L’isolement et la caractérisation des neutrophiles de basse et de densité normale dans le sang total

Résumé

Ici, nous proposons une approche fiable pour isoler les neutrophiles de densité faible et normale du sang total en utilisant l’isolement magnétique (sélection négative) et le milieu à gradient de densité discontinu. Il garantit l’isolement intact des cellules de haute pureté (≥93 %), facilitant ainsi l’analyse précise en aval des sous-populations de neutrophiles, ce qui est crucial pour comprendre leurs rôles dans la santé et la maladie.

Résumé

De nouvelles recherches montrent que la population de neutrophiles en circulation chez l’homme se compose de divers sous-types et ne devrait pas être étudiée comme une seule population, comme cela a été fait par le passé. En particulier, il a été démontré que les neutrophiles de faible densité et de densité normale (LDN, NDN) ont des profils fonctionnellement et métaboliquement distincts, un facteur qui doit être pris en compte lors de la publication de recherches sur les neutrophiles. Ici, nous présentons une méthode modifiée pour l’isolement et la séparation intacts des LDN et des NDN du sang total.

Le milieu de gradient de densité (1,135 g/mL) est combiné à 9:10 avec 10x PBS. Des gradients de densité spécifiques de 55 %, 70 % et 81 % sont ensuite obtenus en combinant le milieu à gradient de densité de 100 % avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x. Les neutrophiles isolés à partir de 12 mL de sang total périphérique obtenu de donneurs consentants à l’aide d’un kit d’isolement magnétique basé sur la sélection négative sont remis en suspension dans la fraction à 55 %. Un volume de 3 mL des fractions à 81 % et à 70 % est superposé dans un tube de 15 mL, suivi de la fraction à 55 % contenant des neutrophiles totaux. Les gradients de densité sont ensuite centrifugés à 720 x g pendant 30 min. Deux bandes distinctes sont obtenues au niveau de l’interface 55 %/70 % (LDN) et de l’interface 70 %/81 % (NDN). Les cellules sont soigneusement pipetées dans des tubes séparés et lavées à l’aide de PBS. La pureté des fractions isolées est déterminée par cytométrie en flux. Les LDN et les NDN ont été définis comme CD14lo CD15+ SSChi par cytométrie en flux. La pureté d’isolement a été calculée à ≥93 % des cellules viables pour les deux types.

Cette méthode fournit une approche fiable et efficace pour séparer les LDN et les NDN du sang périphérique, garantissant ainsi une pureté et une viabilité élevées des cellules isolées. L’amélioration de la précision de l’isolement des neutrophiles facilite des analyses en aval plus précises de ces sous-populations distinctes de neutrophiles. Ceux-ci sont essentiels pour faire progresser notre compréhension de l’hétérogénéité des neutrophiles et de ses implications dans divers contextes physiologiques et pathologiques.

Introduction

Les neutrophiles sont des cellules immunitaires granulaires et les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique, constituant environ 50 à 70 % des leucocytes en moyenne. Ils se développent dans la moelle osseuse à partir de précurseurs de granulocytes-monocytes (GMP), qui à leur tour se développent à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) en présence de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF). À l’homéostasie, ils ont une durée de vie de ~24 h, mais des études ont montré que leur durée de vie peut être prolongée dans des conditions physiologiques spécifiques et leurs microenvironnements associés tels que l’activation immunitaire chronique¹, l’inflammation¹ et même la résidence tissulaire à l’état d’équilibre². Les neutrophiles ont longtemps été considérés comme la première ligne de défense contre les agents pathogènes et déclenchent leurs effets antimicrobiens par le biais de 3 fonctions effectrices majeures : la dégranulation, la phagocytose et l’activation et la libération du piège extracellulaire des neutrophiles (NET) (NETosis).

La plupart des études sur la fonction et la biologie des neutrophiles examinent les résultats pour l’ensemble de la population de neutrophiles. Cependant, à partir d’études dans des contextes cancéreux délimitant les sous-types N1 (anti-tumoral)/N2 (pro-tumoral) à la classification des neutrophiles basée sur la maturité, la maladie et l’état physiologique, et même la densité cellulaire (neutrophiles de faible densité et de densité normale), il est devenu de plus en plus évident que la population de neutrophiles humains constitue des sous-types phénotypiquement diversifiés. Que l’existence de ces sous-types de neutrophiles puisse être attribuée à des types cellulaires complètement distincts ou à la nature complexe de la plasticité, il existe un corpus croissant de littérature sur les neutrophiles atypiques et présente une opportunité convaincante d’étudier les neutrophiles de faible densité séparément des neutrophiles de densité normale³.

Décrits pour la première fois chez les patients atteints de LED comme un sous-ensemble⁴ des neutrophiles pro-inflammatoires, les LDN ont depuis été identifiés dans les maladies chroniques, la grossesse et même dans une circulation saine, dans des capacités pro-inflammatoires et suppressives 5,6,7,8. Les LDN se trouvent en même temps que les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) lorsque le sang total est centrifugé sur des milieux à gradient de densité. Leur densité spécifique correspond à environ 1,077 g/mL, contre 1,083 g/mL^{9 pour les} NDN. Bien qu’il y ait encore beaucoup de débats sur le sujet, il existe des spéculations selon lesquelles les NDT ressemblent à un phénotype de granulocytes plus immatures (similaire aux promyélocytes et aux myélocytes, avec une densité inférieure à 1,080 g/mL)^9,10. D’autres encore spéculent qu’il existe des phénotypes de LDN matures et immatures en fonction de la présence ou de l’absence de la maladie 11,12,13. Néanmoins, des LDN ont également été détectés chez des individus en bonne santé ; Cependant, leur inclusion dans certaines études est limitée en raison de la difficulté de les isoler en nombre suffisant⁵.

Cette étude visait à isoler ces deux populations dans des quantités qui nous permettraient de réaliser des expériences métaboliques in situ en aval (minimum 0,5 × 10⁶ cellules/mL). Ce faisant, un protocole existant⁵ a été optimisé avec des marqueurs phénotypiques^13,14 couramment rapportés qui fournissent le meilleur résultat pour isoler et caractériser les LDN et les NDN du sang total (Figure 1A).

Protocole

Des échantillons de sang ont été prélevés avec le consentement éclairé de participants en bonne santé. L’étude a reçu l’approbation du comité d’éthique de la recherche de l’hôpital St. James et de l’hôpital universitaire de Tallaght.

1. Préparation d’un milieu à gradient de densité, de fractions de solutions de travail isotoniques et d’un tampon de séparation cellulaire

1. Préparation de solutions de travail isotoniques à partir d’un milieu à gradient de densité
   1. Préparation de la solution de travail isotonique à 100 % (~1,123 g/mL)
      1. Pour préparer la solution isotonique de travail à 100 %, combinez 27 ml de milieu à gradient de densité avec 3 ml de PBS 10x. Il en résulte une solution isotonique adaptée à d’autres dilutions.
   2. Préparation de la solution de travail isotonique à 81 % (~1,0996 g/mL)
      1. Préparez la solution de travail isotonique à 81 % en mélangeant 8,1 ml de solution de travail isotonique à 100 % (préparée à l’étape 1.1.1) avec 1,9 ml de 1x PBS. Bien mélanger pour assurer l’homogénéité.
   3. Préparation de la solution de travail isotonique à 70 % (~1,0861 g/mL)
      1. Pour préparer la solution de travail isotonique à 70 %, combinez 7 ml de solution de travail isotonique à 100 % avec 3 ml de 1x PBS. Assurez-vous que la solution est bien mélangée.
   4. Préparation de la solution de travail isotonique à 55 % (1,0676 g/mL)
      1. Préparez la solution isotonique à 55 % en mélangeant 5,5 ml de la solution isotonique à 100 % avec 4,5 ml de 1 x PBS. Mélanger.
2. Superposition de fractions de gradient
   1. Superposition de fractions dégradées
      1. À l’aide d’un tube conique de 15 ml, superposer soigneusement 3 ml de la solution de travail isotonique à 81 % au fond. Ensuite, superposez lentement et doucement 3 ml de la solution isotonique à 70 %, en évitant de mélanger les couches. Ce gradient sera utilisé pour la séparation des cellules.
3. Préparation du tampon de séparation cellulaire
   1. Préparation de 500 mL de tampon de séparation cellulaire
      1. Pour préparer le tampon de séparation cellulaire, combinez 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) avec 1x PBS pour un volume total de 500 mL. Utilisez ce tampon pour laver et remettre en suspension les cellules pendant le processus d’isolement.
         REMARQUE : Assurez-vous que les couches sont bien séparées et non perturbées. Dans ce protocole, les solutions de travail isotoniques sont appelées « 100 % », « 81 % », « 70 % » et « 55 % » en fonction de la méthode de préparation, conformément aux études précédentes⁵. Cependant, il est important de préciser que ces étiquettes ne représentent pas les concentrations finales réelles des solutions de travail. Par exemple, le milieu à gradient de densité « 100 % » est préparé en mélangeant 27 mL de milieu à gradient de densité pur avec 3 mL de 10x PBS, ce qui donne une concentration finale de solution de travail isotonique à 90 %. Les dilutions subséquentes (p. ex., « 81 % », « 70 % » et « 55 % ») reflètent de la même manière les ratios de préparation plutôt que les concentrations en pourcentage réels. Cette nomenclature a été conservée par souci de cohérence avec la terminologie utilisée dans la littérature antérieure sur le sujet.

2. Isolement des neutrophiles du sang total par sélection négative

1. Préparation des billes magnétiques
   1. Vortex soigneusement les billes magnétiques pendant 30 secondes pour s’assurer qu’elles sont complètement remises en suspension avant utilisation.
2. Préparation du sang
   1. Pour chaque donneur, aliquote 4 mL de sang total dans trois tubes distincts à fond rond de 14 mL.
3. Ajout d’un cocktail d’isolement des neutrophiles et de billes magnétiques
   1. Ajouter 50 μL de cocktail d’isolement des neutrophiles et 50 μL de billes magnétiques par mL de sang dans chaque tube. Pour 4 ml de sang, ajoutez 200 μL de chaque réactif.
   2. Remettez bien le mélange en suspension en le pipetant doucement et incubez à température ambiante (RT) pendant 5 min pour permettre aux réactifs de se lier aux cellules indésirables.
4. Lavage et séparation magnétique - premier tour
   1. Remplissez chaque tube à 12 ml à l’aide d’un tampon de séparation des cellules et mélangez soigneusement.
   2. Placez les tubes sans couvercles sur un aimant et laissez-les incuber à RT pendant 10 minutes pour permettre aux billes magnétiques liées aux cellules indésirables d’être attirées vers la paroi du tube.
5. Collection de cellules non liées
   1. Transférez avec précaution la suspension à cellules transparentes contenant des neutrophiles de chaque tube dans un nouveau tube propre à l’aide d’une pipette de transfert. Retirez le tube d’origine de l’aimant.
6. Réapplication et incubation de billes magnétiques - deuxième tour
   1. Vortex à nouveau les billes magnétiques pendant 30 s. Ajoutez le même volume de billes magnétiques à la suspension de cellule nouvellement transférée qu’à l’étape 2.3. Remettez complètement en suspension et incubez à RT pendant encore 5 min.
7. Séparation magnétique finale et collecte
   1. Replacez les tubes sur l’aimant sans couvercle et incubez à RT pendant encore 10 min.
   2. Transférez avec précaution la suspension à cellules transparentes dans un nouveau tube. Cette suspension finale représente la population totale isolée de neutrophiles.

3. Séparation des neutrophiles de basse densité (LDN) et des neutrophiles de densité normale (NDN) de la population totale de neutrophiles

1. Groupage et préparation de suspensions cellulaires
   1. Pour chaque donneur, regrouper les suspensions de neutrophiles isolées dans des tubes de 50 mL. Remplissez chaque tube jusqu’à un volume total de 50 ml à l’aide du tampon de séparation des cellules.
2. Centrifugation
   1. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 5 min à RT avec le frein serré.
3. Resuspension et comptage des cellules
   1. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de neutrophiles dans 1 mL de tampon de séparation cellulaire. Effectuez une numération cellulaire pour déterminer le nombre total de neutrophiles.
4. Préparation du milieu à gradient de densité
   1. Centrifugez à nouveau les tubes à 400 x g pendant 5 min à RT avec le frein serré. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de neutrophiles dans 3 mL du milieu à gradient de densité de 55 %. Pour une résolution optimale, utilisez 3 ml de milieu à gradient de densité de 55 % par 5-6 × 10⁶ neutrophiles au total.
   2. Si nécessaire, répartissez les cellules remises en suspension dans plusieurs tubes à gradient de densité préfabriqués, en veillant à ce que 3 ml de suspension cellulaire soient superposés dans chaque tube.
5. Superposition sur des tubes à gradient de densité
   1. Superposer lentement la suspension cellulaire de 3 mL contenant le milieu à gradient de densité de 55 % sur les tubes à gradient de densité préfabriqués (préparés comme décrit à la section 1). Assurez-vous d’une superposition minutieuse pour ne pas perturber la pente.
6. Centrifugation par gradient de densité
   1. Centrifuger les tubes à 720 x g pendant 30 min sans utiliser le frein. Après la centrifugation, manipulez les tubes avec précaution pour ne pas perturber les couches.
7. Isolement des fractions de neutrophiles
   1. Après la centrifugation, observez que les neutrophiles se séparent en deux couches distinctes :
      Les neutrophiles de faible densité (LDN) seront situés à l’interface 55 %/70 %, formant une bande supérieure à environ 3 ml, et les neutrophiles de densité normale (NDN) seront à l’interface 70 %/81 %, apparaissant comme une bande inférieure autour de la marque 6 ml.
   2. À l’aide d’une pipette de transfert, isolez soigneusement chaque couche et transférez-les dans des tubes séparés de 15 ml.
8. Lavage de fractions isolées
   1. Pour éliminer tout milieu à gradient de densité résiduel, ajoutez 1 fois PBS à chaque tube de 15 ml jusqu’au repère de 15 ml.
   2. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min à RT avec le frein serré. Si les cellules ne forment pas une pastille ferme et restent en suspension, répétez cette étape de lavage, indiquant la présence d’un milieu de gradient de densité restant.
9. Comptage cellulaire et applications en aval
   1. Comptez les cellules dans chaque fraction et procédez aux applications en aval telles que les expériences métaboliques, la coloration par cytométrie en flux, l’extraction d’ARN ou la lyse des protéines, selon les besoins.
      REMARQUE : Après avoir plaqué les cellules, il est recommandé de faire tourner la plaque à 210 × g pendant 1 min (frein desserré).

4. Phénotypage de LDN et NDN isolés

1. Isolez ~0,5-1 × 10⁶ LDN et NDN. Préparez un mastermix d’anticorps concentré 2x en utilisant CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, bloc Fc et coloration de viabilité.
2. Colorer les populations isolées de LDN et de NDN avec un volume équivalent du mastermix d’anticorps de sorte que la dilution finale des anticorps colorant les cellules soit respectivement de 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, bloc Fc) et de 1:50 (coloration de viabilité).
3. Incuber les cellules pendant 10 min dans l’obscurité à RT.
   REMARQUE : Assurez-vous que les cellules sont bien mélangées avec le mastermix d’anticorps et le bloc Fc.
4. Lavez une fois les cellules avec du PBS, puis centrifugez-les à 400 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
5. Fixez les cellules dans du paraformaldéhyde à 1 % (PFA) pendant 15 min à RT dans l’obscurité.
6. Lavez à nouveau les cellules avec du PBS, centrifugez-les à 400 × g pendant 5 minutes et jetez le surnageant.
7. Remettre les cellules en suspension dans 200 μL de PBS ou au besoin et acquérir les cellules sur un cytomètre en flux dès que possible.
   REMARQUE : Les cellules colorées et fixées peuvent être stockées à court terme à 4 ^°C dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment des fluorophores. Cependant, idéalement, la procédure de phénotypage doit être effectuée rapidement après la coloration et la fixation afin de garantir une viabilité cellulaire optimale et des résultats précis.

Résultats

La superposition réussie des neutrophiles totaux sur le milieu de gradient de densité peut être observée à la figure 1B. Deux bandes distinctes doivent être obtenues. Si le mélange des gradients se produit, ou si le nombre total de neutrophiles stratifiés par tube est élevé (supérieur à environ 5-6 × 10⁶), les bandes auront l’air diffuses (figure 1C) et le risque de mélange des deux sous-types de neutr...

Discussion

Ici, nous présentons une méthode optimisée de division de la population totale de neutrophiles en neutrophiles de faible densité et de densité normale, ainsi qu’une caractérisation phénotypique de chaque type de cellule à l’aide de la cytométrie en flux adaptée des méthodes précédentes⁵.

Ce protocole est basé sur l’isolement des LDN et des NDN dans le sang total. Une étape cruciale est que les neutrophiles totaux so...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube (17 x 100 mm)	Corning Science	352059
APC anti-human CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)	BioLegend	312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep Magnet	StemCell Technologies	#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)	StemCell Technologies	#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	StemCell Technologies	#19666
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)	BioLegend	302005
OneComp eBeads Compensation Beads	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 anti-human CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 anti-human CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
Phosphate-Buffered Saline Tablets	Gibco	18912-014
Zombie NIR Fixable Viability Kit	BioLegend	423105