Выделение и характеристика нейтрофилов низкой и нормальной плотности из цельной крови

Резюме

В этой работе мы предлагаем надежный подход к выделению нейтрофилов низкой и нормальной плотности из цельной крови с помощью магнитной изоляции (отрицательного отбора) и прерывистой градиентной среды. Он обеспечивает нетронутую изоляцию клеток высокой чистоты (≥93%), способствуя точному последующему анализу субпопуляций нейтрофилов, что имеет решающее значение для понимания их роли в здоровье и болезнях.

Аннотация

Новые исследования показывают, что циркулирующая популяция нейтрофилов у человека состоит из различных подтипов и не должна изучаться как единая популяция, как это делалось исторически. В частности, было показано, что нейтрофилы низкой и нормальной плотности (LDN, NDNs) имеют функционально и метаболически различные профили, что необходимо учитывать при публикации исследований нейтрофилов. В этой статье мы представляем модифицированный метод нетронутого выделения и отделения LDN и NDN от цельной крови.

Градиент плотности среды (1,135 г/мл) объединяется в соотношении 9:10 с 10-кратным PBS. Удельные градиенты плотности 55%, 70% и 81% впоследствии получают путем объединения среды со 100% градиентом плотности с 1x фосфатно-солевой буфером (PBS). Нейтрофилы, выделенные из 12 мл периферической цельной крови, полученной от доноров, давших согласие с использованием набора магнитной изоляции на основе отрицательного отбора, ресуспендируются в 55% фракции. Объем 3 мл 81% и 70% фракций помещают слоями в пробирку объемом 15 мл, после чего следует 55% фракция, содержащая общее количество нейтрофилов. Затем градиенты плотности центрифугируют при 720 x g в течение 30 мин. На границе 55%/70% (LDNs) и 70%/81% (NDNs) получаются две отдельные полосы. Клетки тщательно пипетируются в отдельные пробирки и промываются с помощью PBS. Чистоту выделенных фракций определяют с помощью проточной цитометрии. Как LDN, так и NDN были определены как CD14lo CD15+ SSChi с помощью проточной цитометрии. Чистота изоляции была рассчитана на уровне ≥93% жизнеспособных клеток для обоих типов.

Этот метод обеспечивает надежный и эффективный подход к отделению LDN и NDN от периферической крови, обеспечивая высокую чистоту и жизнеспособность выделенных клеток. Повышение точности выделения нейтрофилов способствует более точному последующему анализу этих различных субпопуляций нейтрофилов. Это имеет решающее значение для углубления нашего понимания гетерогенности нейтрофилов и ее последствий в различных физиологических и патологических контекстах.

Введение

Нейтрофилы являются гранулированными иммунными клетками и наиболее распространенными лейкоцитами в периферической крови, составляя в среднем около 50-70% лейкоцитов. Они развиваются в костном мозге из гранулоцитарно-моноцитарных предшественников (ГМП), которые, в свою очередь, развиваются из гемопоэтических клеток-предшественников (ГПК) в присутствии гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF). При гомеостазе продолжительность жизни составляет ~24 часа, но исследования показали, что продолжительность их жизни может быть увеличена при определенных физиологических условиях и связанных с ними микроокружениях, таких как хроническая иммунная активация¹, воспаление¹ и даже проживание в тканях в устойчивом состоянии². Нейтрофилы долгое время считались первой линией защиты от патогенов и вызывали их антимикробное действие через 3 основные эффекторные функции - дегрануляцию, фагоцитоз и активацию и высвобождение внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET) (NETosis).

В большинстве исследований функции и биологии нейтрофилов изучаются результаты для общей популяции нейтрофилов. Тем не менее, из исследований в раковых условиях, определяющих подтипы N1 (противоопухолевые) / N2 (проопухолевые) и классификацию нейтрофилов на основе зрелости, болезни и физиологического состояния, и даже клеточной плотности (нейтрофилы низкой и нормальной плотности), становится все более очевидным, что популяция нейтрофилов человека представляет собой фенотипически разнообразные подтипы. Независимо от того, можно ли объяснить существование этих подтипов нейтрофилов совершенно разными типами клеток или сложной природой пластичности, существует растущий объем литературы об атипичных нейтрофилах, которая предоставляет прекрасную возможность изучать нейтрофилы низкой плотности отдельно от нейтрофилов нормальной плотности^.

Впервые описанные у пациентов с СКВ как подгруппа провоспалительных нейтрофилов⁴, LDN с тех пор были идентифицированы при хронических заболеваниях, беременности и даже в здоровом кровообращении, как в провоспалительной, так и в супрессивной способности 5,6,7,8. LDN обнаруживаются одновременно с мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC), когда цельная кровь центрифугируется на среде с градиентом плотности. Их удельная плотность соответствует примерно 1,077 г/мл, по сравнению с NDN на уровне 1,083 г/^мл9. Несмотря на то, что до сих пор ведутся значительные споры по этому вопросу, существует предположение, что LDN напоминают более незрелый фенотип гранулоцитов (похожий на промиелоциты и миелоциты, с плотностью ниже 1,080 г/мл)^9,10. Другие до сих пор предполагают, что существуют как зрелые, так и незрелые фенотипы LDN в зависимости от наличия или отсутствия заболевания 11,12,13. Тем не менее, LDN также были обнаружены у здоровых людей; Тем не менее, их включение в некоторые исследования ограничено из-за сложности их выделения в достаточном^{количестве5}.

Это исследование было направлено на изоляцию этих двух популяций в количествах, которые позволили бы нам проводить последующие метаболические эксперименты in situ (минимум 0,5 × 10-6 клеток/мл). При этом существующий протокол⁵ был оптимизирован с использованием широко известных фенотипических маркеров^13,14, которые обеспечивают наилучший результат для выделения и характеристики LDN и NDNs из цельной крови (рисунок 1A).

протокол

Образцы крови были собраны с информированного согласия здоровых участников. Исследование получило одобрение Комитета по этике исследований больницы Святого Джеймса и Университетской больницы Талла.

1. Приготовление градиентной среды плотности, фракций изотонических рабочих растворов и буфера для разделения ячеек

1. Приготовление изотонических рабочих растворов из градиентной среды
   1. Приготовление изотонического 100% рабочего раствора (~1,123 г/мл)
      1. Для приготовления изотонического 100% рабочего раствора соедините 27 мл градиентной среды плотности с 3 мл 10x PBS. В результате получается изотонический раствор, пригодный для дальнейших разведений.
   2. Приготовление изотонического 81% рабочего раствора (~1,0996 г/мл)
      1. Приготовьте изотонический 81% рабочий раствор, смешав 8,1 мл изотонического 100% рабочего раствора (приготовленного на шаге 1.1.1) с 1,9 мл 1x PBS. Тщательно перемешайте для обеспечения однородности.
   3. Приготовление изотонического 70% рабочего раствора (~1,0861 г/мл)
      1. Для приготовления изотонического 70% рабочего раствора соедините 7 мл изотонического 100% рабочего раствора с 3 мл 1x PBS. Следите за тем, чтобы раствор хорошо перемешался.
   4. Приготовление изотонического 55% рабочего раствора (1,0676 г/мл)
      1. Приготовьте изотонический 55% рабочий раствор, смешав 5,5 мл изотонического 100% рабочего раствора с 4,5 мл 1x PBS. Тщательно перемешиваем.
2. Наслоение градиентных дробей
   1. Наслоение градиентных фракций
      1. С помощью конической пробирки объемом 15 мл аккуратно нанесите на дно 3 мл изотонического 81% рабочего раствора. Затем медленно и аккуратно нанесите сверху 3 мл изотонического 70% рабочего раствора, избегая смешивания слоев. Этот градиент будет использоваться для разделения ячеек.
3. Приготовление буфера для разделения ячеек
   1. Приготовление 500 мл буфера для разделения клеток
      1. Чтобы приготовить буфер для разделения клеток, смешайте 2% фетальную бычью сыворотку (FBS) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) с 1x PBS до общего объема 500 мл. Используйте этот буфер для промывания и ресуспендирования клеток во время процесса изоляции.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что слои хорошо разделены и не нарушены. В этом протоколе изотонические рабочие растворы обозначаются как «100%», «81%», «70%» и «55%» в зависимости от способа получения, согласующегося с предыдущими исследованиями⁵. Однако важно уточнить, что эти метки не отражают фактические конечные концентрации рабочих растворов. Например, среду с градиентом плотности «100%» получают путем смешивания 27 мл чистой среды с градиентом плотности с 3 мл 10x PBS, в результате чего получается конечная концентрация 90% изотонического рабочего раствора. Последующие разведения (например, «81%», «70%» и «55%») аналогичным образом отражают соотношения препаратов, а не истинные процентные концентрации. Эта номенклатура была сохранена для поддержания согласованности с терминологией, используемой в более ранней литературе по этому вопросу.

2. Выделение нейтрофилов из цельной крови с помощью отрицательного отбора

1. Приготовление магнитных шариков
   1. Перед использованием тщательно окуните магнитные шарики в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что они полностью ресуспендированы.
2. Заготовка крови
   1. На каждого донора насыпьте 4 мл цельной крови в три отдельные пробирки по 14 мл с круглым дном.
3. Добавление коктейля из изолирующих нейтрофилов и магнитных шариков
   1. Добавьте в каждую пробирку 50 μл коктейля для выделения нейтрофилов и 50 μл магнитных шариков на мл крови. На 4 мл крови добавьте по 200 мкл каждого реагента.
   2. Хорошо восстановите суспендию смеси с помощью осторожного пипетирования и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут, чтобы реагенты могли связываться с нежелательными клетками.
4. Промывка и магнитная сепарация - первый раунд
   1. Долейте каждую пробирку до 12 мл с помощью буфера для разделения клеток и тщательно перемешайте.
   2. Поместите пробирки без крышек на магнит и дайте им инкубироваться при RT в течение 10 минут, чтобы магнитные шарики, связанные с нежелательными клетками, притянулись к стенке трубки.
5. Коллекция непривязанных ячеек
   1. Осторожно перенесите суспензию прозрачных клеток, содержащую нейтрофилы, из каждой пробирки в новую чистую пробирку с помощью переводной пипетки. Снимите оригинальную трубку с магнита.
6. Повторное нанесение магнитных шариков и инкубация - второй раунд
   1. Снова закрутите магнитные шарики в течение 30 секунд. Добавьте во вновь перенесенную клеточную суспензию тот же объем магнитных шариков, что и в шаге 2.3. Тщательно восстановите суспензию и инкубируйте при RT еще 5 минут.
7. Окончательная магнитная сепарация и сбор
   1. Поместите пробирки обратно на магнит без крышек и инкубируйте при RT еще 10 минут.
   2. Осторожно переложите суспензию с прозрачными ячейками в новую пробирку. Эта окончательная суспензия представляет собой изолированную общую популяцию нейтрофилов.

3. Выделение нейтрофилов низкой плотности (НДН) и нейтрофилов нормальной плотности (НДН) из общей популяции нейтрофилов

1. Объединение и приготовление клеточных суспензий
   1. Для каждого донора объедините выделенные суспензии нейтрофилов в пробирки объемом 50 мл. Долейте каждую пробирку до общего объема 50 мл с помощью буфера для разделения клеток.
2. Центрифугирование
   1. Центрифугируйте пробирки при давлении 400 x g в течение 5 минут при RT при включенном тормозе.
3. Ресуспензия и подсчет клеток
   1. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу нейтрофила в 1 мл буфера для разделения клеток. Выполните подсчет клеток, чтобы определить общее количество нейтрофилов.
4. Подготовка среды с градиентом плотности
   1. Снова центрифугируйте пробирки при давлении 400 x g в течение 5 минут при RT с включенным тормозом. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу нейтрофила в 3 мл среды с градиентом плотности 55%. Для оптимального разрешения используйте 3 мл среды с градиентом плотности 55% на 5-6 × 10⁶ общих нейтрофилов.
   2. При необходимости разделите ресуспензированные клетки на несколько заранее изготовленных пробирок с градиентом плотности, следя за тем, чтобы 3 мл клеточной суспензии были помещены слоями в каждую пробирку.
5. Нанесение слоев на пробирки с градиентом плотности
   1. Медленно нанесите клеточную суспензию объемом 3 мл, содержащую среду с градиентом плотности 55%, на предварительно изготовленные пробирки с градиентом плотности (приготовленные, как описано в разделе 1). Обеспечьте тщательное наслоение, чтобы не нарушить градиент.
6. Центрифугирование с градиентом плотности
   1. Центрифугируйте пробирки при давлении 720 x g в течение 30 мин без использования тормоза. После центрифугирования обращайтесь с пробирками осторожно, чтобы не нарушить слои.
7. Выделение нейтрофильных фракций
   1. После центрифугирования наблюдайте, как нейтрофилы разделяются на два отдельных слоя:
      Нейтрофилы низкой плотности (LDN) будут расположены на границе 55%/70%, образуя верхнюю полосу примерно на отметке 3 мл, а нейтрофилы нормальной плотности (NDN) будут находиться на границе 70%/81%, проявляясь как нижняя полоса вокруг отметки 6 мл.
   2. С помощью переводной пипетки тщательно изолируйте каждый слой и перенесите их в отдельные пробирки объемом 15 мл.
8. Промывка выделенных фракций
   1. Чтобы смыть любую среду с остаточным градиентом плотности, добавьте 1x PBS в каждую пробирку объемом 15 мл до отметки 15 мл.
   2. Центрифугировать при 400 × г в течение 5 мин при RT при включенном тормозе. Если ячейки не образуют твердую гранулу и вместо этого остаются во взвешенном состоянии, повторите этот этап промывки, указывая на наличие оставшейся среды градиента плотности.
9. Количество ячеек и последующие приложения
   1. Подсчитайте количество клеток в каждой фракции и при необходимости приступайте к последующим операциям, таким как метаболические эксперименты, окрашивание методом проточной цитометрии, экстракция РНК или лизис белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После выгрузки ячеек рекомендуется откручивать пластину при давлении 210 × g в течение 1 минуты (тормозить).

4. Фенотипирование изолированных LDN и NDN

1. Изолируйте ~0,5-1 × 10⁶ LDN и NDNs. Сделайте мастермикс 2x концентрированных антител, используя CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc-блок и окрашивание жизнеспособности.
2. Окрашивают выделенные популяции LDN и NDN эквивалентным объемом мастермикса антител таким образом, чтобы окончательное разведение антител, окрашивающих клетки, составляло 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc-блок) и 1:50 (окрашивание жизнеспособности) соответственно.
3. Инкубируйте клетки в течение 10 минут в темноте при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки тщательно перемешаны с мастермиксом антител и блоком Fc.
4. Промойте клетки один раз PBS, затем центрифугируйте при 400 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
5. Зафиксируйте клетки в 1% параформальдегиде (PFA) на 15 минут в RT в темноте.
6. Снова промойте клетки PBS, центрифугируйте при 400 × г в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
7. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл PBS или по мере необходимости использования и как можно скорее зарегистрируйте клетки на проточном цитометре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные и неподвижные клетки можно хранить кратковременно при температуре 4 ^°C в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание флуорофоров. Однако в идеале процедура фенотипирования должна проводиться сразу после окрашивания и фиксации, чтобы обеспечить оптимальную жизнеспособность клеток и точные результаты.

Результаты

Успешное наслоение общих нейтрофилов на среду с градиентом плотности можно наблюдать на рисунке 1В. Должны быть получены две отдельные полосы. Если происходит смешение градиентов или количество общих нейтрофилов, наслоенных на трубку, велико (более п?...

Обсуждение

В данной работе мы представляем оптимизированный метод расщепления общей популяции нейтрофилов на нейтрофилы низкой и нормальной плотности, а также фенотипическую характеристику каждого типа клеток с помощью проточной цитометрии, адаптированной из предыдущих

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube (17 x 100 mm)	Corning Science	352059
APC anti-human CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)	BioLegend	312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep Magnet	StemCell Technologies	#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)	StemCell Technologies	#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	StemCell Technologies	#19666
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)	BioLegend	302005
OneComp eBeads Compensation Beads	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 anti-human CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 anti-human CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
Phosphate-Buffered Saline Tablets	Gibco	18912-014
Zombie NIR Fixable Viability Kit	BioLegend	423105