O Isolamento e Caracterização de Neutrófilos de Baixa e Densidade Normal do Sangue Total

Resumo

Aqui, fornecemos uma abordagem confiável para isolar neutrófilos de baixa e normal densidade de sangue total usando isolamento magnético (seleção negativa) e meio de gradiente de densidade descontínuo. Ele garante o isolamento intocado de células de alta pureza (≥93%), facilitando a análise precisa a jusante das subpopulações de neutrófilos, cruciais para entender seus papéis na saúde e na doença.

Resumo

Pesquisas emergentes mostram que a população circulante de neutrófilos em humanos consiste em diversos subtipos e não deve ser estudada como uma única população, como tem sido feito historicamente. Em particular, neutrófilos de baixa densidade e densidade normal (LDNs, NDNs) demonstraram ter perfis funcional e metabolicamente distintos, um fator que deve ser considerado ao publicar pesquisas com neutrófilos. Aqui, apresentamos um método modificado para o isolamento e separação intocados de LDNs e NDNs do sangue total.

O meio gradiente de densidade (1,135 g/mL) é combinado a 9:10 com 10x PBS. Gradientes de densidade específicos de 55%, 70% e 81% são feitos subsequentemente combinando o meio de gradiente de densidade de 100% com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Neutrófilos isolados de 12 mL de sangue total periférico obtido de doadores consentidos usando um kit de isolamento magnético baseado em seleção negativa são ressuspensos na fração de 55%. Um volume de 3 mL das frações de 81% e 70% é colocado em camadas em um tubo de 15 mL, seguido pela fração de 55% contendo neutrófilos totais. Os gradientes de densidade são então centrifugados a 720 x g por 30 min. Duas bandas distintas são obtidas na interface 55%/70% (LDNs) e 70%/81% (NDNs). As células são cuidadosamente pipetadas em tubos separados e lavadas com PBS. A pureza das fracções isoladas é determinada por citometria de fluxo. Tanto os LDNs quanto os NDNs foram definidos como CD14lo, CD15+ SSChi por citometria de fluxo. A pureza do isolamento foi calculada em ≥93% das células viáveis para ambos os tipos.

Este método fornece uma abordagem confiável e eficiente para separar LDN e NDNs do sangue periférico, garantindo alta pureza e viabilidade das células isoladas. Aumentar a precisão do isolamento de neutrófilos facilita análises mais precisas a jusante dessas subpopulações distintas de neutrófilos. Estes são críticos para avançar nossa compreensão da heterogeneidade dos neutrófilos e suas implicações em vários contextos fisiológicos e patológicos.

Introdução

Os neutrófilos são células imunes granulares e o leucócito mais abundante no sangue periférico, constituindo cerca de 50% a 70% dos leucócitos em média. Eles se desenvolvem na medula óssea a partir de precursores de granulócitos-monócitos (GMPs), que por sua vez se desenvolvem a partir de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) na presença de fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF). Na homeostase, eles têm uma vida útil de ~ 24 h, mas estudos mostraram que sua vida útil pode ser estendida sob condições fisiológicas específicas e seus microambientes associados, como ativação imunológica crônica¹, inflamação¹ e até residência tecidual em estado estacionário². Os neutrófilos há muito são considerados a primeira linha de defesa contra patógenos e provocam seus efeitos antimicrobianos por meio de 3 funções efetoras principais - degranulação, fagocitose e ativação e liberação de armadilha extracelular de neutrófilos (NET) (NETosis).

A maioria dos estudos sobre função e biologia de neutrófilos examina os resultados para a população total de neutrófilos. No entanto, desde estudos em ambientes de câncer delineando subtipos N1 (antitumoral) / N2 (pró-tumoral) até a classificação de neutrófilos com base na maturidade, doença e estado fisiológico, e até mesmo densidade celular (neutrófilos de baixa densidade e densidade normal), tornou-se cada vez mais aparente que a população de neutrófilos humanos constitui subtipos fenotipicamente diversos. Se a existência desses subtipos de neutrófilos pode ser atribuída a tipos de células completamente distintos ou devido à natureza complexa da plasticidade, existe um crescente corpo de literatura sobre neutrófilos atípicos e apresenta uma oportunidade convincente para estudar neutrófilos de baixa densidade separados de neutrófilos de densidade normal³.

Descritos pela primeira vez em pacientes com LES como um subgrupo pró-inflamatório^de neutrófilos 4, os LDNs foram identificados em doenças crônicas, gravidez e até mesmo na circulação saudável, em capacidades pró-inflamatórias e supressoras ^5,6,7,8. Os LDNs são encontrados concomitantemente com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) quando o sangue total é centrifugado em meios de gradiente de densidade. Sua densidade específica corresponde a aproximadamente 1,077 g/mL, em comparação com NDNs a 1,083 g/mL⁹. Embora ainda haja um debate considerável sobre o assunto, especula-se que os LDNs se assemelhem a um fenótipo de granulócitos mais imaturo (semelhante aos promielócitos e mielócitos, com densidade abaixo de 1,080 g/mL)^9,10. Outros ainda especulam que existem fenótipos de LDN maduros e imaturos, dependendo da presença ou ausência de doença 11,12,13. No entanto, LDNs também foram detectados em indivíduos saudáveis; no entanto, sua inclusão em alguns estudos é limitada devido à dificuldade em isolá-los em número suficiente⁵.

Este estudo teve como objetivo isolar essas duas populações em quantidades que nos permitissem realizar experimentos metabólicos in situ a jusante (mínimo 0,5 × 10⁶ células/mL). Ao fazer isso, um protocolo existente⁵ foi otimizado com marcadores fenotípicos comumente relatados^13,14 que fornecem o melhor resultado para isolar e caracterizar LDNs e NDNs de sangue total (Figura 1A).

Protocolo

Amostras de sangue foram coletadas com consentimento informado de participantes saudáveis. O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do St. James's Hospital e do Tallaght University Hospital.

1. Preparação do meio de gradiente de densidade, frações de soluções de trabalho isotônicas e tampão de separação celular

1. Preparação de soluções de trabalho isotônicas a partir de meio de gradiente de densidade
   1. Preparação da solução isotônica 100% de trabalho (~ 1,123 g / mL)
      1. Para preparar a solução isotônica 100% de trabalho, combine 27 mL de meio gradiente de densidade com 3 mL de PBS 10x. Isso resulta em uma solução isotônica adequada para diluições adicionais.
   2. Preparação da solução de trabalho isotônica a 81% (~ 1,0996 g / mL)
      1. Prepare a solução de trabalho isotônica a 81% misturando 8,1 mL da solução isotônica de trabalho a 100% (preparada na etapa 1.1.1) com 1,9 mL de 1x PBS. Misture bem para garantir a homogeneidade.
   3. Preparação de solução de trabalho isotônica a 70% (~ 1,0861 g / mL)
      1. Para preparar a solução isotônica de trabalho a 70%, combine 7 mL da solução isotônica de trabalho a 100% com 3 mL de 1x PBS. Certifique-se de que a solução esteja bem misturada.
   4. Preparação da solução de trabalho isotônica a 55% (1,0676 g/mL)
      1. Faça a solução de trabalho isotônica a 55% misturando 5,5 mL da solução isotônica de trabalho a 100% com 4,5 mL de 1x PBS. Homogeneizar.
2. Camadas de frações de gradiente
   1. Camadas de fração de gradiente
      1. Usando um tubo cônico de 15 mL, coloque cuidadosamente 3 mL da solução de trabalho isotônica a 81% na parte inferior. Em seguida, coloque lenta e suavemente 3 mL da solução isotônica de trabalho a 70% por cima, evitando misturar as camadas. Este gradiente será usado para separação celular.
3. Preparação do tampão de separação celular
   1. Preparação de 500 mL de tampão de separação celular
      1. Para preparar o tampão de separação celular, combine 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) com 1x PBS para um volume total de 500 mL. Use este tampão para lavar e ressuspender as células durante o processo de isolamento.
         NOTA: Certifique-se de que as camadas estejam bem separadas e sem perturbações. Neste protocolo, as soluções de trabalho isotônicas são referidas como "100%", "81%", "70%" e "55%" com base no método de preparação, consistente com estudos anteriores⁵. No entanto, é importante esclarecer que esses rótulos não representam as concentrações finais reais das soluções de trabalho. Por exemplo, o meio de gradiente de densidade "100%" é preparado misturando 27 mL de meio gradiente de densidade puro com 3 mL de 10x PBS, resultando em uma concentração final de 90% de solução de trabalho isotônica. As diluições subsequentes (por exemplo, "81%", "70%" e "55%") refletem de forma semelhante as proporções de preparação, em vez de concentrações percentuais verdadeiras. Essa nomenclatura foi mantida para manter a consistência com a terminologia usada na literatura anterior sobre o assunto.

2. Isolamento de neutrófilos do sangue total usando seleção negativa

1. Preparação de esferas magnéticas
   1. Vortex os grânulos magnéticos completamente por 30 s para garantir que eles sejam totalmente ressuspensos antes do uso.
2. Preparação de sangue
   1. Para cada doador, alíquota de 4 mL de sangue total em três tubos separados de 14 mL de fundo redondo.
3. Adição de coquetel de isolamento de neutrófilos e contas magnéticas
   1. Adicione 50 μL de coquetel de isolamento de neutrófilos e 50 μL de esferas magnéticas por mL de sangue a cada tubo. Para 4 mL de sangue, adicione 200 μL de cada reagente.
   2. Ressuspenda bem a mistura pipetando suavemente e incube à temperatura ambiente (RT) por 5 min para permitir que os reagentes se liguem às células indesejadas.
4. Lavagem e separação magnética - primeira rodada
   1. Complete cada tubo com 12 mL usando tampão de separação de células e misture bem.
   2. Coloque os tubos sem tampas em um ímã e deixe-os incubar em RT por 10 min para permitir que as esferas magnéticas ligadas às células indesejadas sejam atraídas para a parede do tubo.
5. Coleção de células não ligadas
   1. Transfira cuidadosamente a suspensão de células claras contendo neutrófilos de cada tubo para um tubo novo e limpo usando uma pipeta de transferência. Remova o tubo original do ímã.
6. Reaplicação e incubação de esferas magnéticas - segunda rodada
   1. Vortex as contas magnéticas novamente por 30 s. Adicione o mesmo volume de esferas magnéticas à suspensão de células recém-transferidas como na etapa 2.3. Ressuspenda completamente e incube em RT por mais 5 min.
7. Separação e coleta magnética final
   1. Coloque os tubos de volta no ímã sem tampas e incube em RT por mais 10 min.
   2. Transfira cuidadosamente a suspensão de célula transparente para um novo tubo. Esta suspensão final representa a população total de neutrófilos isolada.

3. Separação de neutrófilos de baixa densidade (LDNs) e neutrófilos de densidade normal (NDNs) da população total de neutrófilos

1. Agrupamento e preparação de suspensões celulares
   1. Para cada doador, agrupe as suspensões isoladas de neutrófilos em tubos de 50 mL. Complete cada tubo até um volume total de 50 mL usando o tampão de separação de células.
2. Centrifugação
   1. Centrifugue os tubos a 400 x g por 5 min em RT com o freio acionado.
3. Ressuspensão e contagem de células
   1. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de neutrófilos em 1 mL de tampão de separação celular. Faça uma contagem de células para determinar o número total de neutrófilos.
4. Preparação do meio gradiente de densidade
   1. Centrifugue os tubos novamente a 400 x g por 5 min em RT com o freio acionado. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de neutrófilos em 3 ml do meio de gradiente de densidade de 55%. Para uma resolução ideal, use 3 mL de gradiente de densidade de 55% por 5-6 × 10⁶ neutrófilos totais.
   2. Se necessário, divida as células ressuspensas em vários tubos de gradiente de densidade pré-fabricados, garantindo que 3 mL da suspensão celular sejam colocados em camadas em cada tubo.
5. Camadas em tubos de gradiente de densidade
   1. Coloque lentamente a suspensão celular de 3 mL contendo o meio de gradiente de densidade de 55% nos tubos de gradiente de densidade pré-fabricados (preparados conforme descrito na seção 1). Garanta camadas cuidadosas para evitar perturbar o gradiente.
6. Centrifugação com gradiente de densidade
   1. Centrifugue os tubos a 720 x g por 30 min sem usar o freio. Após a centrifugação, manuseie os tubos com cuidado para evitar perturbar as camadas.
7. Isolamento das fracções neutrófilas
   1. Após a centrifugação, observe os neutrófilos separados em duas camadas distintas:
      Os neutrófilos de baixa densidade (LDNs) estarão localizados na interface 55%/70%, formando uma banda superior em aproximadamente a marca de 3 mL, e os neutrófilos de densidade normal (NDNs) estarão na interface 70%/81%, aparecendo como uma banda inferior em torno da marca de 6 mL.
   2. Usando uma pipeta de transferência, isole cuidadosamente cada camada e transfira-as para tubos separados de 15 mL.
8. Lavagem de fracções isoladas
   1. Para lavar qualquer meio de gradiente de densidade residual, adicione 1x PBS a cada tubo de 15 mL até a marca de 15 mL.
   2. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a RT com o travão ligado. Se as células não formarem um sedimento firme e permanecerem suspensas, repita esta etapa de lavagem, indicando a presença de meio de gradiente de densidade restante.
9. Contagem de células e aplicações downstream
   1. Conte as células em cada fração e prossiga com aplicações a jusante, como experimentos metabólicos, coloração por citometria de fluxo, extração de RNA ou lise de proteínas, conforme necessário.
      NOTA: Depois de revestir as células, recomenda-se girar a placa a 210 × g por 1 min (freio desligado).

4. Fenotipagem de LDN e NDN isolados

1. Isole ~ 0,5-1 × 10⁶ LDNs e NDNs. Faça um mastermix de anticorpos concentrado 2x usando CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, bloqueio Fc e corante de viabilidade.
2. Corar as populações isoladas de LDN e NDN com um volume equivalente do mastermix de anticorpos de modo que a diluição final dos anticorpos que colorem as células seja de 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, bloco Fc) e 1:50 (coloração de viabilidade), respectivamente.
3. Incube as células por 10 min no escuro em RT.
   NOTA: Certifique-se de que as células estejam completamente misturadas com o mastermix de anticorpos e o bloco Fc.
4. Lave as células uma vez com PBS e centrifugue a 400 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
5. Fixe as células em paraformaldeído a 1% (PFA) por 15 min em RT no escuro.
6. Lave novamente as células com PBS, centrifugue a 400 × g por 5 min e descarte o sobrenadante.
7. Ressuspenda as células em 200 μL de PBS ou conforme necessário e adquira as células em um citômetro de fluxo o mais rápido possível.
   NOTA: As células coradas e fixas podem ser armazenadas a curto prazo a 4 ^◦C no escuro para evitar o fotobranqueamento dos fluoróforos. No entanto, idealmente, o procedimento de fenotipagem deve ser realizado imediatamente após a coloração e fixação para garantir a viabilidade celular ideal e resultados precisos.

Resultados

A estratificação bem-sucedida de neutrófilos totais sobre o meio gradiente de densidade pode ser observada na Figura 1B. Duas bandas distintas devem ser obtidas. Se ocorrer mistura dos gradientes, ou o número de neutrófilos totais em camadas por tubo for alto (maior que aproximadamente 5-6 × 10⁶), as bandas parecerão difusas (Figura 1C) e o risco de mistura dos dois subtipos de neutrófilos aumenta significativ...

Discussão

Aqui, apresentamos um método otimizado de divisão da população total de neutrófilos em neutrófilos de baixa densidade e densidade normal, juntamente com a caracterização fenotípica de cada tipo de célula usando citometria de fluxo adaptada de métodos anteriores⁵.

Este protocolo é baseado no isolamento de LDNs e NDNs do sangue total. Um passo crucial é que os neutrófilos totais são isolados por meio de métodos de seleçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube (17 x 100 mm)	Corning Science	352059
APC anti-human CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)	BioLegend	312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep Magnet	StemCell Technologies	#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)	StemCell Technologies	#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	StemCell Technologies	#19666
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)	BioLegend	302005
OneComp eBeads Compensation Beads	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 anti-human CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 anti-human CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
Phosphate-Buffered Saline Tablets	Gibco	18912-014
Zombie NIR Fixable Viability Kit	BioLegend	423105