Schneller Nachweis des fäkalen Antigens einer Helicobacter pylori-Infektion basierend auf der Doppelantikörper-Sandwich-Nachweistechnologie

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde eine Sandwich-Detektionstechnik auf Basis von Doppelantikörpern für den schnellen Nachweis von fäkalen Antigenen, die mit Helicobacter pylori infiziert sind, entwickelt.

Zusammenfassung

Helicobacter pylori kann in der Magenschleimhaut parasitär sein, was nach einer Infektion eine Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen verursachen kann und eng mit Gastritis, Magengeschwüren und Magenkrebs verwandt ist. Die hohe Prävalenz von H. pylori-Infektionen in Regionen mit schlechter medizinischer Infrastruktur und unzureichenden sanitären Einrichtungen stellt nach wie vor ein erhebliches Problem für die öffentliche Gesundheit dar. Daher ist die Entwicklung schneller, einfacher und kostengünstiger Screening-Methoden für den Nachweis von H. pylori in ressourcenbegrenzten Umgebungen von größter Bedeutung.

In dieser Studie führten wir ein gemeindebasiertes Screening im Dorf Shitan in der Provinz Guangdong durch, einem abgelegenen und unterentwickelten Gebiet mit einer ständigen Bevölkerung von etwa 300 Einwohnern mit allgemein niedrigem Bildungsniveau. Wir verwendeten einen Doppelantikörper-Sandwich-Assay für den Nachweis von h. pylori fäkalem Antigen, eine Methode, die aufgrund ihrer potenziellen Anwendbarkeit in ressourcenarmen Umgebungen ausgewählt wurde. Insgesamt wurden 261 Teilnehmer aus dem Dorf eingeschrieben, und ihre Stuhlproben wurden mit dieser Technik analysiert. Zur vergleichenden Validierung wurden dieselben Proben einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Analyse unterzogen. Verglichen mit den qPCR-Ergebnissen betrugen die Sensitivität und Spezifität des Nachweises von H. pylori-Antigen im Kot 60,24 % bzw. 80,08 %. Die Ergebnisse zeigten eine starke Übereinstimmung zwischen der Methode des fäkalen Antigen-Nachweises und der qPCR (Kappa = 0,630). In dieser Studie wurden die Prinzipien, Verfahren, Methoden und klinischen Anwendungen des fäkalen Antigennachweises bei H. pylori-Infektionen systematisch aufgeklärt, mit dem Ziel, die latexbasierte Doppelantikörper-Sandwich-Technologie zu erforschen und neue Strategien und praktische Richtlinien für ihre Hilfsdiagnose zu etablieren.

Einleitung

Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) ist ein mikroaerophiles, spiralförmiges, gramnegatives Bakterium¹. Aufgrund seiner Fähigkeit, den menschlichen Magen zu besiedeln und chronisch zu infizieren², wurde dieser Erreger als ein wichtiger ätiologischer Faktor bei der Entwicklung des Adenokarzinoms des Magens identifiziert ^3,4. Im Jahr 2015 litten ~4,4 Milliarden Menschen auf der Welt an einer H. pylori-Infektion ⁵. Die Prävalenz von H. pylori-Infektionen weist erhebliche geografische Unterschiede auf, wobei Entwicklungsländer im Vergleich zu Industrieländern signifikant höhere Raten aufweisen. Insbesondere in Ländern mit niedrigem Einkommen und in bestimmten gefährdeten Bevölkerungsgruppen kann die Infektionsrate bis zu 75 % ^erreichen6.

Obwohl traditionelle Nachweismethoden wie die Gastroskopie genau sind, ist ihre Anwendung bei groß angelegten Vorsorgeuntersuchungen und der routinemäßigen Nachsorge aufgrund ihrer Invasivität, der hohen Kosten und der geringen Patientenakzeptanz begrenzt⁷. Daher ist die Suche nach nicht-invasiven, einfachen und schnellen Diagnosemethoden zu einer wichtigen Richtung der modernen klinischen Medizin geworden. Der Hauptzweck einer nicht-invasiven Diagnose von H. pylori besteht darin, ohne endoskopische Untersuchung genau, sicher und bequem zu erkennen, ob der Patient mit H. pylori infiziert ist. Der Harnstoff-Atemtest (UBT), der H. pylori-Stuhlantigentest (FAT)⁸ und der serologische Test⁹ sind beliebte nicht-invasive Techniken.

Unter diesen ist die UBT das am wenigsten einschneidende und genaueste verfügbare Verfahren¹⁰. Die Sensitivität und Spezifität der UBT liegt bei über 95 %¹¹. Unter den verfügbaren nicht-invasiven Diagnosemethoden hat sich die UBT als die genaueste und zuverlässigste erwiesen, wie eine im Irak durchgeführte Validierungsstudie zeigte, kann die UBT aufgrund ihrer höheren Leistung im Vergleich zu anderen Methoden als erste Wahl empfohlen werden¹². UBT hat jedoch auch seine Nachteile, wie z. B. die hohen Kosten und den Bedarf an massenspektrometrischer Analyse, was die Anwendung in entfernten oder ressourcenbegrenzten Umgebungen einschränkt¹³.

Die Entwicklung einer schnellen, nicht-invasiven und kostengünstigen Diagnosemethode zum Nachweis einer H. pylori-Infektion ist dringend erforderlich, insbesondere in Regionen mit begrenzten Ressourcen. In dieser Studie haben wir eine Schnellnachweistechnologie für H. pylori-Stuhlantigen entwickelt, die auf der Doppelantikörper-Sandwich-Detektionstechnologie basiert und das H. pylori-Antigen in Stuhlproben schnell, effektiv und kostengünstig nachweisen kann. Diese Technologie bietet erhebliche Vorteile, darunter Erschwinglichkeit, Nicht-Invasivität, Benutzerfreundlichkeit und Anpassungsfähigkeit an abgelegene Gebiete. Wir gehen davon aus, dass die Doppelantikörper-Sandwich-Methode zum Nachweis des stuhlen Antigens von H. pylori eine Sensitivität und Spezifität aufweist, die mit der qPCR vergleichbar ist, was sie als brauchbares Werkzeug für die nicht-invasive klinische Diagnose positioniert.

Wir haben die Prinzipien, Verfahren, methodischen Stärken und die klinische Anwendbarkeit des fäkalen Antigennachweises bei H. pylori-Infektionen umfassend detailliert beschrieben. Um die Praktikabilität zu validieren, führten wir eine epidemiologische Untersuchung und ein Screening im Dorf Shitan in der Stadt Qingyuan in der Provinz Guangdong in China durch, einem abgelegenen und unterentwickelten Gebiet mit einer ständigen Bevölkerung von etwa 400 Einwohnern und begrenztem Bildungsniveau. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die hier entwickelte Schnellnachweistechnologie des H. pylori-Antigens im Kot innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen werden kann. Es wird hervorgehoben, dass der schnelle Nachweis des H. pylori-Antigens im Kot ein potenzielles und vielversprechendes Instrument für die schnelle und zuverlässige Diagnose einer H. pylori-Infektion in abgelegenen und rückständigen Gebieten ist.

Protokoll

Diese Querschnittsstudie wurde von der Ethikkommission des Volkskrankenhauses der Provinz Guangdong genehmigt (Zulassungsnummer: KY2024-445-01), und die persönlichen Daten aller Studienteilnehmer wurden während der Studie streng vertraulich behandelt. Alle Teilnehmer unterschrieben vor den Experimenten eine schriftliche Einverständniserklärung. Die Bewohner des Dorfes Shitan in der Stadt Qingyuan in der Provinz Guangdong wurden im Jahr 2024 als Versuchspersonen ausgewählt, und es gab keine Einschränkungen hinsichtlich Alter und Geschlecht. Der unten beschriebene Doppelantikörper-Sandwich-Assay (ein qualitatives Experiment) wurde von medizinischem und technischem Fachpersonal gemäß den Anweisungen durchgeführt. Für diese Studie wurde die gesamte ständige Bevölkerung des Dorfes ausgewählt, unabhängig davon, ob sie gesund war oder Symptome oder bestehende Krankheiten im Zusammenhang mit Magen-Darm-Erkrankungen hatte.

1. Auswahl des Patienten

1. Patienten sind auszuschließen, wenn sie in den letzten 1 Monat Protonenpumpenhemmer oder Wismut,_{H2-Rezeptorblocker} oder Antibiotika eingenommen haben.
2. Bitten Sie alle Teilnehmer, den Fragebogen anonym auszufüllen. Der Inhalt des Fragebogens umfasst fünf Fragen: Essen Sie regelmäßig drei Mahlzeiten? Trinken Sie Alkohol? Kennen Sie H. pylori? Halten Sie es für notwendig, eine H . pylori-Inspektion durchzuführen? Verstehen Sie die nachteiligen Folgen einer H. pylori-Infektion ?

2. Verfahren zum Nachweis von Antigen-Infektionen im Stuhl

HINWEIS: Der Algorithmus für H . pylori-Stuhlantigentests wurde entwickelt, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse unter Berücksichtigung von Einfachheit und Hygiene zu gewährleisten. Der gesamte Prozess ist in fünf Schritte unterteilt: Probenentnahme, Probenverarbeitung, Probenlagerung, Detektion und Ergebnisinterpretation. Das Arbeitsablaufdiagramm und das schematische Diagramm der Probendetektion sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt.

1. Musterkollektion
   HINWEIS: Für die Probenentnahme sollten H . pylori-Antigen-spezifische Behälter verwendet werden. Die Proben sollten nicht mit Wasser, Urin, Desinfektionsmitteln und Abwasser vermischt werden.
   1. Entfernen Sie nach Beendigung des Stuhlgangs den oberen Deckel des Spezialbehälters, um den Probenahmestab herauszunehmen.
   2. Führen Sie den Probenahmestab kontinuierlich in fünf verschiedene Positionen des Hockers für die Probenahme ein und achten Sie darauf, dass das Gewindeende des Probenahmestabs vollständig in den Hocker eingeführt ist.
   3. Führen Sie den Probenahmestab wieder in das Reagenzröhrchen ein, nachdem die Probenahme abgeschlossen ist. Das Probenvolumen beträgt insgesamt ~5-50 mg.
2. Probenaufbereitung
   1. Schütteln Sie das Reagenzröhrchen ~10 s lang von einer Seite zur anderen, um die Stuhlprobe gründlich mit dem Verdünnungsmittel zu mischen (Hauptbestandteile: Ethylendiamin, Tetraessigsäure, Tetranatriumhydrat 0,018 g/ml und Natriumchlorid 0,01 g/ml).
3. Lagerung von Proben
   1. Testen Sie die Proben so schnell wie möglich nach der Probenahme; Lagern Sie sie bei Raumtemperatur nicht länger als 6 h und unter gekühlten Bedingungen (nicht länger als 72 h bei 2-8 °C und nicht länger als 6 Monate eingefroren bei -25 °C bis -15 °C), falls erforderlich, um den Antigenabbau und die mikrobielle Aktivität zu verlangsamen.
      HINWEIS: Proben können wiederholt eingefroren und bis zu 3x aufgetaut werden, und sowohl gekühlte als auch gefrorene Proben sollten vor dem Test wieder auf Raumtemperatur gebracht werden.
4. Nachweis von Proben
   1. Öffnen Sie die weiße Abdeckung auf der Abdeckung des Reagenzröhrchens und halten Sie das Reagenzröhrchen aufrecht.
   2. Drücken Sie den Deckel bis zum tiefsten Punkt nach unten, so dass die Probe auf der Testkarte durch den Nachweisbereich (T) und den Qualitätskontrollbereich (C) fließt, die mit dem Maus-Anti-Hp-Antikörper beschichtet sind.
5. Interpretation der Ergebnisse
   1. Warten Sie 10-20 Minuten, damit jedes H. pylori-Antigen in der Probe, wenn es an den Antikörper gebunden ist, im Nachweisbereich eine makroskopische chromogene Reaktion eingeht. Diese wird in der Regel als rote oder violette Linie angezeigt, die sich von der Linie im Bereich der Qualitätskontrolle abhebt.
   2. Das Vorhandensein oder Fehlen der Farbreaktion und die Tiefe der Farbe hängen mit der Konzentration des H. pylori-Antigens in der Probe zusammen. Vergleichen Sie die Farbkarten, um die Ergebnisse schnell und genau zu interpretieren (siehe Abbildung 3).

3. DNA-Extraktion

1. Geben Sie eine angemessene Menge Kot in ein Reagenzglas, fügen Sie PBS-Lösung hinzu und mischen Sie es gründlich durch Schütteln. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 12.000 × g für 5-10 min und sammeln Sie dann vorsichtig 200 μl des Überstands für die weitere Extraktion.
2. Bereiten Sie basierend auf der Anzahl der Proben eine gleiche Anzahl von 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen vor. Geben Sie nacheinander 20 μl Proteinase K (20 mg/ml), 10 μl magnetische Kügelchen, 200 μl des Probenüberstands und 200 μl Lysepuffer A. Mischen Sie gründlich, indem Sie die Röhrchen umdrehen, und inkubieren Sie dann 10 Minuten lang in einem Metallbad bei 55 °C.
3. Nachdem die Pyrolyse abgeschlossen ist, setzen Sie das Zentrifugenröhrchen auf den Magnetrahmen, lassen Sie es stehen und lassen Sie die Adsorption an den Kügelchen 1 Minute lang stattfinden. Nachdem die Flüssigkeit im Röhrchen vollständig geklärt ist, entsorgen Sie den Überstand und versuchen Sie, die magnetischen Kügelchen nicht zu stören.
4. Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Magnetgestell und legen Sie sie auf ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchengestell. Geben Sie mit einer Pipette 500 μl Waschpuffer E in jedes Röhrchen, mischen Sie es 1 Minute lang gründlich und legen Sie die Röhrchen dann wieder in das Magnetgestell. Lassen Sie die Röhrchen 1 Minute stehen, entsorgen Sie den Überstand nach der Klärung und vermeiden Sie das Ansaugen der Magnetkügelchen.
5. Wiederholen Sie den Waschvorgang, indem Sie 500 μl Waschpuffer W2 in jedes Röhrchen geben. 1 Minute gründlich mischen, die Röhrchen auf das Magnetgestell legen und 1 Minute ziehen lassen. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, nachdem die Lösung geklärt ist, und stellen Sie sicher, dass die magnetischen Kügelchen ungestört bleiben.
6. 100 μl Eluent zugeben, mischen und 5 Minuten lang bei 55 °C inkubieren.
7. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell und lassen Sie sie 2 Minuten stehen. Sobald die Lösung geklärt ist, übertragen Sie die eluierte Nukleinsäure vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen, um ein Ansaugen der magnetischen Kügelchen zu vermeiden.
8. Die Reinheit der extrahierten DNA wird durch Messung der Extinktion bei 260 nm (A₂₆₀) und 280 nm (A₂₈₀) bewertet. Berechnen Sie das Verhältnis A₂₆₀/A₂₈₀ , das idealerweise größer als 1,8 für hochreine DNA sein sollte.

4. qPCR zum Nachweis von H. pylori und Resistenz gegen Antibiotika

HINWEIS: Wir führten eine qPCR zum Nachweis einer H. pylori-Infektion durch, indem wir das Harnstoff-Gen amplifizierten. Bei allen Produkten zur negativen Qualitätskontrolle handelt es sich um steriles, gereinigtes Wasser. Das positive Qualitätskontrollprodukt im H. pylori-Nukleinsäure-Nachweiskit sind inaktivierte H. pylori-Standardkügelchen (ATCC 43504). Ein C_T ≤ 30 mit einer typischen S-förmigen Kurve wird als positiv angesehen.

1. Entsprechend der Anzahl der zu testenden Proben nehmen Sie das gefriergetrocknete Präparat von H. pylori aus dem Kit und drehen Sie es schnell, um das gefriergetrocknete Pulver am Boden des Röhrchens zu halten.
2. Öffnen Sie vorsichtig den Deckel der gefriergetrockneten Zubereitung; Entnahme der Nukleinsäure der zu testenden Probe; 25 μl der Nukleinsäure der Probe in das gefriergetrocknete Präparat geben; und decken Sie die Tube fest ab.
3. Schütteln und mischen Sie das PCR-Reagenz gleichmäßig für 8-10 s und drehen Sie es dann schnell für 3-5 s.
4. Bereiten Sie für jede Probe auf einer 32-Well-Platte 25 μl des PCR-Reaktionsgemisches (gefriergetrocknetes Pulver [enthält das Taq-Enzym (5 U/μL), Desoxyribonukleosidtriphosphat (2,5 mmol/L), UNG-Enzym (2 U/μL), HarnstoffA-Vorwärts - (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') und Rückwärtsprimer (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') (40 μmol/L)]) und 25 μL (2,5 μg) der extrahierten DNA vor.
5. Führen Sie die 32-Well-Platten-qPCR-Platine auf der qPCR-Maschine aus. Programmieren Sie den Thermocycler: 42 °C und 95 °C (beide für einen Zyklus) für jeweils 2 Minuten; 95 °C für 10 s und 65 °C für 45 s (zwei Stufen sind ein Zyklus) für 10x; 95 °C für 10 s und bei 58 °C für 45 s (zwei Stufen sind ein Zyklus) für 35 Zyklen.
6. Analysieren Sie die Daten mit einer speziellen Software für die qPCR und lassen Sie das Gerät automatisch Baseline-Schwellenwerte auswählen.

5. Statistische Analyse

1. Verwenden Sie den Chi-Quadrat-Test, um die experimentellen Daten zu analysieren, um die Konsistenz zwischen dieser Methode und den qPCR-Ergebnissen zu bewerten und die Positivrate dieses Technologie-Screenings mit den Positivratendaten der H. pylori-Infektion auf einer breiteren Skala (z. B. landesweit) zu vergleichen. Betrachten Sie Unterschiede bei P < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Fragebogen-Befragung
Insgesamt wurden 261 Teilnehmer in die Studie aufgenommen, darunter 144 Frauen und 117 Männer im Alter von 4 bis 99 Jahren. Das Durchschnittsalter der Probanden lag bei 48,30 ± 17,61 Jahren. Es nahmen 17 Minderjährige (0-17 Jahre), 202 Erwachsene (18-64 Jahre) und 42 ältere Teilnehmer (>64 Jahre) teil. Die Ergebnisse des Fragebogens sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Mehrheit (90,8%) der Probanden hielt es für notwendig, ein ...

Diskussion

H. pylori stellt eine der weltweit am weitesten verbreiteten bakteriellen Infektionen dar¹⁵. Die Ergebnisse des Fragebogens zeigten, dass 55,2 % der Bevölkerung kein Bewusstsein für H. pylori hatten, während 90,8 % der Meinung waren, dass ein H. pylori-Screening notwendig ist. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Durchführung von H. pylori-Screening-Programmen in wirtschaftlich benachteiligten und abgelegenen Ge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA extraction kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	None
H. pylori fecal antigen detection kit	Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd	20213401126	None
H. pylori nucleic acid detection kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	None
Real-time fluorescence quantitative PCR	Shanghai Hongshi medical treatment technology co., ltd	20183221659	None
Statistical Product and Service Solutions	IBM company	None	None