L'isolamento e la caratterizzazione di neutrofili a bassa e normale densità da sangue intero

Riepilogo

In questo caso, forniamo un approccio affidabile per isolare neutrofili a bassa e normale densità dal sangue intero utilizzando l'isolamento magnetico (selezione negativa) e il mezzo a gradiente di densità discontinuo. Garantisce l'isolamento intatto di cellule ad alta purezza (≥93%), facilitando un'analisi accurata a valle delle sottopopolazioni di neutrofili, fondamentale per comprendere il loro ruolo nella salute e nella malattia.

Abstract

Ricerche emergenti mostrano che la popolazione di neutrofili circolanti nell'uomo è costituita da diversi sottotipi e non dovrebbe essere studiata come un'unica popolazione, come è stato fatto storicamente. In particolare, è stato dimostrato che i neutrofili a bassa e normale densità (LDN, NDN) hanno profili funzionalmente e metabolicamente distinti, un fattore che deve essere considerato quando si pubblica una ricerca sui neutrofili. Qui, presentiamo un metodo modificato per l'isolamento e la separazione intatti di LDN e NDN dal sangue intero.

Il mezzo del gradiente di densità (1,135 g/mL) viene combinato a 9:10 con 10x PBS. Successivamente vengono realizzati gradienti di densità specifici del 55%, 70% e 81% combinando il mezzo di gradiente di densità al 100% con soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS). I neutrofili isolati da 12 mL di sangue intero periferico ottenuto da donatori consenzienti utilizzando un kit di isolamento magnetico basato sulla selezione negativa vengono risospesi nella frazione al 55%. Un volume di 3 mL delle frazioni dell'81% e del 70% viene stratificato in una provetta da 15 mL, seguito dalla frazione al 55% contenente neutrofili totali. I gradienti di densità vengono quindi centrifugati a 720 x g per 30 minuti. Si ottengono due bande distinte all'interfaccia 55%/70% (LDN) e all'interfaccia 70%/81% (NDN). Le cellule vengono accuratamente pipettate in provette separate e lavate con PBS. La purezza delle frazioni isolate viene determinata mediante citometria a flusso. Sia LDN che NDN sono stati definiti CD14lo, CD15+, SSChi mediante citometria a flusso. La purezza dell'isolamento è stata calcolata al ≥93% delle cellule vitali per entrambi i tipi.

Questo metodo fornisce un approccio affidabile ed efficiente per separare LDN e NDN dal sangue periferico, garantendo un'elevata purezza e vitalità delle cellule isolate. Il miglioramento della precisione dell'isolamento dei neutrofili facilita analisi più accurate a valle di queste distinte sottopopolazioni di neutrofili. Questi sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione dell'eterogeneità dei neutrofili e delle sue implicazioni in vari contesti fisiologici e patologici.

Introduzione

I neutrofili sono cellule immunitarie granulari e i leucociti più abbondanti nel sangue periferico, costituendo in media circa il 50%-70% dei leucociti. Si sviluppano nel midollo osseo da precursori di granulociti-monociti (GMP), che a loro volta si sviluppano da cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) in presenza di fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF). All'omeostasi, hanno una durata di vita di ~ 24 ore, ma gli studi hanno dimostrato che la loro durata di vita può essere prolungata in condizioni fisiologiche specifiche e nei microambienti associati come l'attivazione immunitaria cronica¹, l'infiammazione¹ e persino la residenza dei tessuti nello stato stazionario². I neutrofili sono stati a lungo considerati la prima linea di difesa contro i patogeni e suscitano i loro effetti antimicrobici attraverso 3 principali funzioni effettrici: degranulazione, fagocitosi e attivazione e rilascio della trappola extracellulare dei neutrofili (NET) (NETosi).

La maggior parte degli studi sulla funzione e la biologia dei neutrofili esamina i risultati per la popolazione totale di neutrofili. Tuttavia, dagli studi in contesti oncologici che delineano i sottotipi N1 (antitumorale)/ N2 (pro-tumorale) alla classificazione dei neutrofili in base alla maturità, alla malattia e allo stato fisiologico, e persino alla densità cellulare (neutrofili a bassa densità e densità normale), è diventato sempre più evidente che la popolazione umana di neutrofili costituisce sottotipi fenotipicamente diversi. Indipendentemente dal fatto che l'esistenza di questi sottotipi di neutrofili possa essere attribuita all'essere tipi cellulari completamente distinti o alla natura complessa della plasticità, esiste un crescente corpo di letteratura sui neutrofili atipici e presenta un'opportunità convincente per studiare i neutrofili a bassa densità separati dai neutrofili a densità normale³.

Descritti per la prima volta nei pazienti con LES come un sottogruppo^di neutrofili pro-infiammatori 4, gli LDN sono stati da allora identificati nelle malattie croniche, in gravidanza e persino nella circolazione sana, nelle capacità pro-infiammatorie e soppressive ^5,6,7,8. Le LDN si trovano in concomitanza con le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) quando il sangue intero viene centrifugato su terreni a gradiente di densità. La loro densità specifica corrisponde a circa 1,077 g/mL, rispetto agli NDN a 1,083 g/mL⁹. Sebbene vi sia ancora un notevole dibattito sull'argomento, esiste l'ipotesi che le LDN assomiglino a un fenotipo granulocitario più immaturo (simile ai promielociti e ai mielociti, con una densità inferiore a 1,080 g/mL)^9,10. Altri ancora ipotizzano che esistano fenotipi LDN sia maturi che immaturi a seconda della presenza o assenza di malattia 11,12,13. Tuttavia, le LDN sono state rilevate anche in individui sani; Tuttavia, la loro inclusione in alcuni studi è limitata a causa della difficoltà di isolarli in numero sufficiente⁵.

Questo studio mirava a isolare queste due popolazioni in quantità che ci permettessero di eseguire esperimenti metabolici in situ a valle (minimo 0,5 × 10⁶ cellule/mL). In tal modo, un protocollo esistente⁵ è stato ottimizzato con i marcatori fenotipici comunemente riportati^13,14 che forniscono il miglior risultato per isolare e caratterizzare LDN e NDN dal sangue intero (Figura 1A).

Protocollo

I campioni di sangue sono stati raccolti con il consenso informato dei partecipanti sani. Lo studio ha ricevuto l'approvazione dal Comitato Etico di Ricerca sia del St. James's Hospital che del Tallaght University Hospital.

1. Preparazione del mezzo a gradiente di densità, delle frazioni delle soluzioni di lavoro isotoniche e del tampone di separazione cellulare

1. Preparazione di soluzioni di lavoro isotoniche da mezzo a gradiente di densità
   1. Preparazione della soluzione di lavoro Isotonic 100% (~1,123 g/mL)
      1. Per preparare la soluzione di lavoro isotonica al 100%, combinare 27 mL di terreno a gradiente di densità con 3 mL di PBS 10x. Ciò si traduce in una soluzione isotonica adatta per ulteriori diluizioni.
   2. Preparazione della soluzione di lavoro isotonica all'81% (~1,0996 g/mL)
      1. Preparare la soluzione di lavoro isotonica all'81% mescolando 8,1 mL della soluzione di lavoro isotonica al 100% (preparata al punto 1.1.1) con 1,9 mL di 1x PBS. Mescolare accuratamente per garantire l'omogeneità.
   3. Preparazione della soluzione di lavoro isotonica al 70% (~1,0861 g/mL)
      1. Per preparare la soluzione di lavoro isotonica al 70%, combinare 7 mL della soluzione di lavoro isotonica al 100% con 3 mL di 1x PBS. Assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.
   4. Preparazione della soluzione di lavoro isotonica al 55% (1,0676 g/mL)
      1. Preparare la soluzione di lavoro isotonica al 55% mescolando 5,5 mL della soluzione di lavoro isotonica al 100% con 4,5 mL di 1x PBS. Mescolare accuratamente.
2. Stratificazione delle frazioni di gradiente
   1. Stratificazione delle frazioni di gradiente
      1. Utilizzando una provetta conica da 15 mL, sovrapporre accuratamente 3 mL della soluzione di lavoro isotonica all'81% sul fondo. Quindi, sovrapporre lentamente e delicatamente 3 mL della soluzione di lavoro isotonica al 70%, evitando di mescolare gli strati. Questo gradiente verrà utilizzato per la separazione cellulare.
3. Preparazione del tampone di separazione cellulare
   1. Preparazione di 500 mL di tampone di separazione cellulare
      1. Per preparare il tampone di separazione cellulare, combinare il 2% di siero fetale bovino (FBS) e 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) con 1x PBS per un volume totale di 500 mL. Utilizzare questo tampone per lavare e risospendere le cellule durante il processo di isolamento.
         NOTA: Assicurarsi che gli strati siano ben separati e indisturbati. In questo protocollo, le soluzioni di lavoro isotoniche sono indicate come "100%", "81%", "70%" e "55%" in base al metodo di preparazione, coerente con gli studi precedenti⁵. Tuttavia, è importante chiarire che queste etichette non rappresentano le effettive concentrazioni finali delle soluzioni di lavoro. Ad esempio, il terreno di gradiente di densità "100%" viene preparato mescolando 27 mL di terreno di gradiente di densità puro con 3 mL di 10x PBS, ottenendo una concentrazione finale del 90% di soluzione di lavoro isotonica. Le diluizioni successive (ad esempio, "81%", "70%" e "55%") riflettono in modo simile i rapporti di preparazione piuttosto che le vere concentrazioni percentuali. Questa nomenclatura è stata mantenuta per mantenere la coerenza con la terminologia utilizzata nella letteratura precedente sull'argomento.

2. Isolamento di neutrofili da sangue intero mediante selezione negativa

1. Preparazione di perle magnetiche
   1. Agitare accuratamente le perline magnetiche per 30 s per assicurarsi che siano completamente risospese prima dell'uso.
2. Preparazione del sangue
   1. Per ogni donatore, aliquotare 4 mL di sangue intero in tre provette separate da 14 mL a fondo tondo.
3. Aggiunta di cocktail di isolamento dei neutrofili e microsfere magnetiche
   1. Aggiungere 50 μL di cocktail di isolamento dei neutrofili e 50 μL di microsfere magnetiche per mL di sangue a ciascuna provetta. Per 4 mL di sangue, aggiungere 200 μL di ciascun reagente.
   2. Risospendere bene la miscela pipettandola delicatamente e incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti per consentire ai reagenti di legarsi alle cellule indesiderate.
4. Lavaggio e separazione magnetica - primo giro
   1. Rabboccare ciascuna provetta a 12 mL utilizzando il tampone di separazione cellulare e mescolare accuratamente.
   2. Posizionare le provette senza coperchio su un magnete e lasciarle incubare a RT per 10 minuti per consentire alle perle magnetiche legate alle cellule indesiderate di essere attirate sulla parete della provetta.
5. Raccolta di cellule non legate
   1. Trasferire con cautela la sospensione cellulare trasparente contenente neutrofili da ciascuna provetta in una nuova provetta pulita utilizzando una pipetta di trasferimento. Rimuovere il tubo originale dal magnete.
6. Riapplicazione e incubazione di biglie magnetiche - secondo ciclo
   1. Agitare nuovamente le perline magnetiche per 30 s. Aggiungere lo stesso volume di perline magnetiche alla sospensione cellulare appena trasferita come al punto 2.3. Risospendere accuratamente e incubare a RT per altri 5 minuti.
7. Separazione e raccolta magnetica finale
   1. Riposizionare le provette sul magnete senza coperchi e incubare a RT per altri 10 minuti.
   2. Trasferire con cautela la sospensione a celle trasparenti in un nuovo tubo. Questa sospensione finale rappresenta la popolazione totale isolata di neutrofili.

3. Separazione dei neutrofili a bassa densità (LDN) e dei neutrofili a densità normale (NDN) dalla popolazione totale di neutrofili

1. Raggruppamento e preparazione di sospensioni cellulari
   1. Per ogni donatore, raggruppare le sospensioni di neutrofili isolate in provette da 50 mL. Rabboccare ogni provetta fino a un volume totale di 50 mL utilizzando il tampone di separazione cellulare.
2. Centrifugazione
   1. Centrifugare le provette a 400 x g per 5 minuti a RT con il freno inserito.
3. Risospensione e conteggio cellulare
   1. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di neutrofili in 1 mL di tampone di separazione cellulare. Eseguire una conta cellulare per determinare il numero totale di neutrofili.
4. Gradiente di densità: preparazione del mezzo
   1. Centrifugare nuovamente le provette a 400 x g per 5 minuti a RT con il freno inserito. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di neutrofili in 3 mL del terreno con gradiente di densità del 55%. Per una risoluzione ottimale, utilizzare 3 mL di terreno con gradiente di densità al 55% per 5-6 × 10⁶ neutrofili totali.
   2. Se necessario, dividere le cellule risospese in più provette a gradiente di densità prefabbricate, assicurandosi che 3 mL della sospensione cellulare siano stratificati in ciascuna provetta.
5. Stratificazione su tubi a gradiente di densità
   1. Sovrapporre lentamente la sospensione cellulare da 3 mL contenente il terreno con gradiente di densità del 55% sulle provette con gradiente di densità preconfezionate (preparate come descritto nella sezione 1). Assicurati di un'attenta stratificazione per evitare di disturbare la sfumatura.
6. Centrifugazione in gradiente di densità
   1. Centrifugare le provette a 720 x g per 30 minuti senza utilizzare il freno. Dopo la centrifugazione, maneggiare le provette con cura per evitare di disturbare gli strati.
7. Isolamento di frazioni di neutrofili
   1. Dopo la centrifugazione, osservare i neutrofili separarsi in due strati distinti:
      I neutrofili a bassa densità (LDN) saranno localizzati all'interfaccia 55%/70%, formando una banda superiore a circa 3 mL, e i neutrofili a densità normale (NDN) saranno all'interfaccia 70%/81%, apparendo come una banda inferiore intorno al segno di 6 mL.
   2. Utilizzando una pipetta di trasferimento, isolare accuratamente ogni strato e trasferirli in provette separate da 15 mL.
8. Lavaggio di frazioni isolate
   1. Per lavare via qualsiasi mezzo di gradiente di densità residuo, aggiungere 1x PBS a ciascuna provetta da 15 mL fino al segno di 15 mL.
   2. Centrifugare a 400 × g per 5 min a RT con il freno inserito. Se le celle non formano un pellet solido e rimangono invece sospese, ripetere questa fase di lavaggio, indicando la presenza del mezzo di gradiente di densità rimanente.
9. Conteggio delle cellule e applicazioni a valle
   1. Conta le cellule in ogni frazione e procedi con le applicazioni a valle come esperimenti metabolici, colorazione con citometria a flusso, estrazione dell'RNA o lisi delle proteine, se necessario.
      NOTA: Dopo aver placcato le celle, si consiglia di far girare la piastra a 210 × g per 1 minuto (freno spento).

4. Fenotipizzazione di LDN e NDN isolati

1. Isolare ~0,5-1 × 10⁶ LDN e NDN. Preparare un mastermix di anticorpi concentrato 2x utilizzando CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, blocco Fc e colorazione di vitalità.
2. Colorare le popolazioni isolate di LDN e NDN con un volume equivalente del mastermix di anticorpi in modo che la diluizione finale degli anticorpi che colorano le cellule sia rispettivamente 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, blocco Fc) e 1:50 (colorazione di vitalità).
3. Incubare le cellule per 10 minuti al buio a RT.
   NOTA: Assicurarsi che le cellule siano accuratamente miscelate con la mastermix di anticorpi e il blocco Fc.
4. Lavare le celle una volta con PBS, quindi centrifugare a 400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
5. Fissare le cellule in paraformaldeide all'1% (PFA) per 15 minuti a RT al buio.
6. Lavare nuovamente le cellule con PBS, centrifugare a 400 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
7. Risospendere le cellule in 200 μL di PBS o secondo necessità e acquisire le cellule su un citometro a flusso il prima possibile.
   NOTA: Le cellule colorate e fissate possono essere conservate a breve termine a 4 ^°C al buio per evitare il fotosbiancamento dei fluorofori. Tuttavia, idealmente, la procedura di fenotipizzazione dovrebbe essere eseguita prontamente dopo la colorazione e la fissazione per garantire una vitalità cellulare ottimale e risultati accurati.

Risultati

La stratificazione di successo dei neutrofili totali sul mezzo del gradiente di densità può essere osservata nella Figura 1B. Si dovrebbero ottenere due bande distinte. Se si verifica un mescolamento dei gradienti, o il numero totale di neutrofili stratificati per provetta è elevato (maggiore di circa 5-6 × 10⁶), le bande appariranno diffuse (Figura 1C) e il rischio che i due sottotipi di neutrofili si mescolino a...

Discussione

Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per suddividere la popolazione totale di neutrofili in neutrofili a bassa densità e a densità normale, insieme alla caratterizzazione fenotipica di ciascun tipo di cellula utilizzando la citometria a flusso adattata dai metodi precedenti⁵.

Questo protocollo si basa sull'isolamento di LDN e NDN dal sangue intero. Un passaggio cruciale è l'isolamento dei neutrofili totali attraverso metodi di sele...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube (17 x 100 mm)	Corning Science	352059
APC anti-human CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)	BioLegend	312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep Magnet	StemCell Technologies	#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)	StemCell Technologies	#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	StemCell Technologies	#19666
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)	BioLegend	302005
OneComp eBeads Compensation Beads	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 anti-human CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 anti-human CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
Phosphate-Buffered Saline Tablets	Gibco	18912-014
Zombie NIR Fixable Viability Kit	BioLegend	423105