Überwachung des Fortschreitens der Lungenknoten mittels Mikrocomputertomographie und Blutentnahme im Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente, einfache und minimalinvasive Methode zur Untersuchung von Lungenknoten. Als Untersuchungstechniken kommen die Blutentnahme aus der Unterkiefervene und die Mikro-CT-Bildgebung zum Einsatz.

Zusammenfassung

Die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) ist eine intuitive, empfindliche und minimal-invasive Echtzeittechnik zur Überwachung von Veränderungen von Lungenknoten (PN) bis Lungenkrebs (LC). Die Integration der Blutentnahme aus der submandibulären Vene ermöglicht eine schnelle, stabile und unkomplizierte Detektion der Bildgebung und wichtiger Zielveränderungen während des Fortschreitens von PN zu LC. In dieser Studie verabreichten wir A/J-Mäusen eine Dosierung von 100 mg/kg 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon, um ein Lungenadenokarzinommodell zu entwickeln. Das Fortschreiten der Erkrankung bei den Versuchstieren wurde dann durch Blutproben aus der submandibulären Vene und einen Mikro-CT-Assay überwacht. Experimentelle Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von knotigen Herden in der Lunge einiger Tiere in der 10^. Woche, wobei die Entwicklung von Lungenadenokarzinombildern in der 21^{. Woche offensichtlich} wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Mikro-CT pathologische Veränderungen in der Lunge von Mäusen effektiv beobachten und in Kombination mit der Blutentnahme aus der Submandibulavene Veränderungen des Blutes, des Proteins und der Ziele dynamisch überwachen kann. Diese Methode bietet einen hochspezifischen, einfachen und sensitiven Ansatz für Wirkstoffscreenings, pharmakokinetische Tests, toxikologische Experimente und Sicherheitsstudien.

Einleitung

Lungenkrebs (LC) ist eine schwere Neubildung, die ihren Ursprung in der Bronchialschleimhaut oder den Lungendrüsen hat. Laut Statistik aus dem Jahr 2021 verursacht LC jedes Jahr weltweit etwa zwei Millionen Todesfälle, wobei die Inzidenz- und Sterblichkeitsraten steigen¹. Eine frühzeitige Diagnose und Intervention bei LC tragen zu höheren Heilungsraten, einer geringeren Mortalität und niedrigeren Behandlungskosten bei. Lungenknoten (PN) sind spezifische Vorläufer der LC, die bei radiologischen Untersuchungen durch lokalisierte, runde und dichtere feste oder subsolide Schatten ≤30 mm Durchmesser gekennzeichnet sind, ohne Hinweise auf einen Lungenkollaps, eine mediastinale Lymphknotenvergrößerung oder einen Pleuraerguss². Das National Comprehensive Cancer Network (NCCN) kategorisierte PN im Jahr 2022 nach Anzahl, Durchmesser und Dichte und identifizierte Kombinationen wie einen 5 mm isolierten Milchglasknoten in der rechten Lunge³. Die NCCN-Leitlinien weisen jedoch darauf hin, dass das Risiko für Malignität bei PN mit dem Durchmesser und der Menge der Knötchen steigt. Die weit verbreitete Anwendung der Niedrigdosis-Computertomographie hat die Zahl der PN-Diagnosen drastisch erhöht, wobei jedes Jahr Millionen neuer Fälle identifiziert werden⁴.

Die Kombination von A/J-Mäusen mit 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) ist das am häufigsten verwendete Tiermodell für Lungenkrebs (LC)^5,6. Der Einsatz von Mikro-CT zusammen mit der Blutentnahme aus der Submandibula-Vene ist ein effektiver Ansatz für die Echtzeitüberwachung von Veränderungen von Lungenknoten (PN) zu LC. Die chemische Karzinogen-Induktion, insbesondere bei NNK- und A/J-Mäusen, ist die am weitesten verbreitete Methode zur Modellierung von Lungenkrebs und hat sich als wirksamer Ansatz zur Etablierung von Karzinomen in situ erwiesen ^7,8. Diese Modellierungsmethode simuliert den Verlauf von PN zu LC genauer als die axilläre Inokulationsmethode.

Frühere Studien konzentrierten sich auf die statistische Analyse der Knötchenmorphologie und die pathologische Färbung von Gewebeproben nach der Euthanasie⁹. Diesen Methoden fehlt jedoch die Fähigkeit, den dynamischen Verlauf von PN zu LC¹⁰ in Echtzeit zu überwachen. Die Mikro-CT als nicht-invasive Bildgebungstechnik liefert genaue Längsschnittdaten mit hoher Auflösung, schneller Bildgebung, geringer Strahlendosis und Sicherheit und eignet sich daher für die Detektion von Lungenbildern in Echtzeit ^11,12. Die Blutentnahme aus der Submandibula-Vene ist die neueste, einfachste und schnellste Methode zur Entnahme von Blutproben von Mäusen¹³. Diese nicht-invasive Technik erfordert nur minimalen Umgang mit den Tieren und ermöglicht eine schnelle Genesung, im Einklang mit den 3R-Prinzipien, die darauf abzielen, die Anzahl der in der Forschung verwendeten Tiere zu reduzieren, Beschwerden zu minimieren und eine ethische Behandlung zu fördern. Das entnommene Blutvolumen, etwa 0,2-0,5 ml, ist ausreichend für die Überwachung von Blutparametern bei moderaten Anforderungen¹⁴.

Die gleichzeitige Verwendung von Mikro-CT und Blutproben aus der submandibulären Vene ermöglicht eine dynamische Echtzeit-Beobachtung der PN-zu-LC-Progression in der Bildgebung und die Echtzeit-Erkennung wichtiger Ziele im Blutkreislauf¹⁵. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz die Echtzeituntersuchung von Metaboliten und anderen Biochemikalien, was in Kombination mit Techniken wie der Hochleistungschromatographie unser Verständnis von LC^16,17 erweitert.

In dieser Studie wurden A/J-Mäuse in Kombination mit NNK verwendet, um ein in-situ-Lungenkrebs-Mausmodell zu erstellen. Mikro-CT-Scans wurden 4, 10 und 20 Wochen nach der Modelleinleitung durchgeführt, um Lungenbilder aufzunehmen, während während des gesamten Experiments Blutproben aus submandibulären Venen entnommen wurden. Ziel dieser Studie ist es, eine Grundlage für die PN- und LC-Forschung zu schaffen, indem die Blutentnahme aus der Submandibulärvene mit der Mikro-CT kombiniert wird.

In der Onkologie ist die Mikro-CT ein hochwirksames Instrument zur Erkennung von Tumorwachstum und bietet eine hochauflösende Technik, um lokale Veränderungen des Schattenfokus jederzeit während solcher Studien zu messen^18,19. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass die Mikro-CT allein keine Informationen über die Eigenschaften des Schattenfokus, den physiologischen Status des Tieres oder das Ausmaß wichtiger biologischer Faktoren liefert. Daher wurde in dieser Studie die Probenahme der submandibulären Venen als ergänzende Methode eingesetzt.

Protokoll

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierversuche wurden von der Ethikkommission für experimentellen Tierschutz der Chengdu Universität für Traditionelle Chinesische Medizin genehmigt und in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und ethischen Standards für Tierversuche durchgeführt (Prüfnummer: 2024035). Weibliche Inzucht-A/JGpt-Mäuse (7-8 Wochen alt) wurden bei einer Temperatur von 20-24 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40%-70% gehalten. Sie erhielten in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus ad libitum Standard-Tierfutter und gereinigtes Wasser. Vor dem Experiment wurde jedes Tier 7 Tage lang an diese Umgebung gewöhnt. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Reagenzien und Zubereitung der Tiere

1. Chemikalien und Reagenzien
   1. NNK wird in Kochsalzlösung gelöst, um einen 10 mg/ml-Mastermix²⁰ zu bilden. Verabreichen Sie eine einzelne intraperitoneale Injektion von 0,2 ml mit einer Konzentration von 100 mg/kg an die NNK-Gruppe, während Sie der Blindgruppe ein gleiches Volumen an normaler Kochsalzlösung zuführen.
      HINWEIS: Befolgen Sie Jang et ^al.21 , um den Zeitpunkt für Mikro-CT-Scans und Blutentnahmen zu bestimmen.
2. Blutentnahme
   HINWEIS: Um die Gesundheit der Mäuse zu gewährleisten, begrenzen Sie die Blutentnahme auf nicht mehr als 0,2 ml zu jedem Zeitpunkt und warten Sie eine Woche für die Genesung. Aufgrund des Überflusses an Haaren im submentalen Bereich ist darauf zu achten, dass die Blutprobe während der Entnahme nicht mit Haaren kontaminiert wird.
   1. Entfernen Sie die Gesichtsbehaarung des Tieres am Tag vor dem Versuch mit einem geeigneten Rasierer.
   2. Fassen Sie die Haut an der hinteren Seite des Mauskopfes mit der linken Hand fest, um jede Bewegung zu verhindern und den Kopf der Maus in einer festen Position zu halten.
   3. Führen Sie die Blutentnahmenadel aus dem Unterkieferbereich hinter der schrägen Augenhöhle zügig in die Arteria submaxillaris ein. Halten Sie die Nadel mindestens 3 s lang an Ort und Stelle, um einen optimalen Blutfluss zu ermöglichen. Sammeln Sie 50-200 μl Blut.
   4. Sammle das Blut in ein EDTA-Röhrchen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um sanften Druck auf die Haut auszuüben, um Blutungen zu stoppen. Sobald die Blutung aufgehört hat, lassen Sie die Maus los und beobachten Sie sie 30 s lang.
   5. Rühren Sie das Reagenzglas vorsichtig um, um sicherzustellen, dass das Blut gründlich mit dem Gerinnungsmittel vermischt ist.
   6. Geben Sie für routinemäßige Blutuntersuchungen das gesammelte Blut in das veterinärmedizinische Blutroutinetestgerät, drücken Sie die Entnahmetaste und lassen Sie das Instrument das Blut sammeln. Notieren Sie die angezeigten Ergebnisse. Entsorgen Sie das restliche Blut sicher.

2. In-vivo-Bildgebung mittels Mikro-CT

HINWEIS: Entfernen Sie immer Metallgegenstände, wie z. B. Ohrmarken, vom Versuchstier, bevor Sie den Mikro-CT-Scan verwenden. Metallobjekte können schwere Artefakte im Bild verursachen. Mikro-CT sendet eine bestimmte Menge an Strahlung aus; Stellen Sie sicher, dass andere Versuchsergebnisse nicht beeinflusst werden.

1. Starten Sie das Gerät, starten Sie die Micro-CT-Software und führen Sie die Sondenkalibrierung und das Aufwärmen durch. Verwenden Sie zum Scannen das mausspezifische Werkzeugbett.
2. Erstellen Sie eine neue Datenbank, und benennen Sie sie für diesen Scan, oder verbinden Sie sie mit einer vorhandenen Datenbank.
3. Ändern Sie die Parameter im Software-Setup-Fenster. Stellen Sie den Röntgenfilter auf Cu0,06 + Al0,5 ein, mit einer Spannung von 70 kV, einem Strom von 80 μA, einem Sichtfeld von 36 mm × 36 mm, 360°-Rotationsabtastung und einer Scanzeit von 4 min²².
4. Betäuben Sie die Mäuse mit 3 % Isofluran, bevor Sie²³ scannen (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Öffnen Sie den Micro-CT-Bildschirm und befestigen Sie die Mäuse mit Klebeband auf dem Werkzeugbett. Halten Sie die Anästhesie kontinuierlich mit einer Nasensonde aufrecht, die im Mikro-CT-Instrument auf dem Werkzeugbett platziert wird.
5. Führen Sie das Tier vorsichtig in das Gerät und überwachen Sie seine Position in Echtzeit. Verwenden Sie die entsprechenden Tasten, um die Position der Maus anzupassen und sicherzustellen, dass ihre Brust im Sichtfeld vollständig sichtbar ist.
6. Drehen Sie das Werkzeugbett um 90°, um die Maus zu positionieren. Verwenden Sie die Tasten, um die Position der Maus anzupassen, und stellen Sie sicher, dass sich die Lungenregion mittig im Sichtfeld befindet. Bringen Sie dann das Werkzeugbett wieder in seine ursprüngliche Position.
7. Um den Scan zu starten, wählen Sie die Schaltfläche Scannen . Lassen Sie das System den Scan ohne Unterbrechung abschließen, und vermeiden Sie es, den Bildschirm während des Vorgangs zu öffnen. Beobachten Sie die transaxialen, koronalen und sagittalen Schnitte der Rekonstruktion mit der Software.
8. Bewerten Sie die Bildqualität unmittelbar nach dem Scan. Wenn Artefakte oder verschwommene Bilder angezeigt werden, wiederholen Sie den Scanvorgang.
9. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Gerät und überwachen Sie ihren Gesundheitszustand, um sicherzustellen, dass sie in stabilem Zustand sind, bevor Sie sie in ihre Käfige zurückbringen.
10. Entfernen Sie am Ende des Experiments das Klebeband vom Werkzeugbett und reinigen Sie dann das Bett. Speichern Sie die Daten und schalten Sie das Gerät aus.
11. Bringen Sie die Mäuse vorsichtig zurück in ihre Käfige, um Stress zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass die Käfige sauber sind und eine angemessene Einstreu haben.
12. Überwachen Sie die Mäuse auf Anzeichen einer Genesung nach der Narkose. Beobachte ihr Verhalten, ihre Mobilität und ihren Appetit. Stellen Sie bei Bedarf Futter und Wasser bereit.
13. Halten Sie eine warme Umgebung für die Mäuse aufrecht, um eine Unterkühlung nach der Anästhesie zu verhindern. Verwenden Sie bei Bedarf Heizkissen oder Decken.
14. Führen Sie in der nächsten Woche tägliche Gesundheitschecks durch. Achte auf Anzeichen von Stress, ungewöhnlichem Verhalten oder Verletzungen. Dokumentieren Sie Beobachtungen für jede Maus.
15. Wenn eine Maus Anzeichen von Krankheit oder Stress zeigt, konsultieren Sie einen Tierarzt, um geeignete Interventionen und Behandlungen zu erhalten.
16. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse wieder in ihre normalen Haltungsbedingungen zurückkehren, nachdem sie sich vollständig erholt haben und stabil sind.

3. Datenverarbeitung und -analyse

1. Verwenden Sie Statistik- und Grafiksoftware als wertvolles Werkzeug für die Datenanalyse und die Erstellung von Tabellen zur Präsentation der Ergebnisse.
2. Öffnen Sie die Software. Wählen Sie XY-Diagramme aus der neu erstellten Datentabelle aus, geben Sie die wöchentlichen Daten für die NNK- und Kontrollgruppen ein und generieren Sie ein Diagramm, das die Änderungen des Gewichts der Mäuse anzeigt.
3. Öffnen Sie die Software erneut, wählen Sie das Kontingenzdiagramm aus der neu erstellten Datentabelle aus, geben Sie die Blutroutinedaten für die NNK-Gruppe und die Kontrollgruppe ein und generieren Sie ein Symbol.
4. Wählen Sie die Analyseoptionen in der Software aus. Analysieren Sie die Gesamtdaten mit einer unidirektionalen ANOVA, gefolgt von der Verifizierung der Daten durch die Implementierung eines t-Tests. Markieren Sie signifikante Unterschiede.
5. Speichern Sie die Micro-CT-Daten im SimpleViewer-Format oder DICOM. Öffnen Sie die SimpleViewer-Software und beobachten Sie die Bilddaten unter Anleitung eines professionellen Arztes für Bildgebung. Beschriften Sie die Knötchen und quantifizieren Sie das Schattenvolumen mit den bereitgestellten Messwerkzeugen.

Ergebnisse

Diese Studie zeigte die Konstruktion eines stabilen Lungenkrebsmodells unter Verwendung von NNK in Kombination mit A/J-Mäusen. Das Versuchsdesign ist in Abbildung 1 dargestellt. Ziel war es, den Echtzeitprozess des Übergangs von Lungenknoten (PN) zu Lungenkrebs (LC) in der Lunge von Mäusen mit Hilfe von Mikro-CT und Blutproben aus der Submandibulärvene zu beobachten. Dementsprechend wurden in der vierten, zehnten und zwanzigsten Woche Mikro-CT-Scans und ...

Diskussion

Es ist wichtig, einige wichtige Punkte aus dieser Studie noch einmal zu wiederholen. Erstens, obwohl die Blutentnahme aus der Unterkiefervene ein relativ verletzungsarmes Verfahren ist, kann sie dennoch zu einem gewissen Grad an Schäden für die Tiere führen. Daher ist es notwendig, mehrere Verfahren durchzuführen, um die Belastung der Mäuse zu verringern und den Prozess rechtzeitig abzuschließen²⁷. Zweitens stellt die Entfernung von Haaren vor der Blutentnah...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/J mice	GemPharmatech LLC.	N000018
0.5 mL EDTA tubes	Labshark	130201070
1-Butanone,4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridinyl)	Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.	N589770
75% ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
Animal shaver	Codos	BM010220
Isoflurane	Shenzhen Reward Life Technology Co.	R510-22-16
medical tricorder	MedChemexpress	69652
Quantum GX2 microCT imaging system	PerkinElme	2020166501
Saline (medicine)	Beijing Biolabs Technology Co.	GL1736‌