Быстрое обнаружение фекального антигена инфекции Helicobacter pylori на основе технологии Double Intent Sandwich Detection

Резюме

В данном исследовании была разработана методика сэндвич-детекции на основе двойных антител для быстрого обнаружения фекальных антигенов, инфицированных Helicobacter pylori.

Аннотация

Helicobacter pylori может паразитировать на слизистой оболочке желудка, что может вызвать ряд желудочно-кишечных заболеваний после инфекции и тесно связано с гастритом, язвой желудка и раком желудка. Высокая распространенность инфекции H. pylori в регионах с плохой медицинской инфраструктурой и неадекватными санитарными условиями остается серьезной проблемой общественного здравоохранения. Следовательно, разработка быстрых, простых и экономически эффективных методов скрининга для обнаружения H. pylori в условиях ограниченных ресурсов имеет первостепенное значение.

В этом исследовании мы провели скрининг на уровне сообщества в деревне Шитань, провинция Гуандун, отдаленном и слаборазвитом районе, характеризующемся постоянным населением около 300 жителей с низким уровнем образования. Мы использовали двойной сэндвич-анализ антител для обнаружения фекального антигена H. pylori , метод, выбранный из-за его потенциальной применимости в условиях ограниченных ресурсов. Всего в исследование был зачислен 261 участник из села, образцы кала которых были проанализированы с помощью этой методики. Для сравнительной валидации те же образцы были подвергнуты количественному анализу полимеразной цепной реакции (кПЦР). По сравнению с результатами количественной ПЦР чувствительность и специфичность обнаружения антигена H. pylori в кале составили 60,24% и 80,08%. Результаты продемонстрировали сильную связь между методом обнаружения фекального антигена и количественной ПЦР (Kappa = 0,630). В этом исследовании систематически разъяснялись принципы, процедуры, методологии и клинические применения обнаружения фекальных антигенов при инфекции H. pylori , с целью изучения технологии двойного сэндвича антител на основе латекса и разработки новых стратегий и практических рекомендаций для его вспомогательной диагностики.

Введение

Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) — микроаэрофильная, спиралевидная, грамотрицательная бактерия¹. Благодаря своей способности колонизировать и хронически инфицировать желудок человека², этот патоген был идентифицирован как основной этиологический фактор развития аденокарциномы желудка ^3,4. В 2015 году ~4,4 миллиарда человек в мире пострадали от инфекции H. pylori ⁵. Распространенность инфекции H. pylori значительно варьируется в географическом диапазоне, при этом в развивающихся странах показатели значительно выше, чем в развитых странах. Примечательно, что в странах с низким уровнем дохода и среди некоторых уязвимых групп населения уровень инфицирования может достигать 75%⁶.

Несмотря на то, что традиционные методы обнаружения, такие как гастроскопия, являются точными, их применение в крупномасштабном скрининге и рутинном последующем наблюдении ограничено из-за их инвазивности, высокой стоимости и низкой приемлемости со стороны пациентов⁷. Поэтому поиск неинвазивных, простых и быстрых методов диагностики стал важным направлением исследований современной клинической медицины. Основная цель неинвазивной диагностики H. pylori заключается в том, чтобы точно, безопасно и удобно определить, инфицирован ли пациент H. pylori без эндоскопического обследования. Уреа-дыхательный тест (UBT), тест на фекальный антиген H. pylori (FAT)⁸ и серологическое тестирование9 являются популярными неинвазивными методами.

Среди них УБТ является наименее интрузивной и наиболее точной процедурой^{из доступных 10}. Чувствительность и специфичность ОБТ выше 95%¹¹. Среди доступных неинвазивных методов диагностики UBT показал себя наиболее точным и надежным, как видно из валидационного исследования, проведенного в Ираке, UBT может быть рекомендован в качестве первого выбора из-за его более высокой эффективности по сравнению с^{другими методами}. Тем не менее, UBT также имеет свои недостатки, такие как высокая стоимость и необходимость масс-спектрометрического анализа, что ограничивает его применение в удаленных или ограниченных ресурсах^{условиях}.

Разработка быстрого, неинвазивного и экономически эффективного метода диагностики для выявления инфекции H. pylori крайне необходима, особенно в регионах с ограниченными ресурсами. В этом исследовании мы разработали технологию быстрого обнаружения фекального антигена H. pylori на основе технологии обнаружения двойного антитела, которая позволяет быстро, эффективно и с низкими затратами обнаруживать антиген H. pylori в образцах кала. Эта технология обладает значительными преимуществами, включая доступность, неинвазивность, удобство использования и адаптивность к отдаленным районам. Мы предполагаем, что метод двойного сэндвича антител для обнаружения фекального антигена H. pylori продемонстрирует чувствительность и специфичность, сопоставимые с количественной ПЦР, что позиционирует его как жизнеспособный инструмент для неинвазивной клинической диагностики.

Мы всесторонне подробно описали принципы, процедуры, методологические преимущества и клиническую применимость обнаружения фекального антигена при инфекции H. pylori . Чтобы убедиться в его практичности, мы провели эпидемиологическое расследование и скрининг в деревне Шитань, город Цинюань, провинция Гуандун, Китай, которая является отдаленным и слаборазвитым районом с постоянным населением около 400 человек и ограниченным уровнем образования. Наши результаты показывают, что разработанная здесь технология быстрого обнаружения антигена H. pylori в кале может быть завершена в течение 20 минут. Подчеркивается, что быстрое обнаружение антигена H. pylori в кале является потенциальным и перспективным инструментом для быстрой и надежной диагностики инфекции H. pylori в отдаленных и отсталых районах.

протокол

Это перекрестное исследование было одобрено Комитетом по этике Народной больницы провинции Гуандун (номер одобрения: KY2024-445-01), и личные данные всех испытуемых были строго конфиденциальными во время исследования. Перед началом экспериментов все участники подписали письменное информированное согласие. В качестве субъектов исследования в 2024 году были выбраны жители деревни Шитань города Цинъюань провинции Гуандун, при этом ограничений по возрасту и полу не было. Описанный ниже тест на двойной сэндвич антител (качественный эксперимент) проводился профессиональным медицинским и техническим персоналом в соответствии с инструкцией. Для этого исследования было отобрано все постоянное население деревни, независимо от того, были ли они здоровы или имели симптомы или какие-либо существующие заболевания, связанные с желудочно-кишечными заболеваниями.

1. Отбор пациентов

1. Исключите пациентов, если они использовали ингибиторы протонной помпы или висмут, блокаторы Н2-рецепторов или антибиотики в течение предыдущего 1 месяца.
2. Попросите всех участников заполнить анкету анонимно. Содержание анкеты включает в себя пять вопросов: Питаетесь ли вы три раза регулярно? Вы употребляете алкоголь? Знаете ли вы о H. pylori? Считаете ли Вы необходимым проводить обследование на H. pylori ? Понимаете ли вы неблагоприятные последствия заражения H. pylori ?

2. Методика выявления антигена фекальной инфекции H. pylori

ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм тестирования кала на антиген H. pylori был разработан для обеспечения точности и надежности результатов, с учетом простоты и гигиены. Весь процесс разделен на пять этапов: сбор образцов, обработка образцов, хранение образцов, обнаружение и интерпретация результатов. Рабочая технологическая схема и принципиальная схема обнаружения образцов представлены на рисунках 1 и 2.

1. Забор образцов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора образцов следует использовать контейнеры, специфичные для антигена H. pylori . Образцы не должны смешиваться с водой, мочой, дезинфицирующими средствами и сточными водами.
   1. После завершения дефекации снимите верхнюю крышку специальной емкости, чтобы вынуть стержень для отбора проб.
   2. Вставьте стержень для отбора проб непрерывно в пять различных положений табурета для отбора проб, убедившись, что резьбовой конец стержня для отбора проб полностью вставлен в табурет.
   3. Вставьте стержень для отбора проб обратно в пробирку с реагентом после завершения отбора проб; Общий объем образца составляет ~5-50 мг.
2. Обработка образцов
   1. Встряхните пробирку с реагентом из стороны в сторону в течение ~10 с, чтобы тщательно перемешать образец кала в разбавителе (основные ингредиенты: этилендиаминтетрауксусная кислота тетранатрия гидрат 0,018 г/мл и хлорид натрия 0,01 г/мл).
3. Хранение образцов
   1. Протестируйте образцы как можно скорее после отбора проб; хранить их при комнатной температуре не более 6 ч и в охлажденных условиях (не более 72 ч при 2-8 °С и не более 6 месяцев в замороженном виде при температуре от -25 °С до -15 °С) при необходимости замедления деградации антигена и микробной активности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно многократно замораживать и размораживать до 3 раз, при этом как охлажденные, так и замороженные образцы должны быть возвращены к комнатной температуре перед тестированием.
4. Обнаружение образцов
   1. Откройте белую крышку на крышке трубки с реагентом и держите трубку с реагентом в вертикальном положении.
   2. Нажмите на крышку до самой нижней точки, чтобы образец стекал по тестовой карте, проходя через зону обнаружения (T) и зону контроля качества (C), покрытую мышиным антителом anti-Hp.
5. Интерпретация результатов
   1. Подождите 10-20 мин, чтобы любой антиген H. pylori в образце, если он связан с антителом, образовал макроскопическую хромогенную реакцию в зоне обнаружения. Обычно это выглядит как красная или фиолетовая линия, которая контрастирует с линией в области контроля качества.
   2. Наличие или отсутствие цветовой реакции и глубина окраски связаны с концентрацией антигена H. pylori в образце. Сравните цветовые карточки, чтобы быстро и точно интерпретировать результаты (см. рисунок 3).

3. Экстракция ДНК

1. Поместите необходимое количество кала в пробирку, добавьте раствор PBS и тщательно перемешайте, встряхивая. Центрифугируйте смесь при 12 000 × г в течение 5-10 мин, затем тщательно соберите 200 мкл надосадочной жидкости для дальнейшей экстракции.
2. Исходя из количества образцов, подготовьте равное количество пробирок для центрифуги объемом 1,5 мл. В каждую пробирку последовательно добавьте 20 мкл протеинады К (20 мг/мл), 10 мкл магнитных шариков, 200 мкл надосадочной жидкости образца и 200 мкл буфера для лизиса А. Тщательно перемешайте, перевернув пробирки, затем инкубируйте в металлической ванне при 55 °C в течение 10 мин.
3. После завершения пиролиза поместите центрифужную трубку на магнитную раму, дайте ей постоять и дайте адсорбции на шариках в течение 1 минуты. После того как жидкость в пробирке полностью осветлится, выбросьте надосадочную жидкость и старайтесь не тревожить магнитные шарики.
4. Извлеките пробирки из магнитного штатива и поместите их на штатив для центрифужных пробирок объемом 1,5 мл. С помощью пипетки добавьте в каждую пробирку 500 мкл промывочного буфера E, тщательно перемешайте в течение 1 минуты, затем верните пробирки на магнитную решетку. Дайте трубкам постоять 1 минуту, выбросьте надосадочную жидкость после осветления и избегайте аспирации магнитных шариков.
5. Повторите процесс промывки, добавив 500 μL буфера для промывки W2 в каждую пробирку. Тщательно перемешайте в течение 1 минуты, поместите трубки на магнитную решетку и дайте им постоять 1 минуту. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость после того, как раствор прояснит, убедившись, что магнитные шарики остаются нетронутыми.
6. Добавьте 100 μл элюента, перемешайте и инкубируйте при 55 °C в течение 5 минут.
7. Поместите трубки на магнитную решетку и дайте им постоять 2 минуты. Как только раствор прояснит, осторожно перенесите элюированную нуклеиновую кислоту в новую центрифужную трубку, избегая аспирации магнитных шариков.
8. Оцените чистоту извлеченной ДНК, измерив абсорбцию при длинах волн 260 нм (А₂₆₀) и 280 нм (А₂₈₀). Рассчитайте соотношение A₂₆₀/A₂₈₀ , которое в идеале должно быть больше 1,8 для ДНК высокой чистоты.

4. Количественная ПЦР для выявления H. pylori и резистентности к антибиотикам

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы провели кПЦР для выявления инфекции H. pylori путем амплификации гена ureA . Все продукты отрицательного контроля качества – это стерильная, очищенная вода. Положительным продуктом контроля качества в наборе для обнаружения нуклеиновых кислот H. pylori являются инактивированные стандартные гранулы H. pylori (ATCC 43504). _{C T} ≤ 30 с типичной S-образной кривой считается положительным.

1. В зависимости от количества образцов, которые необходимо испытать, достаньте лиофилизированный препарат H. pylori из набора и быстро раскрутите его, чтобы лиофилизированный порошок оставался на дне пробирки.
2. Осторожно откройте крышку сублимированного препарата; взять нуклеиновую кислоту исследуемого образца; добавить 25 мкл образца нуклеиновой кислоты в лиофилизированный препарат; и плотно накройте трубку.
3. Встряхните и равномерно перемешайте реагент ПЦР в течение 8-10 с, а затем быстро раскрутите его в течение 3-5 с.
4. Для каждого образца на 32-луночном планшете приготовьте 25 мкл реакционной смеси ПЦР (лиофилизированный порошок [содержащий фермент Taq (5 Ед/мкл), дезоксирибонуклеозидтрифосфат (2,5 ммоль/л), фермент UNG (2 Ед/мкл), уреА прямой (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') и обратный (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') праймеры (40 моль/л)]), а также 25 мкл (2,5 мкг) экстрагированной ДНК.
5. Запустите 32-луночную планшетную плату для количественной ПЦР на машине для количественной ПЦР. Запрограммируйте термоамплификатор: 42 °C и 95 °C (оба для одного цикла) на 2 мин каждый; 95 °C в течение 10 с и 65 °C в течение 45 с (два шага равны одному циклу) в течение 10 раз; 95 °C в течение 10 с и при 58 °C в течение 45 с (два шага равны одному циклу) в течение 35 циклов.
6. Проанализируйте данные с помощью специального программного обеспечения для количественной ПЦР и позвольте прибору автоматически выбирать базовые пороговые значения.

5. Статистический анализ

1. Используйте критерий хи-квадрат для анализа экспериментальных данных, чтобы оценить согласованность между этим методом и результатами количественной ПЦР и сравнить положительную частоту скрининга этой технологии с положительными данными о частоте инфекции H. pylori в более широком масштабе (например, по всей стране). Рассмотрим различия, статистически значимые при P < 0,05.

Результаты

Анкетный опрос
В общей сложности в исследование был включен 261 участник, в том числе 144 женщины и 117 мужчин, в возрасте от 4 до 99 лет. Средний возраст испытуемых составил 48,30 ± 17,61 лет. В исследовании приняли участие 17 несовершеннолетних (0-17 лет), 202 взрослых (18-64 г?...

Обсуждение

H. pylori представляет собой одну из самых распространенных бактериальных инфекций во всем мире¹⁵. Результаты анкетирования показали, что 55,2% населения не знают о H. pylori, в то время как 90,8% считают, что скрининг H. pylori необходим. Эти результаты подч?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA extraction kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	None
H. pylori fecal antigen detection kit	Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd	20213401126	None
H. pylori nucleic acid detection kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	None
Real-time fluorescence quantitative PCR	Shanghai Hongshi medical treatment technology co., ltd	20183221659	None
Statistical Product and Service Solutions	IBM company	None	None