Мониторинг прогрессирования легочного узла с помощью микрокомпьютерной томографии и забора крови на мышиной модели

Резюме

Этот протокол описывает эффективный, простой и минимально инвазивный метод исследования легочных узелков. В качестве методов исследования используются забор крови из подчелюстных вен и микрокомпьютерная томография.

Аннотация

Микрокомпьютерная томография (микрокомпьютерная томография) — это интуитивно понятный, чувствительный и минимально инвазивный метод в режиме реального времени для мониторинга изменений от легочных узлов (ПН) до рака легких (ЛК). Интеграция отбора проб крови из подчелюстных вен обеспечивает быстрое, стабильное и простое обнаружение визуализации и ключевых изменений мишени во время прогрессирования ПН в ЛК. В этом исследовании мы вводили дозу 100 мг/кг 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанона мышам типа A/J для разработки модели аденокарциномы легкого. Прогрессирование заболевания у экспериментальных животных затем контролировалось с помощью забора крови из подчелюстных вен и микрокомпьютерной томографии. Результаты эксперимента показали наличие узловых очагов в легких у некоторых животных к^10-й неделе, при этом развитие изображений аденокарциномы легкого стало очевидным к^21-й неделе. В заключение следует отметить, что микрокомпьютерная томография может эффективно наблюдать за патологическими изменениями в легких мышей и, в сочетании с забором крови из подчелюстных вен, может динамически контролировать изменения крови, белка и мишеней. Этот метод обеспечивает высокоспецифичный, простой и чувствительный подход к скринингу лекарственных средств, фармакокинетическим испытаниям, токсикологическим экспериментам и исследованиям безопасности.

Введение

Рак легких (РЛ) – это тяжелое новообразование, возникающее в слизистой оболочке бронхов или легочных железах. Согласно статистическим данным за 2021 год, LC ежегодно становится причиной около двух миллионов смертельных случаев во всем мире, при этом показатели заболеваемости и смертности растут¹. Ранняя диагностика и вмешательство при ЛК способствуют повышению показателей излечения, снижению смертности и снижению затрат на лечение. Легочные узелки (ПН) являются специфическими предшественниками ЛК, характеризуются локализованными, круглыми и более плотными твердыми или субтвердыми тенями ≤30 мм в диаметре при рентгенологических исследованиях, без признаков коллапса легкого, увеличения медиастинальных лимфатических узлов или плеврального выпота². Национальная комплексная онкологическая сеть (NCCN) в 2022 году классифицировала ПН по количеству, диаметру и плотности, выявив такие комбинации, как изолированный 5 мм узел из матового стекла в правом легком³. Тем не менее, в рекомендациях NCCN указано, что риск малигнизации при ПП увеличивается с диаметром и количеством узелков. Широкое применение низкодозной компьютерной томографии привело к резкому увеличению числа диагнозов ПН,^{при этом ежегодно} выявляются миллионы новых случаев4.

Комбинация мышей типа A/J с 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутаноном (NNK) является наиболее часто используемой животной моделью рака легких (LC)^5,6. Использование микрокомпьютерной томографии в сочетании с забором крови из подчелюстных вен является эффективным подходом к мониторингу изменений от легочных узлов (ПН) к ЛК в режиме реального времени. Индукция химических канцерогенов, особенно на мышах NNK и A/J, является наиболее распространенным методом моделирования рака легких и доказала свою эффективность при установлении карциномы in situ ^7,8. Этот метод моделирования более точно моделирует прогрессирование PN в LC по сравнению с методом подмышечной инокуляции.

Предыдущие исследования были сосредоточены на статистическом анализе морфологии узелков и патологическом окрашивании образцов тканей после эвтаназии^. Однако эти методы не позволяют в режиме реального времени отслеживать динамическое развитие от PN к LC¹⁰. Микрокомпьютерная томография, как неинвазивный метод визуализации, обеспечивает точные продольные данные с высоким разрешением, быстрой визуализацией, низкой дозой облучения и безопасностью, что делает ее пригодной для обнаружения изображений легких в режиме реального времени^11,12. Забор крови из подчелюстных вен является новейшим, самым простым и быстрым методом получения образцов крови у мышей¹³. Этот неинвазивный метод требует минимального обращения с животными и обеспечивает быстрое выздоровление, в соответствии с принципами 3R, направленными на сокращение количества животных, используемых в исследованиях, минимизацию дискомфорта и продвижение этичного обращения. Объем собранной крови, примерно 0,2-0,5 мл, достаточен для контроля параметров крови при умеренных потребностях¹⁴.

Одновременное использование микрокомпьютерной томографии и забора крови из подчелюстных вен позволяет в режиме реального времени наблюдать за прогрессированием PN-to-LC на визуализации и обнаруживать в режиме реального времени ключевые мишени^{в кровотоке}. Кроме того, этот подход позволяет исследовать метаболиты и другие биохимические вещества в режиме реального времени, что в сочетании с такими методами, как высокоэффективная хроматография, расширяет наше понимание LC^16,17.

В этом исследовании мыши A/J в сочетании с NNK были использованы для создания мышиной модели рака легких in-situ. Микрокомпьютерная томография проводилась через 4, 10 и 20 недель после индукции модели для получения изображений легких, в то время как кровь собиралась с помощью забора подчелюстных вен на протяжении всего эксперимента. Данное исследование направлено на создание основы для исследований ПН и ЛК путем комбинирования забора крови из подчелюстных вен с микрокомпьютерной томографией.

В онкологии микрокомпьютерная томография является высокоэффективным инструментом для обнаружения опухолевого роста, предлагая технику с высоким разрешением для измерения локальных изменений теневого фокуса в любое время во время таких исследований^18,19. Тем не менее, важно признать, что микро-КТ сама по себе не дает информации о характеристиках теневого фокуса, физиологическом статусе животного или уровнях ключевых биологических факторов. Таким образом, в данном исследовании в качестве дополнительного метода был использован забор подчелюстных вен.

протокол

Все эксперименты на животных, описанные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по этике благополучия экспериментальных животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду и проводились в соответствии с соответствующими законами и этическими стандартами для исследований на животных (номер обзора: 2024035). Самки инбредных мышей A/JGpt (в возрасте 7-8 недель) содержались при температуре 20-24 °C с относительной влажностью 40%-70%. Они получали стандартный корм для животных и очищенную воду в неограниченном количестве в течение 12-часового цикла «свет-темнота». Перед экспериментом каждое животное акклиматизировалось к этой среде в течение 7 дней. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Реагенты и препараты животного происхождения

1. Химикаты и реактивы
   1. Растворите NNK в физрастворе с образованием мастер-смеси 10 мг/мл²⁰. Однократное внутрибрюшинное введение 0,2 мл с концентрацией 100 мг/кг в группу ННК, при этом в бланковую группу вводится равный объем нормального физиологического раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте за Jang et ^al.21 , чтобы определить время проведения микрокомпьютерной томографии и забора крови.
2. Забор крови
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить здоровье мышей, ограничьте сбор крови не более чем 0,2 мл за каждый раз и дайте одну неделю на восстановление. Из-за обилия волос в подбородочной области следите за тем, чтобы не допустить загрязнения образца крови волосами во время сбора.
   1. Удалите волосы на морде животного за день до эксперимента с помощью подходящей бритвы.
   2. Крепко возьмитесь левой рукой за кожу на задней стороне головы мыши, чтобы предотвратить любое движение и удерживать голову мыши в фиксированном положении.
   3. Быстро введите иглу для сбора крови в подчелюстную артерию из нижней челюсти за косой глазницей. Удерживайте иглу на месте не менее 3 с, чтобы обеспечить оптимальный кровоток. Соберите 50-200 μл крови.
   4. Соберите кровь в пробирку с ЭДТА. С помощью ватного тампона слегка надавите на кожу, чтобы остановить кровотечение. Как только кровотечение прекратится, отпустите мышь и наблюдайте за ней в течение 30 с.
   5. Аккуратно взбалтывайте пробирку, чтобы убедиться, что кровь тщательно перемешана с коагулянтом.
   6. Для рутинного анализа крови поместите собранную кровь в ветеринарный прибор для рутинного анализа крови, нажмите кнопку сбора и дайте инструменту собрать кровь. Запишите отображаемые результаты. Безопасно утилизируйте оставшуюся кровь.

2. Визуализация in vivo с помощью микрокомпьютерной томографии

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием микрокомпьютерной томографии всегда удаляйте металлические предметы, такие как ушные бирки, с подопытного животного. Металлические предметы могут привести к серьезным артефактам на изображении. Микро-КТ излучает определенное количество излучения; Убедитесь, что это не повлияет на другие экспериментальные результаты.

1. Запустите устройство, запустите программное обеспечение микро-КТ и выполните калибровку и прогрев датчика. Для сканирования используйте платформу для инструментов, предназначенную для мыши.
2. Создайте новую базу данных и присвойте ей имя для сканирования или подключите ее к существующей базе данных.
3. Измените параметры в окне настройки программного обеспечения. Установите рентгеновский фильтр на Cu0,06 + Al0,5, напряжение 70 кВ, ток 80 мкА, поле зрения 36 мм × 36 мм, вращательное сканирование на 360° и время сканирования 4 мин²².
4. Анестезируйте мышей 3% изофлураном перед сканированием²³ (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Откройте экран просмотра микро-КТ и закрепите мышей на ложе для инструментов с помощью клейкой ленты. Непрерывно поддерживайте анестезию с помощью назогастрального зонда, помещенного в инструмент микрокомпьютерной томографии на ложе для инструментов.
5. Осторожно направляйте животное в аппарат и следите за его положением в режиме реального времени. Используйте соответствующие кнопки для регулировки положения мыши, чтобы ее грудь была полностью видна в поле зрения.
6. Поверните станину с инструментом на 90°, чтобы расположить мышь. Используйте кнопки для регулировки положения мыши, следя за тем, чтобы область легких располагалась по центру в поле зрения. Затем верните станину для инструмента в исходное положение.
7. Чтобы начать сканирование, нажмите кнопку Сканировать . Позвольте системе завершить сканирование без прерывания и не открывайте экран просмотра во время процесса. Наблюдайте за трансаксиальными, корональными и сагиттальными срезами реконструкции с помощью программного обеспечения.
8. Оцените качество изображения сразу после сканирования. Если появились артефакты или размытые изображения, повторите процедуру сканирования.
9. Извлеките мышей из аппарата и следите за их здоровьем, чтобы убедиться, что они находятся в стабильном состоянии, прежде чем возвращать их в клетки.
10. В конце эксперимента снимите клейкую ленту со станины для инструментов, затем очистите станину. Сохраните данные и выключите прибор.
11. Осторожно переведите мышей обратно в клетки, чтобы свести к минимуму стресс. Убедитесь, что клетки чистые и имеют соответствующую подстилку.
12. Следите за мышами на предмет признаков восстановления после анестезии. Наблюдайте за их поведением, подвижностью и аппетитом. Обеспечьте едой и водой по мере необходимости.
13. Поддерживайте теплую среду для мышей, чтобы предотвратить переохлаждение после анестезии. При необходимости используйте грелки или одеяла.
14. Проводите ежедневные медицинские осмотры в течение следующей недели. Ищите признаки стресса, необычного поведения или любых травм. Задокументируйте наблюдения для каждой мыши.
15. Если у какой-либо мыши проявляются признаки болезни или стресса, проконсультируйтесь с ветеринаром для соответствующего вмешательства и ухода.
16. Убедитесь, что мыши возвращаются в свои нормальные жилищные условия после того, как они полностью выздоровеют и будут стабильны.

3. Обработка и анализ данных

1. Используйте программное обеспечение для статистики и построения графиков в качестве ценного инструмента для анализа данных и создания таблиц для представления результатов.
2. Откройте программу. Выберите графики XY из вновь созданной таблицы данных, введите еженедельные данные для NNK и контрольной групп и создайте диаграмму, отображающую изменения веса мышей.
3. Снова откройте программное обеспечение, выберите диаграмму непредвиденных обстоятельств из вновь созданной таблицы данных, введите рутинные данные крови для группы NNK и контрольной группы и сгенерируйте значок.
4. Выберите параметры анализа в программном обеспечении. Проанализируйте общие данные с помощью одностороннего анализа ANOVA с последующей проверкой данных с помощью внедрения t-критерия. Отметьте существенные отличия.
5. Сохраните данные микрокомпьютерной томографии в формате SimpleViewer или DICOM. Откройте программное обеспечение SimpleViewer и наблюдайте за данными визуализации под руководством профессионального врача. Пометьте узелки и количественно оцените объем теней с помощью предоставленных измерительных инструментов.

Результаты

Это исследование продемонстрировало построение стабильной модели рака легких с использованием NNK в сочетании с мышами A/J. План эксперимента проиллюстрирован на рисунке 1. Цель исследования состояла в том, чтобы наблюдать в реальном времени за процесс?...

Обсуждение

Важно повторить несколько ключевых моментов из этого исследования. Во-первых, хотя забор крови из подчелюстных вен является относительно малотравматичной процедурой, он все же может привести к некоторой степени вреда для животных. Поэтому необходимо провести нескол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/J mice	GemPharmatech LLC.	N000018
0.5 mL EDTA tubes	Labshark	130201070
1-Butanone,4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridinyl)	Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.	N589770
75% ethanol	ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd	2023052901
Animal shaver	Codos	BM010220
Isoflurane	Shenzhen Reward Life Technology Co.	R510-22-16
medical tricorder	MedChemexpress	69652
Quantum GX2 microCT imaging system	PerkinElme	2020166501
Saline (medicine)	Beijing Biolabs Technology Co.	GL1736‌