiva para detectar el crecimiento tumoral, ofreciendo una técnica de alta resolución para medir los cambios locales en el foco de la sombra en cualquier momento durante dichos estudios^18,19. Sin embargo, es esencial reconocer que la micro-TC por sí sola no proporciona información sobre las características del enfoque de la sombra, el estado fisiológico del animal o los niveles de factores biológicos clave. Por lo tanto, se utilizó el muestreo de la vena submandibular como método complementario en este estudio.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética de Bienestar Animal Experimental de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu y se llevaron a cabo de acuerdo con las leyes y normas éticas pertinentes para la investigación con animales (número de revisión: 2024035). Las hembras endogámicas A/JGpt (7-8 semanas de edad) se mantuvieron a una temperatura de 20-24 °C con una humedad relativa del 40%-70%. Se les proporcionó alimento para animales estándar y agua purificada ad libitum durante un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. Antes del experimento, cada animal se aclimató a este entorno durante 7 días. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Reactivos y preparación animal

1. Productos químicos y reactivos
   1. Disuelva NNK en solución salina para formar una mezcla maestra de 10 mg/mL²⁰. Administrar una única inyección intraperitoneal de 0,2 mL con una concentración de 100 mg/kg al grupo NNK, mientras se proporciona un volumen igual de solución salina normal al grupo blanco.
      NOTA: Siga a Jang et ^al.21 para determinar el momento para la exploración por micro-TC y la toma de muestras de sangre.
2. Extracción de sangre
   NOTA: Para garantizar la salud de los ratones, limite la recolección de sangre a no más de 0.2 mL en cada momento y espere una semana para la recuperación. Debido a la abundancia de pelo en la región submentoniana, tenga cuidado de evitar la contaminación de la muestra de sangre por pelo durante la recolección.
   1. Retira el vello facial del animal el día antes del experimento con una afeitadora adecuada.
   2. Agarre firmemente la piel de la cara posterior de la cabeza del ratón con la mano izquierda para evitar cualquier movimiento y mantener la cabeza del ratón en una posición fija.
   3. Inserte rápidamente la aguja de recolección de sangre en la arteria submaxilar desde el área mandibular detrás de la cuenca oblicua del ojo. Mantenga la aguja en su lugar durante al menos 3 segundos para permitir un flujo sanguíneo óptimo. Recoge de 50 a 200 μL de sangre.
   4. Recoge la sangre en un tubo de EDTA. Use un hisopo de algodón para aplicar una presión suave sobre la piel y detener el sangrado. Una vez que el sangrado se haya detenido, suelte el ratón y obsérvelo durante 30 s.
   5. Agite suavemente el tubo de ensayo para asegurarse de que la sangre se mezcle completamente con el coagulante.
   6. Para los análisis de sangre de rutina, coloque la sangre recolectada en el instrumento de prueba de rutina de sangre veterinario, presione el botón de recolección y permita que el instrumento recoja la sangre. Registre los resultados mostrados. Deseche la sangre restante de manera segura.

2. Obtención de imágenes in vivo por micro-TC

NOTA: Siempre retire los objetos metálicos, como los crotales, del animal de prueba antes de usar la microtomografía computarizada. Los objetos metálicos pueden causar artefactos graves en la imagen. La microtomografía computarizada emite una cierta cantidad de radiación; Asegurarse de que otros resultados experimentales no se vean afectados.

1. Encienda la unidad, inicie el software de micro-CT y realice la calibración y el calentamiento de la sonda. Utilice el banco de herramientas específico del ratón para escanear.
2. Cree una nueva base de datos y asígnele un nombre para este análisis, o conéctela a una base de datos existente.
3. Modifique los parámetros en la ventana de configuración del software. Ajuste el filtro de rayos X a Cu0,06 + Al0,5, con un voltaje de 70 kV, una corriente de 80 μA, un campo de visión de 36 mm × 36 mm, escaneo rotacional de 360° y un tiempo de escaneo de 4 min²².
4. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 3% antes de la exploración²³ (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Abra la pantalla de visualización de micro-CT y asegure los ratones a la cama de herramientas con cinta adhesiva. Mantenga la anestesia de forma continua utilizando una sonda nasogástrica colocada dentro del instrumento de micro-TC en el lecho de herramientas.
5. Guíe cuidadosamente al animal dentro del aparato y controle su posición en tiempo real. Utilice los botones apropiados para ajustar la posición del mouse, asegurándose de que su pecho sea completamente visible dentro del campo de visión.
6. Gire la cama de herramientas 90° para colocar el ratón. Utilice los botones para ajustar la posición del ratón, asegurándose de que la región pulmonar esté situada en el centro del campo de visión. A continuación, vuelva a colocar la cama de la herramienta en su posición original.
7. Para iniciar el escaneo, seleccione el botón Escanear . Permita que el sistema complete el escaneo sin interrupciones y evite abrir la pantalla de visualización durante el proceso. Observe los cortes transaxiales, coronales y sagitales de la reconstrucción a través del software.
8. Evalúe la calidad de la imagen inmediatamente después del escaneo. Si aparecen artefactos o imágenes borrosas, repita el procedimiento de escaneo.
9. Retire a los ratones del aparato y controle su salud para asegurarse de que estén en condiciones estables antes de devolverlos a sus jaulas.
10. Al final del experimento, retire la cinta adhesiva de la base de herramientas y luego limpie la cama. Guarde los datos y apague el instrumento.
11. Transfiera a los ratones a sus jaulas con cuidado para minimizar el estrés. Asegúrese de que las jaulas estén limpias y tengan ropa de cama adecuada.
12. Monitoree a los ratones para detectar signos de recuperación de la anestesia. Observa su comportamiento, movilidad y apetito. Proporcione alimentos y agua según sea necesario.
13. Mantenga un ambiente cálido para los ratones para evitar la hipotermia después de la anestesia. Use almohadillas térmicas o mantas si es necesario.
14. Realice controles de salud diarios durante la próxima semana. Busque signos de angustia, comportamiento inusual o cualquier lesión. Documente las observaciones de cada ratón.
15. Si algún ratón muestra signos de enfermedad o angustia, consulte con un veterinario para obtener la intervención y los cuidados adecuados.
16. Asegúrese de que los ratones vuelvan a sus condiciones normales de alojamiento después de que se hayan recuperado por completo y estén estables.

3. Procesamiento y análisis de datos

1. Utilice el software de estadísticas y gráficos como una herramienta valiosa para el análisis de datos y la creación de tablas para presentar resultados.
2. Abra el software. Seleccione los gráficos XY de la tabla de datos recién creada, introduzca los datos semanales para el NNK y los grupos de control, y genere un gráfico que muestre los cambios en el peso de los ratones.
3. Abra el software nuevamente, seleccione el diagrama de contingencia de la tabla de datos recién creada, ingrese los datos de la rutina de sangre para el grupo NNK y el grupo de control, y genere un icono.
4. Seleccione las opciones de análisis en el software. Analice los datos generales utilizando ANOVA de un factor, seguido de la verificación de los datos mediante la implementación de una prueba t. Marcar diferencias significativas.
5. Guarde los datos de micro-CT en formato SimpleViewer o DICOM. Abra el software SimpleViewer y observe los datos de las imágenes bajo la guía de un médico especialista en imágenes. Etiquete los nódulos y cuantifique el volumen de sombra utilizando las herramientas de medición proporcionadas.

Resultados

Este estudio demostró la construcción de un modelo de cáncer de pulmón estable utilizando NNK en combinación con ratones A/J. El diseño experimental se ilustra en la Figura 1. El objetivo fue observar el proceso en tiempo real de la transición de nódulos pulmonares (NP) a cáncer de pulmón (CP) en pulmones de ratón, utilizando micro-TC y muestreo de sangre de venas submandibulares. En consecuencia, se realizaron microtomografías computarizadas y m...

Discusión

Es importante reiterar varios puntos clave de este estudio. En primer lugar, aunque la extracción de sangre de la vena submandibular es un procedimiento de lesiones relativamente bajas, puede provocar algún grado de daño a los animales. Por lo tanto, es necesario realizar múltiples procedimientos para reducir la carga en los ratones y completar el proceso de manera oportuna²⁷. En segundo lugar, la eliminación del vello antes de la recolección de la muestra d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/J mice	GemPharmatech LLC.	N000018
0.5 mL EDTA tubes	Labshark	130201070
1-Butanone,4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridinyl)	Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.	N589770
75% ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
Animal shaver	Codos	BM010220
Isoflurane	Shenzhen Reward Life Technology Co.	R510-22-16
medical tricorder	MedChemexpress	69652
Quantum GX2 microCT imaging system	PerkinElme	2020166501
Saline (medicine)	Beijing Biolabs Technology Co.	GL1736‌