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摘要

在本研究中,开发了一种基于双抗体的夹心检测技术,用于快速检测幽 门螺杆菌感染的粪便抗原。

摘要

幽门螺杆菌 可寄生于胃粘膜,感染后可引起一系列胃肠道疾病,与胃炎、胃溃疡、胃癌密切相关。在医疗基础设施落后和卫生条件不足的地区, 幽门螺杆菌 感染的高患病率仍然是一个重大的公共卫生问题。因此,在资源有限地区开发快速、简单且具有成本效益的幽门 螺杆菌 检测筛查方法至关重要。

在这项研究中,我们在广东省石潭村进行了基于社区的筛查,石潭村是一个偏远且不发达的地区,常住人口约为 300 人,受教育程度普遍较低。我们采用双抗体夹心测定法检测 幽门螺杆菌 粪便抗原,选择这种方法是因为它在资源匮乏环境中的潜在适用性。共有来自该村的 261 名参与者被招募,并使用这种技术分析了他们的粪便样本。为了进行比较验证,对相同的样品进行定量聚合酶链反应 (qPCR) 分析。与 qPCR 结果相比,粪便中幽 门螺杆菌 抗原检测的灵敏度和特异性分别为 60.24% 和 80.08%。结果表明,粪便抗原检测方法与 qPCR 之间具有很强的一致性 (Kappa = 0.630)。 本研究系统阐明了粪抗原检测幽门 螺杆菌 感染的原理、程序、方法和临床应用,旨在探索基于乳胶的双抗体夹心技术,并为其辅助诊断建立新的策略和实用指南。

引言

门螺杆菌 (H. pylori, Hp) 是一种微需氧、螺旋形、革兰氏阴性菌1。由于其定植和慢性感染人胃的能力2,该病原体已被确定为胃腺癌发展的主要病因因素 3,4。2015 年,全球有 ~44 亿人患有幽门螺杆菌感染5幽门螺杆菌感染的患病率表现出相当大的地理差异,与发达国家相比,发展中国家的患病率明显更高。值得注意的是,在低收入国家和某些弱势群体中,感染率可高达 75%6

尽管胃镜检查等传统检测方法准确,但由于其侵入性、高成本和患者接受度低,它们在大规模筛查和常规随访中的应用受到限制7。因此,寻找无创、简单、快速的诊断方法已成为现代临床医学研究的重要方向。幽门螺杆菌无创诊断的主要目的是在没有内窥镜检查的情况下准确、安全、方便地检测患者是否感染了幽门螺杆菌。尿素呼气试验 (UBT)、幽门螺杆菌粪便抗原检测 (FAT)8 和血清学检测9 是常用的无创技术。

其中,UBT 是侵入性最小、最准确的程序10。UBT 的敏感性和特异性高于 95%11。在可用的无创诊断方法中,UBT 已被证明是最准确和可靠的,正如在伊拉克进行的一项验证研究所见,UBT 可能被推荐为首选,因为它与其他方法相比性能更高12。然而,UBT 也有其缺点,例如成本高和需要质谱分析,这限制了在偏远或资源有限的环境中的应用13

迫切需要开发一种快速、无创且具有成本效益的诊断方法来检测 幽门螺杆菌 感染,尤其是在资源有限的地区。在本研究中,我们开发了一种基于双抗体夹心检测技术的幽 门螺杆 菌粪便抗原快速检测技术,可以快速、有效、低成本地检测粪便样本中的 幽门螺杆菌 抗原。这项技术具有显着优势,包括经济性、非侵入性、用户友好性和对偏远地区的适应性。我们假设检测 幽门螺杆菌 粪便抗原的双抗体夹心法将表现出与 qPCR 相当的敏感性和特异性,将其定位为无创临床诊断的可行工具。

我们全面详细介绍了幽门 螺杆菌 感染粪便抗原检测的原则、程序、方法学优势和临床适用性。为了验证其实用性,我们在中国广东省清远市石潭村进行了流行病学调查和筛查,这是一个偏远且不发达的地区,常住人口约为 400 人,受教育程度有限。我们的结果表明,本文设计的粪便中 幽门螺杆菌 抗原的快速检测技术可以在 20 min 内完成。强调粪便中幽 门螺杆菌 抗原的快速检测是在偏远和落后地区快速可靠地诊断 幽门螺杆 菌感染的潜在且有前途的工具。

研究方案

本横断面研究已获得广东省人民医院伦理委员会批准(批准文号:KY2024-445-01),研究期间所有研究对象的个人数据均严格保密。所有参与者在实验前都签署了书面知情同意书。选取广东省清远市石潭村居民 2024 年作为研究对象,年龄和性别没有限制。下述双抗体夹心试验(定性实验)由专业医护人员和技术人员根据说明书进行。选择该村的所有常住人口进行这项研究,无论他们是否健康或有症状或任何与胃肠道疾病相关的现有疾病。

1. 患者选择

  1. 如果患者在过去 1 个月内使用过质子泵抑制剂或铋、H2 受体阻滞剂或抗生素,则排除患者。
  2. 要求所有参与者匿名填写问卷。问卷内容包括五个问题: 你有规律地吃三餐吗?你喝酒吗?您知道 幽门螺杆菌吗?您认为有必要进行 幽门螺杆菌 检查吗?您了解 幽门螺杆菌 感染的不良后果吗?

2. 粪便 幽门螺杆菌 感染抗原检测程序

注意: 幽门螺杆菌 粪便抗原检测的算法旨在确保结果的准确性和可靠性,同时考虑到简单性和卫生性。整个过程分为样本采集、样本处理、样本储存、检测、结果判读五个步骤。样品检测工作流程图和示意图如图 1图 2 所示。

  1. 样本采集
    注意:应使用 幽门螺杆菌 抗原特异性容器进行样品采集。样品不应与水、尿液、消毒剂和污水混合。
    1. 排便完成后,取下专用容器的顶盖,取出取样棒。
    2. 将采样棒连续插入凳子的五个不同位置进行采样,确保采样棒的螺纹端完全插入凳子中。
    3. 采样完成后将采样棒插回试剂管中;样品总体积为 ~5-50 mg。
  2. 来样加工
    1. 左右摇动试剂管 ~10 秒,以充分混合稀释剂中的粪便样品(主要成分:乙二胺四乙酸四钠水合物 0.018 g/mL 和氯化钠 0.01 g/mL)。
  3. 样品储存
    1. 采样后尽快对样品进行检测;如有必要,将它们在室温下储存不超过 6 小时,并在冷藏条件下(在 2-8 °C 下不超过 72 小时,在 -25 °C 至 -15 °C 下冷冻不超过 6 个月)以减缓抗原降解和微生物活性。
      注:样品可以反复冻融高达 3 次,冷藏和冷冻样品在测试前都应恢复到室温。
  4. 样品检测
    1. 打开试剂管盖上的白色盖子,保持试剂管直立。
    2. 将盖子向下按至最低点,使样品在测试卡上流动,穿过涂有小鼠抗 Hp 抗体的检测区域 (T) 和质量控制区域 (C)。
  5. 结果解释
    1. 等待 10-20 分钟,以便样品中的任何 幽门螺杆菌 抗原,如果与抗体结合,则在检测区域形成肉眼显色反应。这通常显示为红色或紫色线条,与质量控制区域中的线条形成对比。
    2. 颜色反应的存在与否以及颜色的深度与样品中 幽门螺杆 菌抗原的浓度有关。比较色卡以快速准确地解释结果(参见 图 3)。

3. DNA提取

  1. 将适量粪便放入试管中,加入 PBS 溶液,摇匀充分混匀。将混合物以 12,000 × g 离心 5-10 分钟,然后小心收集 200 μL 上清液用于进一步提取。
  2. 根据样品数量,制备相同数量的 1.5 mL 离心管。向每个试管中依次加入 20 μL 蛋白酶 K (20 mg/mL)、10 μL 磁珠、200 μL 样品上清液和 200 μL 裂解缓冲液 A。倒置试管充分混合,然后在 55 °C 的金属浴中孵育 10 分钟。
  3. 热解完成后,将离心管放在磁架上,静置,并在珠子上吸附 1 分钟。管中的液体完全澄清后,弃去上清液,尽量避免干扰磁珠。
  4. 从磁力架上取下试管,并将其放在 1.5 mL 离心管架上。使用移液器向每个试管中加入 500 μL 洗涤缓冲液 E,充分混合 1 分钟,然后将试管放回磁力架中。让试管静置 1 分钟,澄清后弃去上清液,避免吸出磁珠。
  5. 通过向每个试管中加入 500 μL 洗涤缓冲液 W2 来重复洗涤过程。充分混合 1 分钟,将试管放在磁力架上,静置 1 分钟。溶液澄清后,小心丢弃上清液,确保磁珠不受干扰。
  6. 加入 100 μL 洗脱液,混合,并在 55 °C 下孵育 5 分钟。
  7. 将试管放在磁力架上,静置 2 分钟。溶液澄清后,小心地将洗脱的核酸转移到新的离心管中,避免吸入磁珠。
  8. 通过测量 260 nm (A260) 和 280 nm (A280) 处的吸光度来评估提取的 DNA 的纯度。计算 A260/A280 比率,对于高纯度 DNA,理想情况下应大于 1.8。

4. qPCR 检测 幽门螺杆菌 和对抗生素的耐药性

注意:我们通过扩增 ureA 基因进行了 qPCR 来检测幽门螺杆菌感染。所有阴性质控产品均为无菌纯净水。幽门螺杆菌核酸检测试剂盒中的阳性质量控制产物是灭活的幽门螺杆菌标准珠 (ATCC 43504)。具有典型 S 形曲线的 CT ≤ 30 被认为是阳性的。

  1. 根据要检测的样品数量,从试剂盒中取出 幽门螺杆菌 冻干制剂,快速旋转,使冻干粉末保持在试管底部。
  2. 小心地打开冻干制剂的盖子;取待测样品的核酸;将 25 μL 样品核酸加入冻干制剂中;并盖紧管子。
  3. 摇动并混合 PCR 试剂 8-10 秒,然后快速旋转 3-5 秒。
  4. 对于 32 孔板上的每个样品,制备 25 μL 的 PCR 反应混合物(冻干粉末 [含有 Taq 酶 (5 U/μL)、脱氧核糖核苷三磷酸 (2.5 mmol/L)、UNG 酶 (2 U/μL)、 尿素 A 正向 (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') 和反向 (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') 引物 (40 μmol/L)]),以及 25 μL (2.5 μg) 提取的 DNA。
  5. 在 qPCR 机器上运行 32 孔板 qPCR 板。对热循环仪进行编程:42 °C 和 95 °C(均为一个循环)各 2 分钟;95 °C 持续 10 秒和 65 °C 持续 45 秒(两步为一个循环)10 倍;95 °C 持续 10 秒,在 58 °C 下持续 45 秒(两步为一个循环)共 35 个循环。
  6. 使用特定的 qPCR 软件分析数据,并让仪器自动选择基线阈值。

5. 统计分析

  1. 使用卡方检验分析实验数据,以评估该方法与 qPCR 结果之间的一致性,并在更大范围内(例如,全国范围内)比较该技术筛选的阳性率与 幽门螺杆菌 感染的阳性率数据。考虑 P < 0.05 时具有统计学意义的差异。

结果

问卷调查
该研究共招募了 261 名参与者,包括 144 名女性和 117 名男性,年龄从 4 岁到 99 岁不等。受试者的平均年龄为 48.30 ± 17.61 岁。有 17 名未成年人 (0-17 岁),202 名成人 (18-64 岁) 和 42 名老年 (>64 岁)。问卷结果如 表 1 所示。大多数 (90.8%) 的受试者认为有必要进行 幽门螺杆菌 筛查。

本村粪便?...

讨论

幽门螺杆菌是全世界最广泛的细菌感染之一15。问卷结果显示,55.2% 的人群对幽门螺杆菌缺乏认识,而 90.8% 的人认为幽门螺杆菌筛查是必要的。这些发现强调了在经济落后和偏远地区实施幽门螺杆菌筛查计划的重要性16。尽管尿素呼气试验 (UBT) 是一种常见的诊断方法,但其高成本和不适合儿童和孕妇限制?...

披露声明

作者没有需要声明的利益冲突。

致谢

没有

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA extraction kitJiangsu mole biotechnology co., ltd20230223None
H. pylori fecal antigen detection kitHangzhou nuohui healthy technology co., ltd20213401126None
H. pylori nucleic acid detection kitJiangsu mole biotechnology co., ltd20230226None
Real-time fluorescence quantitative PCRShanghai Hongshi medical treatment technology co., ltd20183221659None
Statistical Product and Service SolutionsIBM companyNoneNone

参考文献

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