Double Antibody Sandwich Detection 기술을 기반으로 Helicobacter pylori 감염의 대변 항원을 신속하게 검출

요약

본 연구에서는 헬리코박터 파일로리균에 감염된 대변 항원을 신속하게 검출할 수 있도록 이중 항체를 기반으로 한 샌드위치 검출 기법을 개발하였다.

초록

헬리코박터 파일로리는 위 점막에 기생할 수 있으며, 이는 감염 후 일련의 위장 질환을 유발할 수 있으며 위염, 위궤양 및 위암과 밀접한 관련이 있습니다. 의료 인프라가 열악하고 위생 시설이 불충분한 지역에서 헬리코박터 파일로리 감염의 높은 유병률은 여전히 중요한 공중 보건 문제로 남아 있습니다. 따라서 자원이 제한된 환경에서 H. pylori 검출을 위한 빠르고 간단하며 비용 효율적인 스크리닝 방법을 개발하는 것이 가장 중요합니다.

이 연구에서는 광둥(廣東)성 시탄(Shitan) 마을에서 지역사회 기반 검진을 실시했는데, 이 지역은 일반적으로 교육 수준이 낮고 약 300명의 거주자가 거주하는 외딴 저개발 지역이다. 우리는 H. pylori 분변 항원의 검출을 위해 이중 항체 샌드위치 분석을 사용했으며, 이는 자원이 부족한 환경에서 잠재적으로 적용할 수 있기 위해 선택된 방법입니다. 마을에서 총 261명의 참가자가 등록되었으며 이 기술을 사용하여 그들의 배설물 샘플을 분석했습니다. 비교 검증을 위해 동일한 샘플에 대해 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 분석을 실시했습니다. qPCR 결과와 비교했을 때, 대변 내 헬리코박터 파일로리 항원 검출의 민감도와 특이도는 각각 60.24%와 80.08%였다. 그 결과 분변 항원 검출 방법과 qPCR(Kappa = 0.630) 간에 강력한 일치가 있음을 보여주었습니다.본 연구는 헬리코박터 파일로리 감염에 대한 분변항원 검출의 원리, 절차, 방법론 및 임상적 응용을 체계적으로 규명하고, 라텍스 기반 이중항체 샌드위치 기술을 탐구하고, 이를 보조진단하기 위한 새로운 전략과 실천 지침을 수립하는 것을 목표로 하였다.

서문

헬리코박터 파일로리균(H. pylori, Hp)은 미호기성, 나선형 모양의 그람 음성 박테리아¹입니다. 인간의 위를 식민지화하고 만성적으로 감염시키는 능력으로 인해 이 병원체는 위 선암종 발병의 주요 병인학적 요인으로 확인되었습니다 ^3,4. 2015년 한 해 동안 전 세계에서 ~44억 명의 사람들이 헬리코박터 파일로리 감염으로 고통받았다⁵. 헬리코박터 파일로리 감염의 유병률은 상당한 지리적 편차를 보이며, 개발도상국은 선진국에 비해 감염률이 현저히 높습니다. 특히 저소득 국가와 특정 취약 인구 집단의 감염률은 75^%6에 달할 수 있습니다.

위내시경 검사와 같은 전통적인 검출 방법은 정확하지만, 침습성, 높은 비용 및 낮은 환자 수용성으로 인해 대규모 선별 검사 및 일상적인 추적 관찰에 적용하는 데 한계가 있습니다⁷. 따라서 비침습적이고 간단하며 신속한 진단 방법을 찾는 것은 현대 임상 의학 연구의 중요한 방향이 되었습니다. 헬리코박터 파일로리 균의 비침습적 진단의 주요 목적은 내시경 검사 없이 환자가 헬리코박터 파일로리 균에 감염되었는지 여부를 정확하고 안전하며 편리하게 검출하는 것입니다. 요소 호흡 검사(UBT), 헬리코박터 파일로리 분변 항원 검사(FAT)⁸ 및 혈청학적 검사⁹ 는 널리 사용되는 비침습적 기법입니다.

이 중 UBT는 가장 방해가 적고 가장 정확한 시술이다¹⁰. UBT의 민감도와 특이도는 95%¹¹ 이상입니다. 이라크에서 실시된 검증 연구에서 볼 수 있듯이 UBT는 사용 가능한 비침습적 진단 방법 중 가장 정확하고 신뢰할 수 있는 것으로 나타났으며, UBT는 다른 방법에 비해 성능이 우수하기 때문에 첫 번째 선택으로 권장될 수 있습니다¹². 그러나 UBT는 높은 비용과 질량 분광 분석의 필요성과 같은 단점도 가지고 있으며, 이로 인해 원격 또는 리소스가 제한된 설정에서 응용 프로그램이 제한됩니다¹³.

헬리코박터 파일로리 감염을 검출하기 위한 신속하고 비침습적이며 비용 효율적인 진단 방법의 개발은 특히 자원이 제한된 지역에서 매우 필요합니다. 본 연구에서는 배설물 시료에서 H. pylori 항원을 빠르고 효과적이며 저렴한 비용으로 검출할 수 있는 이중 항체 샌드위치 검출 기술을 기반으로 H. pylori 분변 항원에 대한 신속한 검출 기술을 개발했습니다. 이 기술은 경제성, 비침습성, 사용자 친화성 및 외딴 지역에 대한 적응성을 포함하여 상당한 이점을 제공합니다. 우리는 H. pylori 분변 항원을 검출하기 위한 이중 항체 샌드위치 방법이 qPCR에 필적하는 민감도와 특이성을 입증하여 비침습적 임상 진단을 위한 실행 가능한 도구로 자리매김할 것이라는 가설을 세웠습니다.

우리는 H. pylori 감염에 대한 대변 항원 검출의 원리, 절차, 방법론적 강점 및 임상적 적용 가능성을 포괄적으로 자세히 설명했습니다. 실용성을 검증하기 위해 중국 광둥성 칭위안시 시탄촌에서 역학 조사와 검사를 실시했는데, 이 마을은 약 400명의 상주 인구와 제한된 교육 성취도를 가진 외딴 저개발 지역입니다. 우리의 결과는 여기에서 설계된 대변에서 H. pylori 항원의 신속한 검출 기술이 20분 이내에 완료될 수 있음을 보여줍니다. 대변에서 H. pylori 항원의 신속한 검출은 외진 및 낙후 지역에서 H. pylori 감염을 빠르고 신뢰할 수 있게 진단할 수 있는 잠재력적이고 유망한 도구라는 점이 강조됩니다.

프로토콜

이 단면 연구는 광둥성 인민병원 윤리위원회(승인 번호: KY2024-445-01)의 승인을 받았으며 모든 연구 대상자의 개인 데이터는 연구 기간 동안 엄격하게 기밀로 유지되었습니다. 모든 참가자는 실험 전에 서면 동의서에 서명했습니다. 2024년 광둥성 칭위안시 시탄촌 주민들을 연구 대상으로 선정했으며, 연령과 성별에 대한 제한은 없었다. 아래에 설명된 이중 항체 샌드위치 분석(정성적 실험)은 지침에 따라 전문 의료 및 기술 인력에 의해 수행되었습니다. 이 연구를 위해 마을의 전체 영구 인구는 건강하거나 증상이 있는지 또는 위장 질환과 관련된 기존 질병이 있는지 여부에 관계없이 선택되었습니다.

1. 환자 선택

1. 지난 1개월 동안 양성자 펌프 억제제 또는 비스무트, H₂ 수용체 차단제 또는 항생제를 사용한 적이 있는 환자는 제외합니다.
2. 모든 참가자에게 익명으로 설문지를 작성하도록 요청합니다. 설문지의 내용은 5개의 질문으로 구성되어 있습니다: 세 끼를 규칙적으로 먹습니까? 술을 마시나요? 헬리코박터 파일로리균에 대해 알고 계신가요? H. pylori 검사를 수행해야 한다고 생각하십니까? 헬리코박터 파일로리 감염의 부작용을 알고 계십니까?

2. 분변 H. pylori 감염 항원 검출 절차

참고: 헬리코박터 파일로리 대변 항원 검사 알고리즘은 단순성과 위생을 고려하여 결과의 정확성과 신뢰성을 보장하도록 설계되었습니다. 전체 프로세스는 샘플 채취, 샘플 처리, 샘플 보관, 검출 및 결과 해석의 5단계로 나뉩니다. 샘플 감지의 작업 흐름도와 개략도는 그림 1 과 그림 2에 나와 있습니다.

1. 시료 채취
   참고: 샘플 수집에는 H. pylori 항원 특이적 용기를 사용해야 합니다. 샘플은 물, 소변, 소독제 및 하수와 혼합되어서는 안 됩니다.
   1. 배변이 완료된 후 특수 용기의 상단 뚜껑을 제거하여 샘플링 로드를 꺼냅니다.
   2. s를 위해 samp링 로드를 스툴의 5가지 다른 위치에 연속적으로 삽입amp링, samp링 로드의 나사산 끝이 스툴에 완전히 삽입되었는지 확인합니다.
   3. 샘플링 로드를 삽입하십시오.amp링이 완료된 후 시약 튜브에 넣습니다. 샘플 부피는 총 ~ 5-50 mg입니다.
2. 샘플 처리
   1. 시약 튜브를 좌우로 ~10초 동안 흔들어 대변 샘플을 희석제(주요 성분: 에틸렌디아민 테트라아세트산, 테트라나트륨 수화물 0.018g/mL, 염화나트륨 0.01g/mL)에 완전히 섞습니다.
3. 시료 보관
   1. 표본 추출 후에 가능한 빨리 표본을 시험하십시오; 항원 분해 및 미생물 활동을 늦추기 위해 필요한 경우 6시간 이하의 실온과 냉장 조건(72-8°C에서 2시간 이하, -25°C에서 -15°C에서 6개월 이하의 냉동)에서 보관하십시오.
      참고: 샘플은 최대 3회까지 반복적으로 냉동 및 해동할 수 있으며 냉장 및 냉동 샘플은 모두 테스트 전에 실온으로 되돌려야 합니다.
4. 샘플 검출
   1. 시약 튜브 덮개의 흰색 덮개를 열고 시약 튜브를 똑바로 세웁니다.
   2. 샘플이 마우스 anti-Hp 항체로 코팅된 검출 영역(T)과 품질 관리 영역(C)을 통과하여 테스트 카드에서 흐르도록 뚜껑을 가장 낮은 지점까지 누릅니다.
5. 결과 해석
   1. 10-20분 동안 기다렸다가 샘플의 H . pylori 항원이 항체에 결합하면 검출 영역에서 거시적 발색 반응을 형성합니다. 이것은 일반적으로 품질 관리 영역의 선과 대조되는 빨간색 또는 자주색 선으로 나타납니다.
   2. 색 반응의 유무와 색의 깊이는 샘플 내 H. pylori 항원의 농도와 관련이 있습니다. 컬러 카드를 비교하여 결과를 빠르고 정확하게 해석합니다( 그림 3 참조).

3. DNA 적출

1. 시험관에 적당량의 대변을 넣고 PBS 용액을 넣고 흔들어 잘 섞는다. 혼합물을 12,000 × g 에서 5-10 분 동안 원심 분리 한 다음 추가 추출을 위해 200 μL의 상등액을 조심스럽게 수집합니다.
2. 샘플 수에 따라 동일한 수의 1.5mL 원심분리 튜브를 준비합니다. 각 튜브에 단백질 분해 효소 K (20 mg/mL) 20 μL, 마그네틱 비드 10 μL, 시료 상등액 200 μL, 용해 완충액 A 200 μL를 순차적으로 첨가합니다. 튜브를 뒤집어 철저히 혼합한 다음 55 °C의 금속 수조에서 10분 동안 배양합니다.
3. 열분해가 완료된 후 원심분리기 튜브를 마그네틱 프레임에 놓고 그대로 두었다가 비드에 1분 동안 흡착이 일어나도록 합니다. 튜브의 액체가 완전히 정화된 후 상등액을 버리고 자성 비드를 방해하지 않도록 하십시오.
4. 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 1.5mL 원심분리기 튜브 랙에 놓습니다. 피펫을 사용하여 각 튜브에 500μL의 세척 버퍼 E를 추가하고 1분 동안 철저히 혼합한 다음 튜브를 마그네틱 랙에 다시 넣습니다. 튜브를 1분 동안 그대로 두고, 정화 후 상층액을 버리고, 자성 비드를 흡인하지 마십시오.
5. 각 튜브에 500μL의 세척 버퍼 W2를 추가하여 세척 과정을 반복합니다. 1분 동안 철저히 혼합하고 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 1분 동안 그대로 두십시오. 용액이 투명해진 후 상등액을 조심스럽게 폐기하여 자성 비드가 방해받지 않도록 합니다.
6. 100μL의 용리액을 넣고 혼합한 후 55°C에서 5분 동안 배양합니다.
7. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 2분 동안 그대로 둡니다. 용액이 투명해지면 용출된 핵산을 새 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮겨 자성 비드의 흡인을 방지합니다.
8. 260 nm (A₂₆₀) 및 280 nm (A₂₈₀)에서 흡광도를 측정하여 추출된 DNA의 순도를 평가합니다. A₂₆₀/_{A 280} 비율을 계산하며, 이는 고순도 DNA의 경우 이상적으로는 1.8보다 커야 합니다.

4. H. pylori 검출 및 항생제에 대한 내성을 위한 qPCR

참고: ureA 유전자를 증폭하여 H. pylori 감염을 검출하기 위해 qPCR을 수행했습니다. 모든 부정적인 품질 관리 제품은 멸균 된 정제수입니다. H. pylori 핵산 검출 키트의 positive quality control 제품은 불활성화된 H. pylori 표준 비드(ATCC 43504)입니다. 전형적인 S자형 곡선을 가진 C_T ≤ 30은 양수로 간주됩니다.

1. 테스트할 샘플의 수에 따라 키트에서 H. pylori 동결 건조 제제를 꺼내 동결 건조 분말이 튜브 바닥에 유지되도록 빠르게 회전시킵니다.
2. 동결 건조 제제의 뚜껑을 조심스럽게 엽니다. 테스트 할 샘플의 핵산을 가져 가라. 25 μL의 시료 핵산을 동결 건조 제제에 첨가합니다. 튜브를 단단히 덮으십시오.
3. PCR 시약을 8-10초 동안 고르게 흔들어 섞은 다음 3-5초 동안 빠르게 회전시킵니다.
4. 32웰 플레이트의 각 샘플에 대해 PCR 반응 혼합물 25μL(동결 건조 분말[Taq 효소(5 U/μL), 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(2.5mmol/L), UNG 효소(2 U/μL), ureA 정방향(5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') 및 역방향(5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') 프라이머(40μmol/L)] 및 추출된 DNA의 25μL(2.5μg)를 준비합니다.
5. qPCR 기계에서 32웰 플레이트 qPCR 보드를 실행합니다. 열 순환기 프로그래밍: 42°C 및 95°C(둘 다 1사이클) 각각 2분; 10 초 동안 95 ° C 및 45 초 동안 65 ° C (두 단계는 1 사이클) 10x; 95 ° C에서 10 초 동안 및 58 ° C에서 45 초 동안 (두 단계는 1 사이클) 35 사이클.
6. qPCR을 위한 특정 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 기기가 기준선 임계값을 자동으로 선택하도록 합니다.

5. 통계 분석

1. 카이제곱 테스트를 사용하여 실험 데이터를 분석하여 이 방법과 qPCR 결과 간의 일관성을 평가하고 이 기술 스크리닝의 양성률을 더 넓은 규모(예: 전국)에서 H. pylori 감염의 양성률 데이터와 비교합니다. P < 0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 고려합니다.

결과

설문지 설문조사
4세에서 99세 사이의 연령을 가진 여성 144명과 남성 117명으로 구성된 총 261명의 참가자가 연구에 등록되었습니다. 피험자의 평균 연령은 48.30세± 17.61세였다. 미성년자(0-17세) 17명, 성인 202명(18-64세), 노인 42명(>64세)이 참가자였다. 설문지 결과는 표 1에 나와 있습니다. 피험자의 대다수(90.8%)는 헬리코박터 파일로리 선별 ?...

토론

헬리코박터 파일로리균은 전 세계적으로 가장 널리 퍼져 있는 세균 감염 중 하나이다¹⁵. 설문지 결과에 따르면 인구의 55.2%는 헬리코박터 파일로리균에 대한 인식이 부족한 반면, 90.8%는 헬리코박터 파일로리 선별 검사가 필요하다고 답했다. 이러한 결과는 경제적으로 취약한 외딴 지역에서 헬리코박터 파일로리 선별 프로그램...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA extraction kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	None
H. pylori fecal antigen detection kit	Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd	20213401126	None
H. pylori nucleic acid detection kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	None
Real-time fluorescence quantitative PCR	Shanghai Hongshi medical treatment technology co., ltd	20183221659	None
Statistical Product and Service Solutions	IBM company	None	None