从全血中分离和鉴定低密度和正常密度中性粒细胞

摘要

在这里，我们提供了一种可靠的方法，使用磁性分离（阴性选择）和不连续密度梯度培养基从全血中分离低密度和正常密度的中性粒细胞。它确保高纯度细胞 （≥93%） 的原样分离，有助于对中性粒细胞亚群进行准确的下游分析，这对于了解它们在健康和疾病中的作用至关重要。

摘要

新兴研究表明，人类循环的中性粒细胞群体由多种亚型组成，不应像历史上那样作为一个单一群体进行研究。特别是，低密度和正常密度中性粒细胞 （LDN， NDN） 已被证明在功能和代谢上具有不同的特征，这是发表中性粒细胞研究时必须考虑的一个因素。在这里，我们提出了一种从全血中原样分离和分离 LDN 和 NDN 的改进方法。

将密度梯度培养基 （1.135 g/mL） 以 9:10 与 10x PBS 混合。随后通过将 100% 密度梯度培养基与 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 混合来获得 55%、70% 和 81% 的比密度梯度。使用基于阴性选择的磁性分离试剂盒从同意的供体获得的 12mL 外周全血中分离的中性粒细胞以 55% 组分重悬。将 3 mL 体积的 81% 和 70% 级分分层到 15 mL 试管中，然后是含有总中性粒细胞的 55% 级分。然后将密度梯度以 720 x g 离心 30 分钟。在 55%/70% 界面 （LDN） 和 70%/81% 界面 （NDN） 处获得两个不同的频带。将细胞小心地移液到单独的试管中，并使用 PBS 洗涤。使用流式细胞术测定分离级分的纯度。流式细胞术将 LDNs 和 NDNs 定义为 CD14lo CD15 + SSChi。计算出两种类型的分离纯度为 ≥93% 的活细胞。

该方法为从外周血中分离 LDN 和 NDN 提供了一种可靠且有效的方法，可确保分离细胞的高纯度和活力。提高中性粒细胞分离的精度有助于对这些不同的中性粒细胞亚群进行更准确的下游分析。这些对于促进我们对中性粒细胞异质性及其在各种生理和病理背景下的影响的理解至关重要。

引言

中性粒细胞是颗粒状免疫细胞，是外周血中最丰富的白细胞，平均约占白细胞的 50%-70%。它们在骨髓中从粒细胞-单核细胞前体 （GMP） 发育而来，而粒细胞-单核细胞前体 （GMP） 又在粒细胞集落刺激因子 （G-CSF） 存在下从造血祖细胞 （HPC） 发育而来。在稳态下，它们的寿命为 ~24 小时，但研究表明，它们的寿命可以在特定的生理条件及其相关的微环境中延长，例如慢性免疫激活¹、炎症¹，甚至组织驻留在稳态²。长期以来，中性粒细胞一直被认为是抵御病原体的第一道防线，并通过 3 个主要效应器功能——脱颗粒、吞噬作用和中性粒细胞细胞外陷阱 （NET） 激活和释放 （NETosis）——引发其抗微生物作用。

大多数关于中性粒细胞功能和生物学的研究都检查了总中性粒细胞群体的结果。然而，从描绘 N1（抗肿瘤）/N2（促肿瘤）亚型的癌症环境中的研究到基于成熟度、疾病和生理状态，甚至细胞密度（低密度和正常密度中性粒细胞）对中性粒细胞进行分类，越来越明显的是人类中性粒细胞群体构成表型多样化的亚型。无论这些中性粒细胞亚型的存在可以归因于完全不同的细胞类型还是由于可塑性的复杂性，存在越来越多的关于非典型中性粒细胞的文献，并为研究与正常密度中性粒细胞分开的低密度中性粒细胞提供了令人信服的机会³。

LDN 首次在 SLE 患者中被描述为促炎性中性粒细胞亚群⁴，此后在慢性疾病、妊娠甚至健康循环中被发现具有促炎和抑制能力 ^5,6,7,8。当全血在密度梯度培养基上离心时，LDN 与外周血单核细胞 （PBMC） 同时被发现。它们的比密度约为 1.077 g/mL，而 NDN 的比密度为 1.083 g/^mL9。虽然关于这个问题仍然存在相当大的争论，但有人猜测 LDN 类似于更不成熟的粒细胞表型（类似于早幼粒细胞和中幼粒细胞，密度低于 1.080 g/mL）^9,10。其他人仍然推测，根据疾病的存在与否，存在成熟和未成熟的 LDN 表型 11,12,13。尽管如此，在健康个体中也检测到了 LDN;然而，由于难以以足够数量分离它们，它们在一些研究中的纳入受到限制⁵。

本研究旨在分离这两个群体的数量，以便我们进行下游原位代谢实验（最小 0.5 × 10⁶ 个细胞/mL）。在此过程中，使用通常报道的表型标志物^13,14 优化了现有方案⁵，^这些标志物为从全血中分离和表征 LDN 和 NDN 提供了最佳结果（图 1A）。

研究方案

在健康参与者的知情同意下采集血样。该研究获得了圣詹姆斯医院和塔拉特大学医院研究伦理委员会的批准。

1. 密度梯度培养基、等渗工作溶液馏分和细胞分离缓冲液的制备

1. 从密度梯度介质制备等渗工作溶液
   1. 等渗 100% 工作溶液 （~1.123 g/mL） 的制备
      1. 要制备等渗 100% 工作溶液，请将 27 mL 密度梯度培养基与 3 mL 10x PBS 混合。这会产生适合进一步稀释的等渗溶液。
   2. 等渗 81% 工作溶液 （~1.0996 g/mL） 的制备
      1. 通过将 8.1 mL 等渗 100% 工作溶液（在步骤 1.1.1 中制备）与 1.9 mL 的 1x PBS 混合，制备等渗 81% 工作溶液。充分混合以确保均匀性。
   3. 制备等渗 70% 工作溶液 （~1.0861 g/mL）
      1. 要制备等渗 70% 工作溶液，请将 7 mL 等渗 100% 工作溶液与 3 mL 1x PBS 混合。确保溶液充分混合。
   4. 等渗 55% 工作溶液 （1.0676 g/mL） 的制备
      1. 通过将 5.5 mL 等渗 100% 工作溶液与 4.5 mL 的 1x PBS 混合，制成等渗 55% 工作溶液。充分混合。
2. 梯度分数的分层
   1. 梯度分数分层
      1. 使用 15 mL 锥形管，小心地将 3 mL 等渗 81% 工作溶液置于底部。然后，缓慢而轻柔地将 3 mL 等渗 70% 工作溶液涂在上面，避免混合各层。该梯度将用于细胞分离。
3. 细胞分离缓冲液的制备
   1. 制备 500 mL 细胞分离缓冲液
      1. 为了制备细胞分离缓冲液，将 2% 胎牛血清 （FBS） 和 1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 与 1x PBS 混合，总体积为 500 mL。在分离过程中，使用此缓冲液洗涤和重悬细胞。
         注意:确保各层分离良好且不受干扰。在该方案中，根据制备方法，等渗工作溶液称为"100%"、"81%"、"70%"和"55%"，与以前的研究一致⁵。但是，需要澄清的是，这些标签并不代表工作溶液的实际最终浓度。例如，通过将 27 mL 纯密度梯度填料与 3 mL 10x PBS 混合来制备"100%"密度梯度填料，得到最终浓度为 90% 的等渗工作溶液。随后的稀释度（例如，"81%"、"70%"和"55%"）同样反映制备比率，而不是真实百分比浓度。保留此命名法是为了与有关该主题的早期文献中使用的术语保持一致。

2. 使用阴性选择从全血中分离中性粒细胞

1. 磁珠的制备
   1. 将磁珠彻底涡旋 30 秒，以确保它们在使用前完全重悬。
2. 血液制备
   1. 对于每个供体，将 4 mL 全血分装到三个独立的 14 mL 圆底管中。
3. 添加中性粒细胞分离混合物和磁珠
   1. 向每根试管中加入 50 μL 中性粒细胞分离混合物和 50 μL 磁珠/mL 血液。对于 4 mL 血液，每种试剂添加 200 μL。
   2. 轻轻移液，将混合物重悬，并在室温 （RT） 下孵育 5 分钟，以使试剂与不需要的细胞结合。
4. 清洗和磁分离 - 第一轮
   1. 使用细胞分离缓冲液将每管加满至 12 mL，并充分混合。
   2. 将没有盖子的试管放在磁铁上，让它们在 RT 下孵育 10 分钟，以使与不需要的细胞结合的磁珠被吸引到试管壁上。
5. 未结合细胞的集合
   1. 使用移液管小心地将含有嗜中性粒细胞的透明细胞悬液从每个试管转移到新的干净试管中。从磁铁上取下原管。
6. 磁珠重新应用和孵育 - 第二轮
   1. 再次涡旋磁珠 30 秒。向新转移的细胞悬液中加入与步骤 2.3 中相同体积的磁珠。彻底重悬并在 RT 下再孵育 5 分钟。
7. 最终磁分离和收集
   1. 将试管放回不带盖的磁力架上，并在室温下再孵育 10 分钟。
   2. 小心地将透明细胞悬液转移到新试管中。这种最终悬浮液代表分离的总中性粒细胞群。

3. 从总中性粒细胞群中分离低密度中性粒细胞 （LDN） 和正常密度中性粒细胞 （NDN）

1. 细胞悬液的混合和制备
   1. 对于每个供体，将分离的中性粒细胞悬液汇集到 50 mL 试管中。使用细胞分离缓冲液将每根试管加满至总体积为 50 mL。
2. 离心
   1. 在室温下以 400 x g 离心管 5 分钟，并打开制动器。
3. 重悬和细胞计数
   1. 弃去上清液，将中性粒细胞沉淀重悬于 1 mL 细胞分离缓冲液中。进行细胞计数以确定中性粒细胞的总数。
4. 密度梯度培养基制备
   1. 在室温下再次以 400 x g 离心试管 5 分钟，并打开制动器。弃去上清液，将中性粒细胞沉淀重悬于 3 mL 的 55% 密度梯度培养基中。为获得最佳分离度，每 5-6 × 10⁶ 个总中性粒细胞使用 3 mL 55% 密度梯度培养基。
   2. 如有必要，将重悬的细胞分装在多个预制的密度梯度管中，确保每个试管中分层 3 mL 细胞悬液。
5. 分层到密度梯度管上
   1. 将含有 55% 密度梯度培养基的 3 mL 细胞悬液缓慢分层到预制的密度梯度管上（如第 1 节所述制备）。确保仔细分层以避免干扰渐变。
6. 密度梯度离心
   1. 将试管以 720 x g 离心 30 分钟，而不使用制动器。离心后，小心处理试管，以免干扰各层。
7. 中性粒细胞组分的分离
   1. 离心后，观察中性粒细胞分离成两个不同的层:
      低密度中性粒细胞 （LDN） 将位于 55%/70% 界面，在大约 3 mL 标记处形成上带，正常密度中性粒细胞 （NDN） 将位于 70%/81% 界面，在 6 mL 标记周围显示为下带。
   2. 使用移液管小心地分离每一层并将它们转移到单独的 15 mL 试管中。
8. 分离组分的洗涤
   1. 要洗去任何残留密度梯度培养基，向每个 15 mL 试管中加入 1x PBS，直至达到 15 mL 标记。
   2. 在 RT 下以 400 × g 离心 5 分钟，并打开制动器。如果细胞没有形成坚硬的沉淀，而是保持悬浮状态，请重复此洗涤步骤，表明存在剩余的密度梯度培养基。
9. 细胞计数和下游应用
   1. 对每个组分中的细胞进行计数，并根据需要进行下游应用，例如代谢实验、流式细胞术染色、RNA 提取或蛋白质裂解。
      注:将细胞铺板后，建议将板以 210 × g 离心 1 分钟（制动关闭）。

4. 分离的 LDN 和 NDN 的表型

1. × 10^{个 6 个} LDN 和 NDN 分离 ~0.5-1。使用 CD14、CD86、CD15、CD16、CD10、Fc 阻滞剂和活力染料制备 2x 浓缩抗体预混液。
2. 用等体积的抗体预混液对分离的 LDN 和 NDN 群进行染色，使对细胞染色的抗体的最终稀释度分别为 1:100（CD14、CD86、CD15、CD16、CD10、Fc 阻滞）和 1:50（活力染色）。
3. 将细胞在 RT 下避光孵育 10 分钟。
   注:确保细胞与抗体预混液和 Fc 模块充分混合。
4. 用 PBS 洗涤细胞一次，然后以 400 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。
5. 将细胞在 1% 多聚甲醛 （PFA） 中在室温下在黑暗中固定 15 分钟。
6. 再次用 PBS 洗涤细胞，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
7. 将细胞重悬于 200 μL PBS 中或根据需要使用，并尽快在流式细胞仪上采集细胞。
   注:染色和固定的细胞可以在 4 ^◦C 的黑暗中短期储存，以防止荧光团发生光漂白。然而，理想情况下，应在染色和固定后立即进行表型分析程序，以确保最佳细胞活力和准确的结果。

结果

在图 1B 中可以观察到总嗜中性粒细胞在密度梯度培养基上的成功分层。应获得两个不同的条带。如果发生梯度混合，或者每管分层的总嗜中性粒细胞数量很高（大于大约 5-6 × 10⁶），条带看起来是弥漫的（图 1C），并且两种嗜中性粒细胞亚型混合的风险显着增加。为避免后者，我们建议每个密度梯度管最多分层 5-6 × 10...

讨论

在这里，我们提出了一种将总中性粒细胞群分裂为低密度和正常密度中性粒细胞的优化方法，以及使用适用于先前方法的流式细胞术对每种细胞类型的表型表征⁵。

该方案基于从全血中分离 LDN 和 NDN。一个关键步骤是通过阴性选择方法分离总中性粒细胞。阳性选择方法涉及使用与表面标志物结合的抗体，这可能会激活中性粒细胞并触...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube (17 x 100 mm)	Corning Science	352059
APC anti-human CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)	BioLegend	312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep Magnet	StemCell Technologies	#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)	StemCell Technologies	#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	StemCell Technologies	#19666
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)	BioLegend	302005
OneComp eBeads Compensation Beads	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 anti-human CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 anti-human CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
Phosphate-Buffered Saline Tablets	Gibco	18912-014
Zombie NIR Fixable Viability Kit	BioLegend	423105