בידוד ואפיון של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא

Summary

כאן, אנו מספקים גישה אמינה לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא באמצעות בידוד מגנטי (ברירה שלילית) ומדיום שיפוע צפיפות לא רציף. הוא מבטיח בידוד ללא נגיעה של תאים בעלי טוהר גבוה (≥93%), מה שמקל על ניתוח מדויק במורד הזרם של תת-אוכלוסיות נויטרופילים, חיוני להבנת תפקידיהם בבריאות ובמחלות.

Abstract

מחקרים חדשים מראים כי אוכלוסיית הנויטרופילים המסתובבת בבני אדם מורכבת מתת-סוגים מגוונים ואין לחקור אותה כאוכלוסייה אחת, כפי שנעשה בעבר. בפרט, הוכח כי לנויטרופילים בצפיפות נמוכה ובצפיפות נורמלית (LDNs, NDNs) יש פרופילים מובחנים מבחינה תפקודית ומטבולית, גורם שיש לקחת בחשבון בעת פרסום מחקר נויטרופילים. כאן, אנו מציגים שיטה שונה לבידוד והפרדה ללא נגיעה של LDNs ו-NDNs מדם מלא.

מדיום שיפוע הצפיפות (1.135 גרם/מ"ל) משולב ב-9:10 עם 10x PBS. שיפועי צפיפות ספציפית של 55%, 70% ו-81% נעשים לאחר מכן על ידי שילוב של מדיום שיפוע צפיפות של 100% עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). נויטרופילים שבודדו מ-12 מ"ל של דם מלא היקפי שהתקבלו מתורמים בהסכמה באמצעות ערכת בידוד מגנטי מבוססת ברירה שלילית מושעים מחדש בחלק של 55%. נפח של 3 מ"ל של שברים של 81% ו-70% מרובד לתוך צינור של 15 מ"ל, ואחריו חלק של 55% המכיל את סך הנויטרופילים. לאחר מכן שיפועי הצפיפות עוברים צנטריפוגה ב-720 x גרם למשך 30 דקות. שני פסים נפרדים מתקבלים בממשק 55%/70% (LDN) ובממשק 70%/81% (NDN). התאים מוזרמים בזהירות לצינורות נפרדים ונשטפים באמצעות PBS. טוהר השברים המבודדים נקבע באמצעות ציטומטריית זרימה. גם LDNs וגם NDNs הוגדרו כ-CD14lo CD15+ SSChi על ידי ציטומטריית זרימה. טוהר הבידוד חושב ב-≥93% מהתאים ברי הקיימא עבור שני הסוגים.

שיטה זו מספקת גישה אמינה ויעילה להפרדת LDN ו-NDNs מדם היקפי, ומבטיחה טוהר וכדאיות גבוהים של התאים המבודדים. שיפור הדיוק של בידוד נויטרופילים מאפשר ניתוחים מדויקים יותר במורד הזרם של תת-אוכלוסיות נויטרופילים מובהקות אלה. אלה קריטיים לקידום הבנתנו את ההטרוגניות של נויטרופילים והשלכותיה בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.

Introduction

נויטרופילים הם תאים חיסוניים גרגירים והלויקוציטים הנפוצים ביותר בדם היקפי, ומהווים כ-50%-70% מהלויקוציטים בממוצע. הם מתפתחים במח העצם ממבשרי גרנולוציטים-מונוציטים (GMPs), אשר בתורם מתפתחים מתאי אב המטופויאטיים (HPCs) בנוכחות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF). בהומאוסטזיס, יש להם תוחלת חיים של ~24 שעות, אך מחקרים הראו שניתן להאריך את תוחלת החיים שלהם בתנאים פיזיולוגיים ספציפיים ובמיקרו-סביבות הקשורות אליהם כגון הפעלה חיסונית כרונית¹, דלקת¹ ואפילו שהות רקמות במצב יציב². נויטרופילים נחשבים זה מכבר לקו ההגנה הראשון נגד פתוגנים ומעוררים את ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות שלהם באמצעות 3 פונקציות אפקטור עיקריות - דה-גרנולציה, פגוציטוזיס והפעלה ושחרור של מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית (NET) (NETosis).

רוב המחקרים על תפקוד הנויטרופילים והביולוגיה בוחנים את התוצאות עבור אוכלוסיית הנויטרופילים הכוללת. עם זאת, ממחקרים במסגרות סרטן התוחמים תת-סוגים של N1 (אנטי-גידול) / N2 (פרו-גידול) לסיווג הנויטרופילים על סמך בגרות, מחלה ומצב פיזיולוגי, ואפילו צפיפות תאית (נויטרופילים בצפיפות נמוכה וצפיפות נורמלית), התברר יותר ויותר שאוכלוסיית הנויטרופילים האנושית מהווה תת-סוגים מגוונים פנוטיפיים. בין אם ניתן לייחס את קיומם של תת-סוגים אלה של נויטרופילים להיותם סוגי תאים נפרדים לחלוטין או בשל האופי המורכב של הפלסטיות, קיים גוף הולך וגדל של ספרות על נויטרופילים לא טיפוסיים ומציג הזדמנות משכנעת לחקור נויטרופילים בצפיפות נמוכה הנפרדים מניטרופילים בצפיפות נורמלית³.

תוארו לראשונה בחולי זאבת כתת-קבוצה⁴ של נויטרופילים פרו-דלקתיים, LDNs זוהו מאז במחלות כרוניות, בהריון, ואפילו במחזור דם בריא, ביכולות פרו-דלקתיות כמו גם ביכולות דיכוי ^5,6,7,8. LDNs נמצאים במקביל לתאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) כאשר דם מלא עובר צנטריפוגה על פני מדיה שיפוע צפיפות. הצפיפות הסגולית שלהם תואמת לכ-1.077 גרם/מ"ל, בהשוואה ל-NDNs ב-1.083 גרם/מ"ל⁹. בעוד שעדיין יש ויכוח ניכר בנושא, קיימת השערה כי LDNs דומים לפנוטיפ גרנולוציטים לא בשל יותר (בדומה לפרומילוציטים ומיאלוציטים, עם צפיפות מתחת ל-1.080 גרם/מ"ל)^9,10. אחרים עדיין משערים כי ישנם פנוטיפים בוגרים ולא בשלים של LDN בהתאם לנוכחות או היעדר מחלה 11,12,13. עם זאת, LDNs זוהו גם אצל אנשים בריאים; עם זאת, הכללתם בחלק מהמחקרים מוגבלת בשל הקושי לבודד אותם במספרים מספיקים⁵.

מחקר זה נועד לבודד את שתי האוכלוסיות הללו בכמויות שיאפשרו לנו לבצע ניסויים מטבוליים במורד הזרם באתרם (מינימום 0.5 × 10⁶ תאים/מ"ל). בכך, פרוטוקול^{קיים 5} עבר אופטימיזציה עם סמנים פנוטיפיים מדווחים בדרך כלל^13,14 המספקים את התוצאה הטובה ביותר לבידוד ואפיון LDNs ו-NDNs מדם מלא (איור 1A).

Protocol

דגימות דם נאספו בהסכמה מדעת של משתתפים בריאים. המחקר קיבל אישור מוועדת האתיקה של המחקר הן של בית החולים סנט ג'יימס והן של בית החולים האוניברסיטאי טלאגט.

1. הכנת מדיום שיפוע צפיפות, שברים של פתרונות עבודה איזוטוניים ומאגר הפרדת תאים

1. הכנת פתרונות עבודה איזוטוניים ממדיום שיפוע צפיפות
   1. הכנת תמיסת עבודה איזוטונית 100% (~1.123 גרם/מ"ל)
      1. כדי להכין את תמיסת העבודה האיזוטונית של 100%, שלב 27 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות עם 3 מ"ל של 10x PBS. התוצאה היא תמיסה איזוטונית המתאימה לדילולים נוספים.
   2. הכנת תמיסת עבודה איזוטונית 81% (~1.0996 גרם/מ"ל)
      1. הכן את תמיסת העבודה האיזוטונית של 81% על ידי ערבוב של 8.1 מ"ל של תמיסת העבודה האיזוטונית 100% (שהוכנה בשלב 1.1.1) עם 1.9 מ"ל של 1x PBS. מערבבים היטב כדי להבטיח הומוגניות.
   3. הכנת תמיסת עבודה איזוטונית 70% (~1.0861 גרם/מ"ל)
      1. להכנת תמיסת העבודה האיזוטונית של 70%, שלב 7 מ"ל של תמיסת העבודה האיזוטונית 100% עם 3 מ"ל של 1x PBS. ודא שהתמיסה מעורבבת היטב.
   4. הכנת תמיסת עבודה איזוטונית 55% (1.0676 גרם/מ"ל)
      1. צור את תמיסת העבודה האיזוטונית של 55% על ידי ערבוב של 5.5 מ"ל של תמיסת העבודה האיזוטונית 100% עם 4.5 מ"ל של 1x PBS. מערבבים היטב.
2. שכבות של שברי מעבר צבע
   1. שכבות שבר מעבר צבע
      1. בעזרת צינור חרוטי של 15 מ"ל, שכבה בזהירות של 3 מ"ל מתמיסת העבודה האיזוטונית של 81% בתחתית. לאחר מכן, שכבה איטית ועדינה של 3 מ"ל מתמיסת העבודה האיזוטונית של 70% מעל, הימנעות מערבוב השכבות. שיפוע זה ישמש להפרדת תאים.
3. הכנת מאגר הפרדת תאים
   1. הכנת 500 מ"ל של מאגר הפרדת תאים
      1. כדי להכין את מאגר הפרדת התאים, שלב 2% סרום בקר עוברי (FBS) וחומצה אתילנדיאמינטטראצטית של 1 מ"מ (EDTA) עם 1x PBS לנפח כולל של 500 מ"ל. השתמש במאגר זה כדי לשטוף ולהשעות תאים במהלך תהליך הבידוד.
         הערה: ודא שהשכבות מופרדות היטב וללא הפרעה. בפרוטוקול זה, פתרונות העבודה האיזוטוניים מכונים "100%", "81%", "70%" ו-"55%" בהתבסס על שיטת ההכנה, בהתאם למחקרים קודמים⁵. עם זאת, חשוב להבהיר כי תוויות אלו אינן מייצגות את הריכוזים הסופיים בפועל של פתרונות העבודה. לדוגמה, מדיום שיפוע הצפיפות "100%" מוכן על ידי ערבוב של 27 מ"ל של מדיום שיפוע בצפיפות טהורה עם 3 מ"ל של 10x PBS, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 90% תמיסת עבודה איזוטונית. הדילולים הבאים (למשל, "81%", "70%" ו-"55%") משקפים באופן דומה את יחסי ההכנה ולא את ריכוזי האחוזים האמיתיים. מינוח זה נשמר כדי לשמור על עקביות עם הטרמינולוגיה ששימשה בספרות מוקדמת יותר בנושא.

2. בידוד נויטרופילים מדם מלא באמצעות ברירה שלילית

1. הכנת חרוזים מגנטיים
   1. מערבול את החרוזים המגנטיים ביסודיות במשך 30 שניות כדי להבטיח שהם מושעים במלואם לפני השימוש.
2. הכנת דם
   1. עבור כל תורם, יש להקצות 4 מ"ל של דם מלא לשלושה צינורות נפרדים עם תחתית עגולה של 14 מ"ל.
3. תוספת קוקטייל בידוד נויטרופילים וחרוזים מגנטיים
   1. הוסף 50 מיקרוליטר קוקטייל בידוד נויטרופילים ו -50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים לכל מ"ל דם לכל צינור. עבור 4 מ"ל דם, הוסף 200 מיקרוליטר מכל מגיב.
   2. השעו את התערובת היטב על ידי פיפטינג בעדינות ודגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות כדי לאפשר לריאגנטים להיקשר לתאים לא רצויים.
4. כביסה והפרדה מגנטית - סיבוב ראשון
   1. מלאו כל צינור ל-12 מ"ל באמצעות מאגר הפרדת תאים וערבבו היטב.
   2. הנח את הצינורות ללא מכסים על מגנט ותן להם לדגור ב-RT למשך 10 דקות כדי לאפשר לחרוזים המגנטיים הקשורים לתאים לא רצויים להימשך לדופן הצינור.
5. אוסף תאים לא מאוגדים
   1. העבירו בזהירות את תרחיף התאים השקוף המכיל נויטרופילים מכל צינור לתוך צינור חדש ונקי באמצעות פיפטת העברה. הסר את הצינור המקורי מהמגנט.
6. יישום חוזר ודגירה של חרוזים מגנטיים - סיבוב שני
   1. מערבולת את החרוזים המגנטיים שוב למשך 30 שניות. הוסף את אותו נפח של חרוזים מגנטיים לתרחיף התא החדש שהועבר כמו בשלב 2.3. השעו ביסודיות ודגרו ב-RT למשך 5 דקות נוספות.
7. הפרדה ואיסוף מגנטי סופי
   1. הנח את הצינורות בחזרה על המגנט ללא מכסים ודגר ב-RT למשך 10 דקות נוספות.
   2. העבירו בזהירות את מתלה התאים השקופים לצינור חדש. תרחיף סופי זה מייצג את אוכלוסיית הנויטרופילים המבודדת.

3. הפרדה של נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDNs) ונויטרופילים בצפיפות נורמלית (NDNs) מכלל אוכלוסיית הנויטרופילים

1. איגום והכנת תרחיפי תאים
   1. עבור כל תורם, אסוף את תרחיפי הנויטרופילים המבודדים לצינורות של 50 מ"ל. מלאו כל צינור לנפח כולל של 50 מ"ל באמצעות מאגר הפרדת התאים.
2. צנטריפוגה
   1. צנטריפוגה את הצינורות ב-400 x g למשך 5 דקות ב-RT כשהבלמים פועלים.
3. השעיה וספירת תאים
   1. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור הנויטרופילים ב-1 מ"ל של מאגר הפרדת תאים. בצע ספירת תאים כדי לקבוע את המספר הכולל של נויטרופילים.
4. הכנת מדיום שיפוע צפיפות
   1. צנטריפוגה את הצינורות שוב ב-400 x g למשך 5 דקות ב-RT עם הבלם. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור הנויטרופילים ב-3 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות של 55%. לרזולוציה אופטימלית, השתמש ב-3 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות של 55% לכל 5-6 ×-10⁶ נויטרופילים בסך הכל.
   2. במידת הצורך, חלקו את התאים התלויים על פני מספר צינורות שיפוע צפיפות שהוכנו מראש, וודא ש-3 מ"ל של תרחיף התא יהיו בשכבות בכל צינור.
5. שכבות על צינורות שיפוע צפיפות
   1. שכב לאט את תרחיף התאים של 3 מ"ל המכיל את מדיום שיפוע הצפיפות של 55% על צינורות שיפוע הצפיפות שהוכנו מראש (מוכנים כמתואר בסעיף 1). הקפידו על שכבות זהירות כדי למנוע הפרעה לשיפוע.
6. צנטריפוגה של שיפוע צפיפות
   1. צנטריפוגה את הצינורות ב-720 x גרם למשך 30 דקות ללא שימוש בבלם. לאחר הצנטריפוגה, יש לטפל בצינורות בזהירות כדי למנוע הפרעה לשכבות.
7. בידוד שברי נויטרופילים
   1. לאחר הצנטריפוגה, התבוננו בנויטרופילים נפרדים לשתי שכבות נפרדות:
      נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDNs) ימוקמו בממשק של 55%/70%, ויצרו פס עליון בערך בסימן של 3 מ"ל, ונויטרופילים בצפיפות נורמלית (NDNs) יהיו בממשק של 70%/81%, ויופיעו כרצועה תחתונה סביב סימן 6 מ"ל.
   2. בעזרת פיפטת העברה, בודדו בזהירות כל שכבה והעבירו אותם לצינורות נפרדים של 15 מ"ל.
8. שטיפת שברים מבודדים
   1. כדי לשטוף כל מדיום שיפוע בצפיפות שיורית, הוסף 1x PBS לכל צינור של 15 מ"ל עד לסימון 15 מ"ל.
   2. צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות ב-RT עם הבלם. אם התאים אינם יוצרים גלולה יציבה ובמקום זאת נשארים תלויים, חזור על שלב כביסה זה, המציין נוכחות של מדיום שיפוע צפיפות שנותר.
9. ספירת תאים ויישומים במורד הזרם
   1. ספרו את התאים בכל שבר והמשיכו ביישומים במורד הזרם כגון ניסויים מטבוליים, צביעת זרימה ציטומטרית, מיצוי RNA או ליזיס חלבון לפי הצורך.
      הערה: לאחר ציפוי התאים החוצה, מומלץ לסובב את הצלחת ב-210 × גרם למשך דקה אחת (כיבוי הבלם).

4. פנוטיפ של LDN ו-NDN מבודדים

1. בודד ~0.5-1 × 10⁶ LDNs ו-NDNs. צור תערובת נוגדנים מרוכזת פי 2 באמצעות CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, בלוק Fc וכתם כדאיות.
2. צבעו את אוכלוסיות ה-LDN וה-NDN המבודדות בנפח שווה ערך של תערובת הנוגדנים כך שהדילול הסופי של הנוגדנים המכתימים את התאים הוא 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, בלוק Fc) ו-1:50 (כתם כדאיות), בהתאמה.
3. דגרו על התאים למשך 10 דקות בחושך ב-RT.
   הערה: ודא שהתאים מעורבבים היטב עם תערובת הנוגדנים ובלוק ה-Fc.
4. שוטפים את התאים פעם אחת עם PBS, ואז צנטריפוגה בחום של 400 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
5. תקן את התאים ב-1% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות ב-RT בחושך.
6. שוטפים שוב את התאים עם PBS, צנטריפוגה בחום של 400 × גרם למשך 5 דקות, וזורקים את הסופרנטנט.
7. השעו מחדש את התאים ב -200 מיקרוליטר של PBS או לפי הצורך לשימוש ורכשו את התאים על ציטומטר זרימה בהקדם האפשרי.
   הערה: ניתן לאחסן את התאים המוכתמים והקבועים לטווח קצר בטמפרטורה של 4 ^◦C בחושך כדי למנוע הלבנת פוטו של הפלואורופורים. עם זאת, באופן אידיאלי, הליך הפנוטיפ צריך להתבצע מיד לאחר הצביעה והקיבוע כדי להבטיח כדאיות תאים אופטימלית ותוצאות מדויקות.

תוצאות

ניתן לראות את השכבות המוצלחות, של הנויטרופילים הכוללים על תווך שיפוע הצפיפות, באיור 1B. יש להשיג שתי רצועות נפרדות. אם מתרחש ערבוב של השיפועים, או אם מספר הנויטרופילים הכולל בשכבות לכל שפופרת גבוה (גדול מ-5-6 ×-10⁶), הרצועות ייראו מפוזרות (איור...

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית לפיצול אוכלוסיית הנויטרופילים הכוללת לנויטרופילים בצפיפות נמוכה ובצפיפות נורמלית, יחד עם אפיון פנוטיפי של כל סוג תא באמצעות ציטומטריית זרימה המותאמת משיטות קודמות⁵.

פרוטוקול זה מבוסס על בידוד של LDNs ו-NDNs מדם מלא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube (17 x 100 mm)	Corning Science	352059
APC anti-human CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)	BioLegend	312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep Magnet	StemCell Technologies	#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)	StemCell Technologies	#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	StemCell Technologies	#19666
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)	BioLegend	302005
OneComp eBeads Compensation Beads	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 anti-human CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 anti-human CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
Phosphate-Buffered Saline Tablets	Gibco	18912-014
Zombie NIR Fixable Viability Kit	BioLegend	423105