ダブル抗体サンドイッチ検出技術による ヘリコバクター・ピロリ 菌感染の糞便抗原の迅速検出

要約

本研究では、 ヘリコバクター・ピロリ菌に感染した糞便抗原を迅速に検出するために、二重抗体に基づくサンドイッチ検出技術を開発しました。

要約

ヘリコバクター・ピロリ は胃粘膜に寄生する可能性があり、感染後に一連の胃腸疾患を引き起こす可能性があり、胃炎、胃潰瘍、胃がんと密接に関連しています。医療インフラが不十分で衛生状態が不十分な地域での ピロリ菌 感染の有病率が高いことは、依然として公衆衛生上の重大な懸念事項です。したがって、リソースが限られている環境下での ピロリ菌 検出のための迅速、簡便、かつ費用対効果の高いスクリーニング法の開発は、最も重要です。

本研究では、広東省市四潭村において、約300人の定住人口が住み、一般的に学歴が低いという僻地・低開発地域において、コミュニティベースのスクリーニングを実施した。 私たちは、ピロリ菌 の糞便抗原の検出にダブル抗体サンドイッチアッセイを採用しましたが、これは低リソース環境での適用性を考慮して選択された方法です。村から合計261人の参加者が登録され、この手法を使用して彼らの糞便サンプルが分析されました。比較検証のために、同じサンプルを定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析にかけました。qPCRの結果と比較して、糞便中の ピロリ菌 抗原の検出感度と特異性は60.24%と80.08%でした。その結果、糞便抗原検出法とqPCR(Kappa = 0.630 )との間に強い一致が示されました。この研究では、 ピロリ菌 感染症に対する糞便抗原検出の原理、手順、方法論、および臨床応用を体系的に解明し、ラテックスベースの二重抗体サンドイッチ技術を探求し、その補助診断のための新しい戦略と実用的なガイドラインを確立することを目的としています。

概要

ヘリコバクター・ピロリ(H. pylori, Hp)は、微好気性のらせん状のグラム陰性菌¹です。この病原体^は、ヒトの胃にコロニーを形成し、慢性的に感染する能力があるため、胃腺がん^3,4の発症における主要な病因として特定されています。2015年には、世界で~44億人がピロリ菌に感染しました⁵。ピロリ菌の感染率は地理的に大きく異なり、発展途上国は先進国に比べて感染率が著しく高くなっています。特に、低所得国や特定の脆弱な人々の間では、感染率が75%にも達することがあります⁶。

胃内視鏡検査などの従来の検出方法は正確ですが、その侵襲性、高コスト、および患者の受け入れの低さのために、大規模なスクリーニングや日常的なフォローアップへの適用は限られています⁷。したがって、非侵襲的で、シンプルで、迅速な診断方法の探求は、現代の臨床医学研究の重要な方向性となっています。 ピロリ菌 の非侵襲的診断の主な目的は、内視鏡検査なしで患者が ピロリ菌 に感染しているかどうかを正確、安全、かつ便利に検出することです。尿素呼気検査(UBT)、 ピロリ菌 糞便抗原検査(FAT)⁸、および血清学的検査⁹ は、一般的な非侵襲的手法です。

これらの中で、UBTは利用可能な最も侵入的でない最も正確な手順^です10。UBTの感度と特異度は95%¹¹より高いです。利用可能な非侵襲的診断方法の中で、UBTは最も正確で信頼性が高いことが示されており、イラクで実施された検証研究に見られるように、UBTは他の方法と比較して高い性能を発揮するため、最初の選択肢として推奨される可能性があります¹²。しかし、UBTには、コストが高いことや質量分析が必要であることなど、リモートまたはリソースが限られた設定でのアプリケーションを制限するなどの欠点もあります¹³。

ピロリ菌感染を検出するための迅速で非侵襲的で費用対効果の高い診断法の開発は、特に資源が限られている地域で非常に必要とされています。本研究では、糞便中のピロリ菌抗原を迅速、効果的、低コストで検出できるダブル抗体サンドイッチ検出技術を基盤に、ピロリ菌糞便抗原の迅速検出技術を開発しました。このテクノロジーは、手頃な価格、非侵襲性、使いやすさ、遠隔地への適応性など、大きな利点を提供します。私たちは、ピロリ菌の糞便抗原を検出するためのダブル抗体サンドイッチ法は、qPCR に匹敵する感度と特異性を示し、非侵襲的な臨床診断の実行可能なツールとして位置付けられるという仮説を立てています。

私たちは、ピロリ菌感染症に対する糞便抗原検出の原理、手順、方法論的強み、および臨床的適用性を包括的に詳細に説明しました。その実用性を検証するため、中国広東省清遠市において疫学調査とスクリーニングを実施しました。この村は、定住人口が約400人で、学歴も限られています。本研究の結果は、ここで設計された糞便中のピロリ菌抗原の迅速検出技術が20分以内に完了できることを実証しています。糞便中のピロリ菌抗原の迅速な検出は、遠隔地および後方地域におけるピロリ菌感染の迅速で信頼性の高い診断のための潜在的で有望なツールであることが強調されています。

プロトコル

この横断的研究は、広東省人民病院の倫理委員会 (承認番号: KY2024-445-01) によって承認されており、研究中、すべての被験者の個人データは厳重に機密でした。すべての参加者は、実験の前に書面によるインフォームドコンセントに署名しました。2024年に広東省清遠市の市丹村の住民が研究対象として選ばれ、年齢や性別の制限はありませんでした。以下に述べるダブル抗体サンドイッチアッセイ(定性的実験)は、専門の医療関係者および技術者が指示に従って実施しました。この研究には、健康であるか、症状があるか、胃腸疾患に関連する既存の病気があるかに関係なく、村の恒久的な人口全体が選択されました。

1. 患者様の選択

1. 過去 1 か月間にプロトンポンプ阻害剤またはビスマス、H₂ 受容体遮断薬、または抗生物質を使用したことのある患者は除外します。
2. 参加者全員に匿名でアンケートに記入してもらいます。アンケートの内容は5つの質問で構成されています:あなたは定期的に3食を食べていますか?お酒を飲みますか? ピロリ菌をご存知ですか? ピロリ菌 の検査は必要だと思いますか? ピロリ菌 感染の悪影響を理解していますか?

2. 糞便ピロリ菌 感染抗原検出の手順

注: ピロリ菌 の便抗原検査のアルゴリズムは、シンプルさと衛生性を考慮して、結果の精度と信頼性を確保するように設計されています。プロセス全体は、サンプル収集、サンプル処理、サンプル保存、検出、および結果の解釈の5つのステップに分かれています。サンプル検出の作業フローチャートと概略図を 図1 と 図2に示します。

1. サンプルコレクション
   注:サンプル採取には、 ピロリ菌 抗原特異的容器を使用する必要があります。サンプルを水、尿、消毒剤、下水と混合しないでください。
   1. 排便が完了したら、専用容器の上蓋を外してサンプリングロッドを取り出します。
   2. サンプリングロッドをサンプリング用のスツールの5つの異なる位置に連続的に挿入し、サンプリングロッドのネジ端がスツールに完全に挿入されていることを確認します。
   3. サンプリングが完了したら、サンプリングロッドを試薬チューブに戻します。サンプル量は合計で~5-50mgです。
2. サンプル処理
   1. 試薬チューブを左右に ~10 秒間振とうして、糞便サンプルを希釈液 (主成分: エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム水和物 0.018 g/mL および 塩化ナトリウム 0.01 g/mL) で完全に混合します。
3. サンプルの保存
   1. サンプリング後できるだけ早くサンプルをテストします。必要に応じて、室温で6時間以内、冷蔵条件(2〜8°Cで72時間以内、-25°C〜-15°Cで6か月以内の凍結)で保存して、抗原分解と微生物活動を遅らせます。
      注:サンプルは冷凍と解凍を3回まで繰り返し行うことができ、冷蔵サンプルと冷凍サンプルの両方をテスト前に室温に戻す必要があります。
4. サンプル検出
   1. 試薬チューブカバーの白いカバーを開け、試薬チューブを直立させたままにします。
   2. 蓋を最も低い位置まで押し下げて、サンプルがテストカード上を流れ、マウス抗HP抗体でコーティングされた検出エリア(T)と品質管理エリア(C)を通過します。
5. 結果の解釈
   1. サンプル中の ピロリ菌 抗原が抗体に結合している場合、検出領域で巨視的な発色反応を形成するまで、10〜20分待ちます。これは通常、品質管理領域の線とは対照的な赤または紫の線として表示されます。
   2. 色反応の有無、および色の深さは、サンプル中の ピロリ菌 抗原の濃度に関係しています。カラーカードを比較して、結果を迅速かつ正確に解釈します( 図3を参照)。

3. DNA抽出

1. 試験管に適量の糞を入れ、PBS溶液を加え、振ってよく混ぜます。混合物を12,000 × g で5〜10分間遠心分離し、さらに抽出するために200 μLの上清を慎重に収集します。
2. サンプル数に基づいて、同数の1.5 mL遠心分離チューブを調製します。各チューブに、20 μL のプロテイナーゼ K (20 mg/mL)、10 μL の磁気ビーズ、200 μL のサンプル上清、および 200 μL の溶解バッファー A を順次加えます。チューブを反転させて十分に混合し、55 °C の金属浴で 10 分間インキュベートします。
3. 熱分解が完了したら、遠心分離管を磁気フレームに置き、放置して、ビーズに1分間吸着させます。チューブ内の液体が完全に清澄化されたら、上清を捨て、磁気ビーズを乱さないようにしてください。
4. チューブをマグネットラックから取り外し、1.5 mL遠心チューブラックに置きます。ピペットを使用して、各チューブに500 μLの洗浄バッファーEを加え、1分間十分に混合した後、チューブを磁気ラックに戻します。チューブを1分間放置し、清澄化後に上清を捨て、磁気ビーズを吸引しないようにします。
5. 各チューブに500μLの洗浄バッファーW2を加えて、洗浄プロセスを繰り返します。1分間十分に混合し、チューブを磁気ラックに置き、1分間放置します。溶液が明確になったら、上清を慎重に捨て、磁気ビーズが邪魔されないようにします。
6. 溶離液100 μLを加えて混合し、55 °Cで5分間インキュベートします。
7. チューブを磁気ラックに置き、2分間放置します。溶液が明確になったら、溶出した核酸を新しい遠心分離チューブに慎重に移し、磁気ビーズの吸引を避けます。
8. 260 nm(A₂₆₀)および280 nm(A₂₈₀)での吸光度を測定することにより、抽出したDNAの純度を評価します。A₂₆₀/A₂₈₀ 比を計算しますが、これは理想的には高純度DNAの場合は1.8より大きいはずです。

4. ピロリ菌 の検出と抗生物質耐性のためのqPCR

注:尿素A遺伝子を増幅することにより、ピロリ菌感染を検出するためにqPCRを実施しました。すべてのネガティブ品質管理製品は、滅菌された精製水です。H. pylori 核酸検出キットのポジティブ品質管理製品は、不活化 H. ピロリ標準ビーズ (ATCC 43504) です。典型的なS字カーブを持つC_T ≤ 30は正と見なされます。

1. テストするサンプルの数に応じて、 H.ピロリ 凍結乾燥製剤をキットから取り出し、凍結乾燥粉末をチューブの底に保つためにすばやく回転させます。
2. 凍結乾燥製剤の蓋を慎重に開けます。テストするサンプルの核酸を取ります。サンプル核酸を凍結乾燥調製物に25μL加えます。チューブをしっかりと覆います。
3. PCR試薬を8〜10秒間均等に振って混合し、その後、3〜5秒間すばやく回転させます。
4. 32ウェルプレート上の各サンプルについて、PCR反応混合物(凍結乾燥粉末[Taq酵素(5 U/μL)、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(2.5 mmol/L)、UNG酵素(2 U/μL)、 ureA フォワード(5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') およびリバース(5'-CGCCCAATCTCACTTTATTTG-3') プライマー(40 μmol/L)])と抽出したDNAの25 μL(2.5 μg)を調製します。
5. 32ウェルプレートqPCRボードをqPCRマシンで実行します。サーマルサイクラーをプログラムします:42°Cと95°C(どちらも1サイクル)それぞれ2分間。95 °C で 10 秒、65 °C で 45 秒 (2 ステップは 1 サイクル) で 10x;95 °C で 10 秒、58 °C で 45 秒 (2 つのステップで 1 サイクル) で 35 サイクル。
6. qPCR専用のソフトウェアを使用してデータを解析し、装置がベースライン閾値を自動的に選択できるようにします。

5. 統計分析

1. カイ二乗検定を使用して実験データを分析して、この方法とqPCR結果との一貫性を評価し、この技術スクリーニングの陽性率と ピロリ菌 感染の陽性率データをより広いスケール(全国など)で比較します。 P < 0.05で統計的に有意な差を考えます。

結果

アンケート調査
この研究には、4歳から99歳までの女性144人、男性117人の合計261人の参加者が登録されました。被験者の平均年齢は48.30歳±17.61歳でした。未成年者(0〜17歳)が17人、成人(18〜64歳)が202人、高齢者(>64歳)が42人でした。アンケート結果を 表1に示す。被験者の過半数(90.8%)は、 ピロリ菌 のスクリーニングを実施する必要があ...

ディスカッション

ピロリ菌は、世界中で最も蔓延している細菌感染症の1つです¹⁵。アンケート結果から、人口の55.2%がピロリ菌に対する認識が不足している一方で、90.8%がピロリ菌のスクリーニングが必要であると考えていることが明らかになりました。これらの知見は、経済的に恵まれない遠隔地でピロリ菌のスクリーニングプログラム?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA extraction kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	None
H. pylori fecal antigen detection kit	Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd	20213401126	None
H. pylori nucleic acid detection kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	None
Real-time fluorescence quantitative PCR	Shanghai Hongshi medical treatment technology co., ltd	20183221659	None
Statistical Product and Service Solutions	IBM company	None	None