Die Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen niedriger und normaler Dichte aus Vollblut

Zusammenfassung

Hier bieten wir einen zuverlässigen Ansatz für die Isolierung von Neutrophilen niedriger und normaler Dichte aus Vollblut mittels magnetischer Isolierung (negative Selektion) und diskontinuierlichem Dichtegradientenmedium. Es gewährleistet die unberührte Isolierung hochreiner Zellen (≥93%) und ermöglicht eine genaue nachgelagerte Analyse von Neutrophilen-Subpopulationen, die für das Verständnis ihrer Rolle bei Gesundheit und Krankheit entscheidend ist.

Zusammenfassung

Neue Forschungsergebnisse zeigen, dass die zirkulierende neutrophile Population beim Menschen aus verschiedenen Subtypen besteht und nicht als eine einzige Population untersucht werden sollte, wie dies in der Vergangenheit der Fall war. Insbesondere wurde gezeigt, dass Neutrophile mit niedriger und normaler Dichte (LDNs, NDNs) funktionell und metabolisch unterschiedliche Profile aufweisen, ein Faktor, der bei der Veröffentlichung von Neutrophilenforschung berücksichtigt werden muss. In dieser Arbeit stellen wir eine modifizierte Methode zur unberührten Isolierung und Trennung von LDNs und NDNs aus Vollblut vor.

Das Dichtegradientenmedium (1,135 g/mL) wird bei 9:10 mit 10x PBS kombiniert. Spezifische Dichtegradienten von 55%, 70% und 81% werden anschließend durch die Kombination des 100%igen Dichtegradientenmediums mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt. Neutrophile, die aus 12 ml peripherem Vollblut isoliert wurden, das von eingewilligten Spendern unter Verwendung eines auf negativer Selektion basierenden magnetischen Isolationskits gewonnen wurde, werden in der 55%-Fraktion resuspendiert. Ein Volumen von 3 mL der 81%- und 70%-Fraktion wird in ein 15-ml-Röhrchen geschichtet, gefolgt von der 55%-Fraktion mit der Gesamtanzahl der Neutrophilen. Die Dichtegradienten werden dann bei 720 x g für 30 min zentrifugiert. An der 55%/70%-Schnittstelle (LDNs) und der 70%/81%-Schnittstelle (NDNs) werden zwei unterschiedliche Banden erhalten. Die Zellen werden vorsichtig in separate Röhrchen pipettiert und mit PBS gewaschen. Die Reinheit der isolierten Fraktionen wird mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Sowohl LDNs als auch NDNs wurden mittels Durchflusszytometrie als CD14lo CD15+ SSChi definiert. Die Isolationsreinheit wurde für beide Typen mit ≥93 % lebensfähiger Zellen berechnet.

Diese Methode bietet einen zuverlässigen und effizienten Ansatz zur Trennung von LDN und NDNs aus dem peripheren Blut und gewährleistet eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit der isolierten Zellen. Die Verbesserung der Präzision der Neutrophilenisolierung ermöglicht genauere nachgelagerte Analysen dieser unterschiedlichen Neutrophilen-Subpopulationen. Diese sind entscheidend für unser Verständnis der Heterogenität von Neutrophilen und ihrer Auswirkungen in verschiedenen physiologischen und pathologischen Kontexten.

Einleitung

Neutrophile sind granuläre Immunzellen und die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im peripheren Blut und machen im Durchschnitt etwa 50 % bis 70 % der Leukozyten aus. Sie entwickeln sich im Knochenmark aus Granulozyten-Monozyten-Vorläufern (GMPs), die sich wiederum aus hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) in Gegenwart des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors (G-CSF) entwickeln. Bei der Homöostase haben sie eine Lebensdauer von ~24 Stunden, aber Studien haben gezeigt, dass ihre Lebensdauer unter bestimmten physiologischen Bedingungen und den damit verbundenen Mikroumgebungen wie chronischer Immunaktivierung¹, Entzündung¹ und sogar Gewebeaufenthalt im Steady State² verlängert werden kann. Neutrophile gelten seit langem als die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger und lösen ihre antimikrobielle Wirkung durch 3 Haupteffektorfunktionen aus - Degranulation, Phagozytose und Aktivierung und Freisetzung der extrazellulären Falle (NET) (NETosis) für Neutrophile.

Die meisten Studien zur Funktion und Biologie von Neutrophilen untersuchen die Ergebnisse für die gesamte Neutrophilenpopulation. Von Studien in Krebsumgebungen, in denen die Subtypen N1 (Antitumor)/ N2 (Pro-Tumor) abgegrenzt wurden, bis hin zur Klassifizierung von Neutrophilen auf der Grundlage von Reife, Krankheit und physiologischem Zustand und sogar der Zelldichte (Neutrophile mit niedriger Dichte und normaler Dichte) wurde jedoch zunehmend deutlich, dass die menschliche Neutrophilenpopulation phänotypisch vielfältige Subtypen umfasst. Unabhängig davon, ob die Existenz dieser neutrophilen Subtypen auf völlig unterschiedliche Zelltypen oder auf die komplexe Natur der Plastizität zurückzuführen ist, gibt es eine wachsende Menge an Literatur über atypische Neutrophile und bietet eine überzeugende Möglichkeit, Neutrophile mit niedriger Dichte getrennt von Neutrophilen mit normaler Dichte zu untersuchen³.

LDNs, die zum ersten Mal bei SLE-Patienten als proinflammatorische Neutrophilen-Untergruppe⁴ beschrieben wurden, wurden seitdem bei chronischen Krankheiten, in der Schwangerschaft und sogar in einem gesunden Kreislauf sowohl in proinflammatorischen als auch in suppressiven Funktionen identifiziert 5,6,7,8. LDNs werden gleichzeitig mit mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) gefunden, wenn Vollblut über Dichtegradientenmedien zentrifugiert wird. Ihre spezifische Dichte entspricht etwa 1,077 g/ml, verglichen mit NDNs bei 1,083 g/mL⁹. Obwohl es immer noch erhebliche Debatten zu diesem Thema gibt, gibt es Spekulationen, dass LDNs einem unreiferen Granulozyten-Phänotyp ähneln (ähnlich wie Promyelozyten und Myelozyten, mit einer Dichte unter 1.080 g/ml)^9,10. Andere spekulieren immer noch, dass es sowohl reife als auch unreife LDN-Phänotypen gibt, abhängig vom Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Krankheit 11,12,13. Nichtsdestotrotz wurden LDNs auch bei gesunden Personen nachgewiesen; Ihre Einbeziehung in einige Studien ist jedoch aufgrund der Schwierigkeit, sie in ausreichender Zahl zu isolieren, begrenzt⁵.

Ziel dieser Studie war es, diese beiden Populationen in Mengen zu isolieren, die es uns ermöglichen würden, nachgelagerte In-situ-Stoffwechselexperimente durchzuführen (mindestens 0,5 × 10⁶ Zellen/ml). Dabei wurde ein bestehendes Protokoll⁵ mit häufig berichteten phänotypischen Markern^13,14 optimiert, die das beste Ergebnis für die Isolierung und Charakterisierung von LDNs und NDNs aus Vollblut liefern (Abbildung 1A).

Protokoll

Blutproben wurden mit Einverständniserklärung von gesunden Teilnehmern entnommen. Die Studie wurde von der Forschungsethikkommission des St. James's Hospital und des Tallaght University Hospital genehmigt.

1. Aufbereitung des Dichtegradientenmediums, der isotonischen Arbeitslösungsfraktionen und des Zelltrennpuffers

1. Herstellung isotonischer Arbeitslösungen aus Dichtegradientenmedium
   1. Herstellung von isotonischer 100%iger Arbeitslösung (~1,123 g/ml)
      1. Um die isotonische 100%ige Arbeitslösung herzustellen, kombinieren Sie 27 mL Dichtegradientenmedium mit 3 mL 10x PBS. Daraus ergibt sich eine isotonische Lösung, die für weitere Verdünnungen geeignet ist.
   2. Herstellung einer isotonischen 81%igen Arbeitslösung (~1,0996 g/ml)
      1. Bereiten Sie die isotonische 81%ige Arbeitslösung vor, indem Sie 8,1 ml der isotonischen 100%igen Arbeitslösung (hergestellt in Schritt 1.1.1) mit 1,9 ml 1x PBS mischen. Gründlich mischen, um die Homogenität zu gewährleisten.
   3. Herstellung einer isotonischen 70%igen Arbeitslösung (~1,0861 g/ml)
      1. Um die isotonische 70%ige Arbeitslösung herzustellen, kombinieren Sie 7 mL der isotonischen 100%igen Arbeitslösung mit 3 mL 1x PBS. Stellen Sie sicher, dass die Lösung gut vermischt ist.
   4. Herstellung einer isotonischen 55%igen Arbeitslösung (1,0676 g/ml)
      1. Stellen Sie die isotonische 55%ige Arbeitslösung her, indem Sie 5,5 ml der isotonischen 100%igen Arbeitslösung mit 4,5 ml 1x PBS mischen. Gründlich mischen.
2. Schichtung von Gradientenfraktionen
   1. Schichtung von Gradientenfraktionen
      1. Mit einem konischen 15-ml-Röhrchen vorsichtig 3 mL der isotonischen 81%igen Arbeitslösung auf den Boden schichten. Schichten Sie dann langsam und vorsichtig 3 mL der isotonischen 70%igen Arbeitslösung darauf, wobei Sie ein Mischen der Schichten vermeiden sollten. Dieser Gradient wird für die Zelltrennung verwendet.
3. Vorbereitung des Zelltrennpuffers
   1. Vorbereitung von 500 mL Zelltrennpuffer
      1. Zur Herstellung des Zelltrennungspuffers kombinieren Sie 2 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit 1x PBS zu einem Gesamtvolumen von 500 ml. Verwenden Sie diesen Puffer, um Zellen während des Isolierungsprozesses zu waschen und wieder zu suspendieren.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Schichten gut voneinander entfernt und ungestört sind. In diesem Protokoll werden die isotonischen Arbeitslösungen als "100 %", "81 %", "70 %" und "55 %" bezeichnet, basierend auf der Zubereitungsmethode, die mit früheren Studien übereinstimmt⁵. Es ist jedoch wichtig klarzustellen, dass diese Etiketten nicht die tatsächlichen Endkonzentrationen der Arbeitslösungen darstellen. Zum Beispiel wird das "100%"-Dichtegradientenmedium hergestellt, indem 27 mL reines Dichtegradientenmedium mit 3 mL 10x PBS gemischt werden, was zu einer Endkonzentration von 90% isotonischer Arbeitslösung führt. Die nachfolgenden Verdünnungen (z. B. "81 %", "70 %" und "55 %") spiegeln in ähnlicher Weise die Präparationsverhältnisse und nicht die tatsächlichen prozentualen Konzentrationen wider. Diese Nomenklatur wurde beibehalten, um die Konsistenz mit der Terminologie zu wahren, die in der früheren Literatur zu diesem Thema verwendet wurde.

2. Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut mittels Negativselektion

1. Aufbereitung von magnetischen Kügelchen
   1. Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen 30 s lang gründlich ein, um sicherzustellen, dass sie vor der Verwendung vollständig resuspendiert sind.
2. Blutaufbereitung
   1. Für jeden Spender aliquotieren Sie 4 ml Vollblut in drei separate 14-ml-Röhrchen mit rundem Boden.
3. Zugabe von Neutrophilen-Isolationscocktail und magnetischen Kügelchen
   1. Geben Sie 50 μl Neutrophilen-Isolationscocktail und 50 μl magnetische Kügelchen pro ml Blut in jedes Röhrchen. Für 4 ml Blut fügen Sie 200 μl jedes Reagenzes hinzu.
   2. Resuspendieren Sie die Mischung gut, indem Sie sie vorsichtig pipettieren und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, damit die Reagenzien an unerwünschte Zellen binden können.
4. Waschen und magnetische Abscheidung - erste Runde
   1. Füllen Sie jedes Röhrchen mit Zelltrennpuffer auf 12 ml auf und mischen Sie es gründlich.
   2. Legen Sie die Röhrchen ohne Deckel auf einen Magneten und lassen Sie sie 10 Minuten lang bei RT inkubieren, damit die magnetischen Kügelchen, die an unerwünschte Zellen gebunden sind, an die Röhrchenwand gezogen werden können.
5. Sammlung ungebundener Zellen
   1. Die Klarzellsuspension, die Neutrophile aus jedem Röhrchen enthält, wird mit einer Transferpipette vorsichtig in ein neues, sauberes Röhrchen überführt. Entfernen Sie das Originalrohr vom Magneten.
6. Wiederaufbringen und Inkubieren von magnetischen Beads - zweite Runde
   1. Vortex die magnetischen Kügelchen erneut für 30 s. Geben Sie das gleiche Volumen an magnetischen Kügelchen in die neu übertragene Zellsuspension wie in Schritt 2.3. Gründlich resuspendieren und weitere 5 Minuten bei RT inkubieren.
7. Abschließende magnetische Trennung und Sammlung
   1. Setzen Sie die Röhrchen ohne Deckel wieder auf den Magneten und inkubieren Sie weitere 10 Minuten bei RT.
   2. Übertragen Sie die Klarzellensuspension vorsichtig in ein neues Röhrchen. Diese letzte Suspension stellt die isolierte Gesamtpopulation der Neutrophilen dar.

3. Trennung von Neutrophilen niedriger Dichte (LDNs) und Neutrophilen normaler Dichte (NDNs) von der Gesamtpopulation von Neutrophilen

1. Pooling und Aufbereitung von Zellsuspensionen
   1. Für jeden Spender werden die isolierten neutrophilen Suspensionen in 50-ml-Röhrchen zusammengefasst. Füllen Sie jedes Röhrchen mit dem Zelltrennpuffer auf ein Gesamtvolumen von 50 mL auf.
2. Zentrifugation
   1. Die Röhrchen bei 400 x g für 5 min bei RT mit angezogener Bremse zentrifugieren.
3. Resuspension und Zellzählung
   1. Den Überstand verwerfen und das neutrophile Pellet in 1 ml Zelltrennungspuffer resuspendieren. Führen Sie eine Zellzählung durch, um die Gesamtzahl der Neutrophilen zu bestimmen.
4. Dichtegradienten-Medium-Vorbereitung
   1. Die Röhrchen erneut bei 400 x g für 5 min bei RT mit angezogener Bremse zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Neutrophilenpellet in 3 mL des Mediums mit einem Dichtegradienten von 55 %. Für eine optimale Auflösung verwenden Sie 3 ml 55% Dichtegradientenmedium pro 5-6 × 10⁶ Neutrophilen insgesamt.
   2. Teilen Sie die resuspendierten Zellen bei Bedarf auf mehrere vorgefertigte Dichtegradientenröhrchen auf und stellen Sie sicher, dass 3 ml der Zellsuspension in jedes Röhrchen geschichtet werden.
5. Schichtung auf Rohre mit Dichtegradient
   1. Schichten Sie die 3-ml-Zellsuspension mit dem 55%igen Dichtegradientenmedium langsam auf die vorgefertigten Dichtegradientenröhrchen (wie in Abschnitt 1 beschrieben vorbereitet). Achten Sie auf eine sorgfältige Schichtung, um den Farbverlauf nicht zu stören.
6. Dichtegradienten-Zentrifugation
   1. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 720 x g für 30 min, ohne die Bremse zu benutzen. Behandeln Sie die Röhrchen nach dem Zentrifugieren vorsichtig, um eine Störung der Schichten zu vermeiden.
7. Isolierung von neutrophilen Fraktionen
   1. Beobachten Sie, wie sich die Neutrophilen nach der Zentrifugation in zwei verschiedene Schichten aufteilen:
      Neutrophile mit niedriger Dichte (LDNs) befinden sich an der 55%/70%-Grenzfläche und bilden eine obere Bande bei etwa der 3-ml-Marke, und Neutrophile mit normaler Dichte (NDNs) befinden sich an der 70%/81%-Grenzfläche und erscheinen als untere Bande um die 6-ml-Marke.
   2. Isolieren Sie jede Schicht vorsichtig mit einer Transferpipette und übertragen Sie sie in separate 15-ml-Röhrchen.
8. Waschen von isolierten Fraktionen
   1. Um das restliche Dichtegradientenmedium abzuwaschen, geben Sie 1x PBS zu jedem 15-ml-Röhrchen bis zur 15-ml-Markierung.
   2. Bei 400 × g für 5 min bei RT mit angezogener Bremse zentrifugieren. Wenn die Zellen kein festes Pellet bilden und stattdessen suspendiert bleiben, wiederholen Sie diesen Waschschritt, um das Vorhandensein von verbleibendem Dichtegradientenmedium anzuzeigen.
9. Zellzählung und Downstream-Anwendungen
   1. Zählen Sie die Zellen in jeder Fraktion und fahren Sie bei Bedarf mit nachgelagerten Anwendungen wie Stoffwechselexperimenten, Durchflusszytometrie-Färbung, RNA-Extraktion oder Proteinlyse fort.
      HINWEIS: Nach dem Herausplattieren der Zellen wird empfohlen, die Platte 1 Minute lang bei 210 × g (Bremse aus) herunterzudrehen.

4. Phänotypisierung von isolierten LDN und NDN

1. Isolieren Sie ~0,5-1 × 10⁶ LDNs und NDNs. Stellen Sie einen 2x konzentrierten Antikörper-Mastermix mit CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc-Block und Viabilitätsfärbung her.
2. Die isolierten LDN- und NDN-Populationen werden mit einem äquivalenten Volumen des Antikörper-Mastermixes gefärbt, so dass die endgültige Verdünnung der Antikörper, die die Zellen färben, 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc-Block) bzw. 1:50 (Viabilitätsfärbung) beträgt.
3. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang im Dunkeln bei RT.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen gründlich mit dem Antikörper-Mastermix und dem Fc-Block gemischt sind.
4. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, zentrifugieren Sie sie dann bei 400 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
5. Fixieren Sie die Zellen in 1% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei RT im Dunkeln.
6. Waschen Sie die Zellen erneut mit PBS, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 400 × g und entsorgen Sie den Überstand.
7. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl PBS oder nach Bedarf und entnehmen Sie die Zellen so schnell wie möglich auf einem Durchflusszytometer.
   HINWEIS: Die gefärbten und fixierten Zellen können kurzfristig bei 4 ^°C im Dunkeln gelagert werden, um ein Photobleichen der Fluorophore zu verhindern. Im Idealfall sollte das Phänotypisierungsverfahren jedoch unmittelbar nach der Färbung und Fixierung durchgeführt werden, um eine optimale Zellviabilität und genaue Ergebnisse zu gewährleisten.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Schichtung der Gesamtneutrophilen über das Dichtegradientenmedium ist in Abbildung 1B zu sehen. Es sollten zwei unterschiedliche Banden erhalten werden. Wenn es zu einer Vermischung der Gradienten kommt oder die Anzahl der insgesamt geschichteten Neutrophilen pro Röhrchen hoch ist (größer als etwa 5-6 × 10⁶), sehen die Banden diffus aus (Abbildung 1C), und das Risiko, dass sich die beiden neutrop...

Diskussion

Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Aufspaltung der gesamten Neutrophilenpopulation in Neutrophile mit niedriger und normaler Dichte vor, zusammen mit einer phänotypischen Charakterisierung jedes Zelltyps mittels Durchflusszytometrie, die von früheren Methoden adaptiert wurde⁵.

Dieses Protokoll basiert auf der Isolierung von LDNs und NDNs aus Vollblut. Ein entscheidender Schritt ist, dass die Gesamtzahl der Neutrophilen durch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube (17 x 100 mm)	Corning Science	352059
APC anti-human CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 anti-human CD10 (25 tests)	BioLegend	312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep Magnet	StemCell Technologies	#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)	StemCell Technologies	#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	StemCell Technologies	#19666
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)	BioLegend	302005
OneComp eBeads Compensation Beads	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 anti-human CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 anti-human CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
Phosphate-Buffered Saline Tablets	Gibco	18912-014
Zombie NIR Fixable Viability Kit	BioLegend	423105